Obraz1

r

Ćwiczenie 2.

P - FRUKTOFURANOZYDAZA (INWERTAZA) EC 3.2.1.26 -PREPARATYKA ENZYMU Z DROŻDŻY Saccharomyces cereyisiae 1. Wstęp

P - Fruktofuranozydaza należy do grupy hydrolaz rozkładających wiązanie {3-fmkto-furanozydowe; katalizuje hydrolizę sacharozy do glukozy i fruktozy:

sacharoza

glukoza

fruktoza

Rys.l Schemat reakcji katalizowanej przez inw^rertazę.

Bogatym źródłem tego enzymu są komórki drożdży. Enzym jest wykorzystywany przemysłowo do hydrolizy sacharozy (tzw. cukier inwertowany) np. w produkcji czekoladek i twardych cukierków z płynnym nadzieniem .

Generalnie, każda procedura oczyszczania enzymu występującego wewnątrzkomórkowe (jak inwertaza) obejmuje następujące etapy: ekstrakcję enzymu , jego wstępne oczyszczenie oraz dalsze, zróżnicowane (głównie chromatograficzne ) metody oczyszczania jak ilustruje to Schemat 1 (na sąsiedniej stronie):

Izolowanie p - fruktofuranozydazy rozpoczyna się od rozbicia komórek drożdżowych na drodze autolizy lub mechanicznie, przez ucieranie z ziemią okrzemkową i rozpuszczalnikiem (eter, toluen). Białko enzymatyczne ekstrahuje się następnie wodą i oczyszcza częściowo przez wytrącanie acetonem.

Czysty preparat enzymu można uzyskać strącając białka balastowe kwasem pikrynowym, który nie powoduje denaturacji i wytracania p-ffuktofuranozydazy. Inwertazę, która jest głikoproteiną można również oczyścić chromatograficznie na ConA-Sepharose.

Całą procedurę izolacji i oczyszczania należy przeprowadzić w niskiej temperaturze.

Cel ćwiczenia: poznanie prostej metody otrzymywania preparatów enzymatycznych, Otrzymanie preparatu inwertazy niezbędnego do dalszych ćwiczeń

2. Część eksperymentalna

2.1. Odczynniki:

♦    ziemia okrzemkowa (Hyflo Supercel, Cełite )

♦    drożdże piekamiane (dostępne handlowo w sklepach spożywczych)

♦    odczynniki do oznaczania cukrów^r redukujących metodą DNS

♦    0,2 M roztwór sacharozy w 0,05 M buforze octanowym pH 4,7

♦    0,05 M bufor octanowy pH 4,7

♦    odczynnik Bradford do oznaczania białek