16.02.2005 Wykład 1

TEMAT: Rys historyczny rozwoju wiedzy o komórce. Podstawowe techniki stosowane w cytologii i histologii.

1655 - Hooke - skonstruował mikroskop i opisał komórki korka

1674 - Leewenhoek - odkrył pierwotniaki i bakterie (1683)

1833 - Brown - opisał jądro komórkowe

1838 - Schleiden i Schwan - teoria komórkowa (komórka jako składnik tkanek)

1879 - Flemming - opisał chromosomy podczas mitozy

1881 -Cajel - opracował metody technik barwienia komórek nerwowych

1898 - Golgi - opisał aparat Golgiego

1934 - Rousek - pierwszy mikroskop elektronowy

1952 - Palade, Porter, Sjostrand - rozwinęli metody mikroskopii elektronowej

1951 - Robertson - opisał dwuwarstwową strukturę błony komórkowej

MIKROSKOPY

ŚWIETLNE ELEKTRONOWE

Mikroskopy świetlne: (różnią się między sobą kondensorem)

• mikroskopia w polu ciemnym

• mikroskopia w polu jasnym

• mikroskop fluoroscencyjny

• mikroskop polaryzacyjny

• mikroskop kontrastujący fazy

• mikroskop interferencyjny

• mikroskop konfokalny

• mikroskop odwrócony - inwertoskop

Mikroskopy elektronowe:

• mikroskop transmisyjny TEM

• mikroskop wysokowoltażowy

• mikroskop skeninkowy SEM

• mikroskop tunelowy skenujący

• mikroskop rentgenowski

mikroskop fluoroscencyjny

• modyfikacja mikroskopu świetlnego

• za jego pomocą oglądamy preparaty sporządzone przy użyciu odczynników dających efekt fluorescencji

• struktury komórkowe znakuje się np. przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami

mikroskopia w polu ciemnym

• kondensator w szczególny sposób oświetla badany obiekt

• do obiektywu wpadają wyłącznie promienie ugięte na strukturach obiektu, promienie przechodzące przez obiekt a nie ugięte są eliminowane

• struktury rozpraszające światło są widoczne jako jasne twory na ciemnym tle

mikroskop polaryzacyjny

• wykorzystuję się w nim zjawisko istnienia struktur anizotropowych (mają różne współczynniki załamania w zależności od osi, w której przebiega światło)

• mierzy się dwa współczynniki załamania jako opóźnienie przebiegu promieni wolniej biegnących wobec szybszych

• im większa grubość badanego obiektu tym większa różnica

• znajdują się w nim dwie płytki: polaryzator i analizator zbudowane z polaryzującego światło materiału

• polaryzator jest pod kondensorem, a analizator nad obiektywem

mikroskop kontrastujący fazy

• stosowany do badań przeżyciowych komórek np. hodowanych in vitro

• wyposażony w płytkę fazową, która przesuwa fazę światła przechodzącego tak aby w wyniku interferencji z promieniem świetlnym utworzyć obraz kontrastowy przedmiotu fazowego

• w wyniku interferencji powstaje efekt interferencyjny dodatni bądź ujemny

• kontrast fazowy + to są ciemne struktury na jasnym tle

mikroskop interferencyjny

• do mierzenia przesunięcia fazowego światła przechodzącego przez badane struktury

• nakłada się dwie lub więcej wiązek światła

• za pomocą pomiaru współczynnika załamania światła można określić stężenie substancji w danych obszarach komórki, czyli podać suchą masę materii żywej

mikroskop konfokalny

• źródłem światła jest laser, którego cienki promień skenuje, pole po polu, linia po linii, obserwowane pole widzenia

• średnica plamki promienia laserowego to zdolność rozdzielcza mikroskopu, sięga wartości 0,1 μm

• promień lasera tnie materiał na warstwy o ww grubości

• pozwala na uzyskiwanie obrazów w świetle przechodzącym i w świetle odbitym, obrazy te można następnie, za pomocą komputera, dowolnie ze sobą zestawiać

transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)

• występują soczewki magnetyczne

• źródło promieniowania to katoda

• obrazy powstają w wyniku rozpraszania przez dany obiekt wiązki elektronów

• działo elektronowe wytwarza elektrony, które są przyspieszane przez wysokie napięcie, które jest formowane przez uzwojenia soczewek elektromagnetycznych, z drugiej strony jest ekran fluoroscencyjny

• preparat musi znajdować się w próżni i być bardzo cienki

• kontrast uzyskuje się przez nałożenie barwników zawierających metal ciężki, który pochłania lub rozprasza elektrony

• mikroskop daje obraz dwuwymiarowy

mikroskop elektronowy skenujący (SEM)

• cienka wiązka elektronów przemiata linia po linii powierzchnię obiektu badanego

• wybijane z powierzchni wtórne elektrony są zbierane i wzmacniane przez fotopowielacz, a sygnały przeważane są na monitorze

• uzyskiwanie obrazów 3D

Metody i techniki histologiczne:

1. Metody HE (hematoksylina/eozyna)

• hematoksylina - barwnik zasadowy - jądro

• eozyna - barwnik kwaśny - cytoplazma

Metoda histochemiczna - wykrywanie hydrolaz i dehydrogenaz

Immunohistochemia

• do określania lokalizacji białek, kwasów i cukrów, używa się przeciwciał

• z badaną strukturą łączą się określone przeciwciała, które oznakowane zostały fluorochromami

• czasem należy dodać dodatkowo przeciwciało II, które jest połączone z substancją znacznikową i przyłącza się ono do przeciwciała I i dzięki temu są znakowane odpowiednie struktury

• Hodowla tkanek

• umożliwia ocenę zachowań komórek i tkanek pod wpływem różnych substancji

• badania in vitro

• w celu standaryzacji takich badań powstały czyste linie komórkowe

• można uzyskać linie nieśmiertelne przez transformację nowotworową np. przez wprowadzenie wirusa SU40 do genomu komórki

5. Autoradiografia

• właściwości promieniotwórcze pierwiastków można wykorzystać do śledzenia szlaków metabolicznych niektórych makrocząsteczek

• do wykrywania tych radioizotopów służy emulsja fotograficzna

• komórki nie rozróżniają pierwiastków od ich promieniotwórczych izotopów, którymi są znakowane cząsteczki prekursorowe

• do oznakowania prekursorów metabolizmu białek wykorzystuje się aminokwasy, w których jeden z atomów C zostaje zastąpiony promieniotwórczym izotopem, można też zastąpić inne atomy np. siarkę w cysteinie

• jedną z zasad DNA np. tymidynę znakujemy trytem

• znakowane prekursory dodajemy do środowiska hodowlanego komórka przejmuje te prekursowy i wtapia w swój metabolizm

• skrawki mikroskopowe pokrywamy emulsją fotograficzną i zostawiamy na kilka tygodni

• po obróbce fotograficznej obecne w komórce izotopy promieniotwórcze emitują elektrony, które jonizują bromek srebra do srebra metalicznego

• ziarna srebra w naświetlonej emulsji znajdują się nad strukturami komórkowymi, do których komórka wbudowała znakowane prekursory

4

---