Skrining mikroorganizmów przemysłowych.Szacuje się, że spośród mikroorganizmów bytujących w przyrodzie wyodrębnionych i sklasyfikowanych jest zaledwie 1%. Zainteresowanie pozostałymi gatunkami jest ogromne i tak w ciągu ostatnich 10 lat ilość sklasyfikowanych gatunków wzrosła 5x. problemem jest brak metod hodowlanych. Badany jest parametr określany terminem zbiorowości mikroorganizmów polegający na analizie DNA w danym środowisku. Badania te dają możliwość oceny nie tylko liczebności mikroorganizmów w danym środowisku, ale również różnorodności mikroflory. Rozwój metod hodowli pozwolić może na wyodrębnienie i prowadzenie hodowli coraz to większej ilości gatunków. We wszystkich branżach biotechnologii (farmacja, przemysł spożywczy, kosmetyczny, rolnictwo, ochrona środowiska itp.) prowadzi się intensywne badania nad pozyskiwaniem mikroorganizmów o szczególnych właściwościach, które można wykorzystać w większej skali. Najważniejsze jednostki prowadzące tego typu badania to:-Laboratoria uczelniane;-Instytuty badawcze w których są realizowane programy subsydiowane przez rząd;-Laboratoria firmEtapy prac nad pozyskaniem szczepu produkcyjnego 1.Wybór miejsca izolowania.Np. szczepów produkujących a-amylazę pozyskiwać można w zakładach przemysłowych w których surowcem lub produktem jest skrobia ( np. zakłady ziemniaczane, piekarnie, młyny)-szczepów opornych na antybiotyki poszukuje się przede wszystkim w szpitalach, przychodniach lekarskich;-szczepów produkujących antybiotyki w środowisku gdzie bytuje wiele gatunków mikroorganizmów (gleba, przemysł spożywczy- wielobranżowy, odpady w przemyśle mięsnym);-szczepy produkujące lipazy w zakładach tłuszczowych i mięsnych;-szczepy rozkładające ksenobiotyki izoluje się ze środowisk zanieczyszczonych tymi substancjami 2.Przygotowanie próby do rozsiewu Zebranie mikroflory na filtrze mikrobiologicznym o śr. por 0,2μ. Działanie w celu zagęszczenia próby.Dla prób zagęszczonych stosuje się stosuje się rozcieńczenie ok. 1000- 10000x.Ograniczona biodostępność- stosuje się Tween- środek powierzchniowo- czynny Biofilm- SDS- środek powierzchniowo- czynny dodawany celem zniszczenia biofilmu.
3.Wytrząsanie 1.wybór grupy mikroorganizmów (bakterie, grzyby, mikobakterie, drożdże).Mikroorganizmy produkujące enzymy o optimum pH bliskim obojętnemu szukamy wśród bakterii, o pH kwaśnym wśród grzybów. Lipaz rozkładających tłuszcze zwierzęce wśród Bakterii, analogicznie dla proteinaz obojętne i alkaliczne wśród bakterii, kwaśne u grzybów, pektynolityczne u grzybów.W przypadku poszukiwania bakterii najczęściej przygotowuje się podłoża zawierające organiczne źródło azotu np.pepton, kazeina czy białko sojowe. Do podłoża dodaje się również określony substrat, który wspomagał będzie wzrost (czy ujawnienie się) poszukiwanej przez nas kultury. Substytuty np.skrobia, określony ksenobiotyk.2.Posiew mieszaniny komórek na przygotowane podłoża (hodowla płynna, płytki) PRODUKCJA LIZYNY, uwarunkowania Cor.g. do nadprodukcji tego aminokwasu. (ksero)Lizyna zsyntetyzowana jest z kw. L- asparaginowego w 6 etapach przemian enzymatycznych. Pierwszym enzymem który uczestniczy w biosyntezie lizyny jest kinaza asparaginowa. Enzym ten przekształca kw. L- asparaginowy do B-semialdehydu kw. asparaginowego.Aktywność kinazy jest kontrolowana przez równoczesną obecność 2 aminokwasów: lizyny i treoniny. Semialdehyd jest substratem nie tylko dla lizyny, ale także dla treoniny, metioniny, izoleucyny.Semialdehyd jest przekształcany do lizyny za pomocą syntazy dihydrodipikolinianowej do lizyny, zaś z drugiej do homoseryy za pomocą dehydrogenazy homoserynowej. Aktywność dehydrogenazy u dzikich szczepów jest kilkanaście razy wyższa niż aktywność syntazy. Z tego względu uprzywilejowanym kierunkiem metabolizmu semialdehydu jest biosynteza aminokwasów innych niż lizyna. Aktywność dehydrogenazy homoserynowej jest hamowana przez treoninę, zaś jej synteza blokowana przez nadmiar metioniny. Pozostałe enzymy szlaku biosyntezy lizyny nie są kontrolowane ani na poziomie ich aktywności, ani na poziomie ich syntezy. Lizyna nagromadzająca się we wnętrzu kmórki jest po osiągnięciu wysokiego stężenia transportowana do otaczającego komórkę środowiska. Transport lizyny jest transportem aktywnym ( za pomocą nośnika białkowego).Bakterie C.g. dysponują dwiema drogami metabolizmu cukrów- glikolizą i cyklem pentozowym. Posiadają one rozwinięty system reakcji anaplerotycznych, które uzupełniają cykl Krebsa w szczawiooctan wykorzystywany do biosyntezy lizyny. Kluczową rolę w biosyntezie szczawiooctanu i dalej lizyny odgrywają dwa enzymy anaplerotyczne: karboksylaza pirogronianowa oraz karboksykinaza fosfoenolopirogronianowa. Te dwa enzymy tworzą cykl w którym pirogronian ulega karboksylacji do szczawiooctanu, szczawiooctan jest dekarboksylowany do fosfoenolopirogronianu, a fosfoenolopirogronian jest przekształcany do pirogronianu przez kinazę pirogronianową. Duże ilości pirogronianu do syntezy lizyny dostarcza glikoliza. Duże ilości NADPH pochodzą z cyklu pentozowego i systemu fosfotransferowego. ATP potrzebne do syntezy lizyny pochodzi z fosforylacji oksydacyjnej. Bakterie C.g. dysponują prostym, elastycznym systemem kontroli syntezy lizyny. Nie posiadają one izoenzymów i związanych z tym dodatkowym mechanizmem regulacji. Bakterie te nie posiadają enzymów degradujących lizynę.Do biosyntezy lizyny stosowane są 3 rodzaje mutantów 1.Auksotroficzne- wymagające do wzrostu homosyryny lub metioniny z treoniną. Mają one zablokowaną dehydrogenazę homoserynową. Metioninę z treoniną dodaje się do podłoża w ilościach suboptymalnych dla wzrostu szczeou tjzn.w ilościach zapewniających wyłącznie wzrost biomasy. Nadmiar treoniny w podłożu wraz z tworzącą się lizyną mógłby hamować inhibicję aktywności kinazy asparaginowej.2.Regulatorowe- posiadające kinazę asparaginową nie wrażliwą na hamujące działanie lizyny z treoniną. W podłożu hodowlanym tych mutantów musi być inhibitor aktywności dehydrogenazy homoserynowej przez cały okres trwania fermentacji. Inhibitorem tym jest treonina, którą trzeba dodawać do podłoża w ilości większej niż stężenie suboptymalne tego aminokwasu.3.Auksotroficzno- regulatorowe. Aktualnie dominują w przemyśle.Mutanty Cor.g. mogą syntetyzować 0,4 do 0,55 moli lizyny z 1 mola glukozy.Technologia produkcji lizynyProces biosyntezy lizyny jest zawsze dwu fazowy. W 1.fazie zachodzi wzrost szczepu, natomiast synteza lizyny jest ograniczona. W 2.fazie nie obserwuje się praktycznie wzrostu komórek, natomiast biosynteza lizyny zachodzi z dużą intensywnością.Procesy biosyntezy lizyny prowadzone są w bioreaktorach o pojemności 50-500m3. inokulum namnażane jest zawsze w kilku etapach. Źródłami węgla najczęściej są: melasa z trzciny cukrowej (Ameryka Płd. Chiny), melasa buraczana (Europa) lub hydrolizaty skrobiowe (Ameryka Płn. Azja), rzadziej sacharoza. Źródłami nieorganicznego N są jony amonowe, zaś organicznego hydrolizaty białek roślinnych. Dominującą metodą produkcji lizyny jest fermentacja okresowa z zasilaniem pożywką. Pożywka oprócz cukru zawiera zazwyczaj jony amonowe (siarczan amonu). Wydajność syntezy lizyny w procesach okresowych z ciągłym zasilaniem pożywką przekracza zazwyczaj 100g/litr i może dochodzić do 150 a nawet 170.Lizynę nagromadzoną w podłożu produkcyjnym wyodrębnia się różnymi metodami:1.sposób polega na izolowaniu lizyny metodą chromatografii jono- wymiennej, zatężaniu i krystalizacji. Uzyskany tą metodą krystaliczny preparat zawiera 98,5% monochlorowodorku L-lizyny.
2.sposób obejmuje oddzielenie biomasy i innych części stałych i zatężenie klarownego płynu pohodowlanego i w jego wyniku powstaje alkaliczny koncentrat zawierający ok.50% L-lizyny.3.metoda jest najbardziej efektywna, ponieważ pozwala zminimalizować straty aminokwasu oraz ilość ścieków. Wykorzystuje ona bezpośrednie suszenie rozpryskowe całego podłoża fermentacyjnego (razem z biomasą), po której następuje granulacja. Otrzymany granulat zawiera ok.50% siarczanu L-lizyny. Podstawową metodą wyizolowania kultury danego mikroorg.z mieszaniny mikroorg. jest rozsiew na płytki z takiego rozc.by na płytce wyrosły pojedyncze kolonie. Takie kolonie mogą być odsiewane na skosy i przy zachowaniu odpowiedniej czystości mikrobiologicznej traktowane jako monokultury. W celu sprawdzenia aktywności metabolicznej tych monokultur prowadzi się szereg zaplanowanych hodowli w podłożach płynnych o zróżnicowanym składzie opracowane pod kątem planowanych badań. Zarówno próby dotyczące izolowania jak i selekcji wyodrebnionych monokultur pod kątem wybranych uzdolnień metabolicznych, określa się terminem skrining mikroorg. termin ten funkcjonuje od kilkunastu lat w polskiej literaturze naukowej, w dziedzinie medycyny, epidemiologii, chemii, a w biotechnologii pojęcie skriningu mikroorg.przemysłowych definiowane jest jako kompleksowe postępowanie obejmujące zespół selektywnych zabiegów mających na celu wykrycie i wyizolowanie spośród dużej grupy mikroorg.tylko tych, które są celem badań i określenie ich przydatności do danego bioprocesu.W biotechnologii za skrining mikroorg.mamy do czynienia praktycznie przez cały czas. Na początku dotyczy on wyboru odpowiedniej monokultury, w drugim etapie wyboru spośród populacji poddanej zabiegom doskonalenia tylko tych komórek, w których zaszły pozytywne, trwałe zmiany genetyczne. W trzeciej fazie,gdy szczep jest stosowany w określonej technologii i musimy kontrolować jego „kondycję metaboliczną”. 1.wybór szczepu 2.doskonalenie szczepu 3.sprawdzenie kondycji szczepu podczas jego wykorzystania w przemyśle.Ad. 2Najważniejszym etapem skriningu mikroorg.jest wybór klonu (wariantu, mutanta, komórki) z populacji poddanej zabiegowi doskonalenia. Stosuje się dwa zasadnicze rodzaje zabiegów w celu poprawy cech technologicznych mikroorg.:a)mutagenizacjeb)rekombinacja genetyczna. Cel obu technik jest identyczny- uzyskanie trwałych, korzystnych zmian w genomie komórki. Obie metody są stosowane, ponieważ cenne mutanty są wykorzystywane w zabiegach rekombinacji genetycznej.Dla obu metod doskonalenia charakterystycznym jest, to że zabiegom tym poddawana jest duża ilość komórek rzędu 105, a ilość mutantów czy rekombinatów powstających w wyniku tego zabiegu jest kilka- kilkanaście, czasem kilkadziesiąt. Stąd bardzo ważnym zadaniem jest opracowanie metod szybkiego i taniego zidentyfikowania mutanatów, rekombinatów pozytywnych.
Jednym z najważniejszych etapów mutagenizcji jest stworzenie odpowiednich warunków zmutowanym komórkom, by uaktywnić mechanizmy naprawcze w komórkach. Etap ten decyduje o pozytywnych efektach mutagenizacji. W przypadku stosowania mutantów chemicznych np.nitozoguanidyna komórki po mutagenizacji przenosi się natychmiast do świeżego podłoża odżywczego i prowadzi hodowlę mieszaniny komórek po mutagenizacji w ciągu przynajmniej kilkunastu godzin. W tym czasie wyeliminowane zostaną komórki, które zatraciły zdolność namnażania, a pozostaną te o zmienionym genotypie, które już zaczęły się rozmnażać i komórki o genotypie nie zmienionym. W przypadku stosowania mutantów fizycznych np. promieniowanie UV komórki zaraz po ekspozycji promieniami umieszcza się w ciemności, ponieważ światło dzienne powoduje zniesienie uszkodzeń wywołanych prom.UV, w ciemności natomiast uruchamiane są mechanizmy naprawcze wewnątrzkomórkowe, które to mechanizmy mogą spowodować trwałe zmiany w genomie. Po kilkugodzinnym przetrzymaniu komórek w ciemności można wykonać hodowlę wzbogacającą, taką jak przystosowanie mutagenów chemicznych(jak wyżej).Skrining populacji poddanej zabiegom doskonalenia .Cel, identyfikacja wariantów o zmienionym genomie.Podział metod skriningu:1.skrining losowy 2.skrining racjonalny.Podstawową formą skriningu losowego jest typowy rozsiew zmutowanej populacji na płytki i losowy wybór kolonii. Początkowo te rozsiewy prowadzono na typowych podłożach wzrostowych, co czyniło tę procedurę mało efektywną i w literaturze określana jest jako poszukiwanie igły w stogu siana. W ramach losowego skriningu zwraca się uwagę na warianty morfologiczne- na kolonie o zmienionym wyglądzie. Liczne obserwacje wskazują, że klony o zmienionej morfologii mogą być mutantami o zwiększonej aktywności (produktywności) lub mogą produkować dany związek z dużą wydajnością w zmienionych warunkach np. w tańszym podłożu. Def. losowego skriningu- jest to metoda badań w populacji w warunkach typowych dla jej wzrostu i biosyntezy określonego metabolitu. Stosuje się ją tylko wtedy, gdy brak jest kryteriów możliwości zróżnicowania populacji. Skrining losowy niesie ze sobą wysokie prawdopodobieństwo zgubienia pozytywnych wariantów. Przy braku szczęścia ta forma skriningu uważana jest za nieefektywną. Istnieje jednak kilka możliwości usprawnienia tych badań. Pierwsze- przy zastosowaniu odpowiednich substratów; 2-poprzez dodanie odpowiednich wskaźników. Jedne i drugie mają jeden cel- by spowodować ujawnienie się w podłożu stref różnicujących poszczególne kolonie. I tak- wybierając klony produkujące zwiększone ilości a-amylazy można użyć substrat starch-bluę, starch azure. Szczapy produkujące dekstranozę można rozsiać na podłoże z substratem blue dekstran. Szczepy produkujące enzymy celulolityczne- blue celulose. W przypadku produkcji tych enzymów wokół kolonii pojawią się strefy rozjaśnienia podłoża i pomiar średnicy tej strefy stanowi wskazówkę dotyczącą produkcji danego enzymu przez analizowaną monokulturę. Należy jednak wiedzieć, że pomiar strefy zmiany barwy wokół kolonii jest przydatny jedynie w początkowych fazach doskonalenia cech mikroorg. szczepy o bardzo wysokich aktywnościach powodują, że w krótkim czasie strefa rozjaśnienia jest tak duża, że różnicowanie tą drogą nie daje efektów.
2. selekcjonując mutanty produkujące kw. org. Takiej jak kw.cytrynowy stosuje się do podłoży hodowlanych błękitu bromofenolowego lub czerni obojętnej i wydzielany poza kom. Kw.org.powoduje zmianę barwy wskaźnika wokół kolonii. Wielkość strefy zmiany barwy jest funkcją ilości wydzielonego kwasu. Podobnie jak w przypadku barwnych substratów metoda ta jest przydatna jedynie w początkowych fazach doskonalenia cech mikroorg. metodę wskaźników stosuje się również przy poszukiwaniu producentów enzymów amylolitycznych; rozkład skrobi można ocenić zraszając płytkę płynem Lugola. Wśród metod losowego skriningu nie można pominąć oceny monokultur w hodowlach płynnych. Jest to niesłychanie pracochłonne, ma jednak tę zaletę, że jest to metoda dokładna, a tym samym użyteczna dla szczepów wykazujących bardzo wysoką produktywność. Metody racjonalnego skriningu:Dzięki postępowi wiedzy z zakresu genetyki i fizjologii mikroorg.w wyniku poznania szlaków biosyntezy wielu produktów i mechanizmów regulujących te syntezy możliwym stało się opracowanie efektywnych, racjonalnych metod skriningu populacji poddanej zabiegowi doskonalenia. Procedura racjonalnego skriningu polega na podobnym postępowaniu jak w przypadku skriningu losowego, z tym, że rajonalna jego forma prowadzona jest w warunkach, które ograniczają wzrost niepożądanych kultur lub limitują ujawnienie się niekorzystnych cech, a tym samym ułatwiają selekcję monokultur najcenniejszych. Metody racjonalnego skriningu sklasyfikowano w 2 grupach:1.metody bezpośrednie 2.metody pośrednie. W metodach bezpośrednich analizowanym parametrem jest produktywność, czyli podstawowy cel skriningu, przy czym warunki doświadczenia dobiera się tak, by produktywność ta była w pewnym stopniu ograniczona. W metodach pośrednich w pierwszym rzędzie wykrywa się inną cechę (nie produktywność) wpływającą w sposób zasadniczy na wydajność biosyntezy danego produktu. Dopiero w oparciu i 1.etap porównuje się produktywność wyselekcjonowanych klonów. Metody bezpośrednie racjonalnego skriningu 1.metoda chemostatu2.poszukiwanie rewertantów 1.metoda polega na prowadzeniu hodowli ciągłej, która szczepiona jest populacją poddaną zabiegowi doskonalenia. Najczęściej hodowla prowadzona jest w typowym podłożu odżywczym i podłoże jest równomiernie wzbogacane coraz większymi dodatkami substancji limitującej syntezę danego produktu. Kontrola tej hodowli polega na równomiernym pobieraniu próbek i pomiarze produktywności. Typowo po okresie wstępnym obserwuje się spadek tej aktywności, po czym jeżeli tylko w mieszaninie występują mutanty pozytywne następuje moment wzrostu produktywności. W tej fazie udział komórek pozytywnych w populacji jest znaczący i bez trudu można je wyizolować w warunkach typowego rozsiewu na płytki. Metoda chemostatu jest bardzo skuteczna, efektywna i stosowana nie tylko w poszukiwaniu pozytywnych mutantów. Stosuje się ją powszechnie w poszukiwaniach szczepów ze środowiska naturalnego, degradujących niebezpieczne ksenobiotyki. PULULAN Producent: Pullularia pullulans ( czarne drożdże) z Ascomycetes rodziny Dothideales, mimo że jego forma doskonała nie jest dotąd znana. Cechy:1.najbardziej rozpowszechniony w strefie umiarkowanej , wyst. na pow. roślin i owoców, w glebie, wodach słodkich i słonych, ściekach i na żywych organizmach.2.Duży polimorfizm: zależnie od wrunków i czasu wzrostu: okrągłe formy drożdżopodobne, wydłużone formy mycelarne, chlamydospory (produkują barwniki)3.Produkcja ciemnych barwników melaninowych.Pululan to obojętny poliglukan zbudowany z liniowych łańcuchów. Reszty D-glukopiranozy połączone są wiązaniami a-1,6-glikozydowymi oraz a-1,4. po 2 kolejnych wiązaniach a-1,4 następuje a-1,6. Właściwości:-wysuszony, bezbarwny proszek bez smaku i zapachu, niehigroskopijny-dobrze rozpuszcza się w wodzie, tworząc lepkie, obojętne roztwory, trwałe przy wysokich stężeniach soli. Przy wyższych stężeniach pullulanu roztwór wykazuje pseudoplastyczność.-odparowując wodę z roztworu można otrzymać:a)błonę o dobrych właściwościach mechanicznych, odporną na oleje mineralne i tłuszczeb)cienkie folie polimeruc)włókna polisacharydu o dobrych wł. Mech.-sproszkowany połączony z niewielką ilością wody i wytłaczany daje materiał przypominający polistyren, ale bardziej elastyczny.-nie rozpuszcza się w rozpuszczalnikach organicznych- aceton i metanol są wykorzystywane do wytrącania polisacharydu z roztworów wodnych;-odporny na działanie zasad i słabych kwasów;-wolne grupy w pullulanie mogą być częściowo lub całkowicie zestryfikowane, co zmniejsza lub znosi rozpuszczalność rozpuszczalników w wodzie; uwodornienie zwiększa jego odporność na wysoką temp.-pullulan może wywołać odpowiedź immunologiczną -pullulan nie jest trawiony przez enzymy pokarmowe człowieka;-nie wywołuje alergii
Hydroliza enzymatyczna pullulanu Pullulanaza- enzym pozakomórkowy wytwarzany przez: Aerobacter aerogenes,Bacillus sp.Streptomyces flavochromogenes.Hydrolizują tylko wiązania a1,6-glikozydowe dając cząsteczki maltotriozy.Izopululanaza wytwarzana przez Aspergillus niger.Hydrolizuje tylko wiązania a1,4-gliko.łączące tylko tę resztę glukozy, która w pozycji C6 łączy się wiązaniem a-1,6 z resztą glukozy kolejnejmaltotriozie.Neopululanaza- rozrywa drugie z obecnych w reszcie maltotriozowej wiązań a1,4. Modyfikowany chemicznie pululan:1.estryfikowany pululan- uzyskuje się różne stopnie rozpuszczalności2.eteryfikowany pululan- podobne cechy3.hydrogenowany (uwodorniony)- wysoka odporność termiczna, brak przep. tlenu przez folie.4.siarczany pululanu i ich sole- lek na wrzody żołądka5.karboksylowany- wysoka rozp. W zimnej wodzie6.usieciowany- otrzymuje się hydrofilowe żele7.dialdehydowany- nieprzepuszczalność wody 8.aminoalkiloeteryfikowany- kationowy polimer o różnym zastosowaniu 9.cyjanoetylowany- wysoka odporność termiczna, nierozp. w wodzie, wysoka stała dielektryczna. Glukoza, sacharoza, fruktoza, maltoza, ksyloza, laktoza, galaktoza, arabinoza, rafinoza- cukry na których prowadzona jest fermentacja. Najefektywniejsza jest sacharoza w ilości 70%. Sole: fosforan potasu, azotan sodu, siarczan magnezu, chlorek żelaza, tiamina, ekstrakt drożdżowy.Optymalna temp. 25-28st. pH 4,5-7.Biosynteza wymaga bardzo intensywnego natlenienia i mieszania. Najwyższą wydajność procesu otrzymuje się po długim czasie, nawet do 120h.Metoda wsadowa- jednorazowe wprowadzenie pożywki ze wszystkimi składnikami.
Metoda wsadowa z dożywianiem- uzupełnia się składniki pokarmowe, zwłaszcza źródło węgla.Metoda ciągła- ciągłe odbieranie płynu hodowlanego, z równoczesnym uzupełnieniem fermentora świeżą pożywką. Ograniczeniem hodowli jest wytwarzanie przez szczep barwników melaninowych.Problem zabarwienia pululanu melaninami rozwiązany jest przez wykorzystywanie mutantów oraz dobieranie składu pożywki. Korzystny jest wysoki stosunek węgla do azotu. Najefektywniejsze są komórki drożdżopodobne- aby się one namnożyły jako źródło węgla dodano olej sojowy, a jako źródło azotu kwas glutaminowy. Po namnożeniu biomasy jako źródła węgla dodaje się sacharozę, a nie stosuje się już źródła azotu. W ten sposób można otrzymać całkowicie biały pululan. Zastosowanie pululanu: -pakowanie lub pokrywanie żywności- tworzenie cienkich błon; -dodatek do żywności niskokalorycznej jako wypełniacz zastępujący skrobię oraz nośnik witamin-otrzymywanie niskokalorycznego środka słodzącego zawierającego produkty hydrolizy pululanu przez neopululanaze-pokrywanie i kapsułkowanie leków-otrzymywanie płynów zastępujących plazmę krwi-nośnik antygenów i wirusów w produkcji przeciwciał i szczepionek przeciwwirusowych-nośnik leków antynowotworowych (cholesterolopululan- hydrofobowy), interferonu-kremy, pudry, maści. Mechanizm biosyntezy Glukoza jest przekształcona w kilku typowych reakcjach do UDPG. Polimeryzacja UDPG do pululanu zachodzi w zewnętrznej części błony komórkowej. UDPG jest transportowane do cytoplazmy przez hydrofobową cząsteczkę- ufosforylowany lipid, albo pirofosforan lipidowo- cukrowy. Powstaje pirofosforan lipidowo- glukozowy, którego łańcuch polisacharydowy wydłuża się w wyniku reakcji z kolejnymi cząstkami UDPG. W rezultacie tworzy się pirofosforan lipidu związany z pululanem jako resztę cukrową.