63

7. Można też stosować przy ich ilościowym oznaczaniu pomiar absorpcji zasad azotowych w „trafiolecie metodą spektrofotometryczną przy długości fali 260-280 nm. Na ćwiczeniu .-tudenci zapoznają się z jednym z możliwych sposobów oznaczania zawartości DNA wykorzystującym reakcję barwną na £-D-2-deoksyrybozę. Cukier ten reaguje z di^ylo aminą zarówno w postaci nukleozydów, nukleotydów, jak-i produktów-icL kondensacji (DNA). Dlatego też, aby oznaczyć prawidłowo zawartość DNA, należy wcześniej wyodrębnić ten związek z tkanki roślinnej lub zwierzęcej.

Znane są liczne metody wyodrębniania i oczyszczania kwasów nukleinowych. Najbardziej znane są metody: Schmidta i Thannhausera, Schneidera oraz Ogura i Rosena. Pierw sze etapy postępowania w wymienionych metodach sprowadzają się głównie do rozdrobnienia tkanki i traktowania jej kwasami (trichlorooctowym, nadchlorow^ym), co umożliwia oddzielenie związków niskocząsteczkow^ych, takich jak wolne nukleotydy, koenzymy, sacharydy oraz fosfor nieorganiczny. Z kolei na pozostałość działa sie rozpuszczalnikami organicznymi w celu pozbycia się tłuszczów (głównie fosfolipidów). Dalsze etapy w poszczególnych metodach różnią się już między sobą.

Na ćwiczeniu zastosowana będzie inna metoda opracowana przez Marmura, która jest bardzo przydatna w wyodrębnianiu DNA z grasicy cielęcej. Grasica jest gruczołem, w którym DNAznajduje się w dużym stężeniu (wynosi ono ok. 60% suchej masy tkanki), co umożliwia łatwiejsze wyodrębnienie tego kwasu. Zamrożoną tkankę odmraża się, rozdrabnia i zadaje roztworem chlorku sodowego i EDTA (kwas etylenodiaminotetraoctowy); roztwór ten działa stabilizująco na ekstrahowany DNA. Następnie rozdrobnioną tkankę, znajdującą się w roztworze stabilizującym, traktuje się solą sodową siarczanu dodecylu — SDS, związek ten bowiem jako detergent ułatwia oddzielenie różnych składników komórkowych, a potem traktuje się nadchloranem sodowym, który umożliwia dysocjację nukleoprotein. Z kolei do mieszaniny zawierającej DNA i białko dodaje się roztworu chloroformu z alkoholem izoamy-lowym. co powoduje denaturację i wytrącenie białka, a po odwirowaniu umożliwia uzyskanie \vzglednie czystego roztworu DNA. DNA wytrąca się z roztworu dodając alkohol etylowy, który w głównej mierze działa jako czynnik odwadniający.

Odczynniki

I. Do izolowania DNA z grasicy cielęcej metodą Marmura:

1.    Roztwór chlorku sodowego i etylenodiaminotetraoctanu sodowego (EDTA-rozpuścić na ciepło): 03-molowy chlorek sodowy zmieszać z 0,2-moiowym EDTA w stosunku 1:1, doprowadzić 1-molowym wodorotlenkiem sodowym do pH 8.

2.    Nadchloran sodowy: 5-molowy kwas nadchlorowy zmieszać z 10-molowym wodorotlenkiem sodowym w stosunku 1:1 i doprowadzić do pH ok. 7,5.

3.    Mieszanina chloroformu i alkoholu izoamylowego (24:1).

4.    96-proc. alkohol etylowy.

5.    25-proc. roztwór soli sodowej siarczanu dodecylu — SDS (przed użyciem podgrzać do 80°C i wymieszać).

6.    Grasica cielęca zamrożona.

7.    5-molowy kwas nadchlorowy.

Opracowanie praktyczne ćwiczenia — dr Elżbieta Go dl ewska-Ro go ziriska.

53