3582320649

GENETYKA WYKŁAD 9

-    mapowanie fizyczne i klasyczne (genetyczne) - daje pełny obraz genów

-    sekwencjonowanie i fragmentowanie DNA - enzymy restrykcyjne

-    diagnoza - „finger print"

-    PCR - poza komórką

nU    sU    Np

kombinacja technik => umożliwia diagnostykę np. chorób, ustalenie ojcostwa (zastosowanie inżynierii (mapy restrykcyjne, diagnozy restrykcyjne)

~ klonowanie, izolowanie genów

-    izolacja, określenie sekwencji, wprowadzenie do komórki gospodarza, uzyskanie ekspresji określonych genów => to b. ważne, konieczne etapy w badaniach, inżynierii

wektory

■ markery selekcyjne

*    miejsca replikacji (plazmidy bakteryjne R6K, EcoRI - z nich konstruowane wektory)

wprowadzenie wyizolowanych genów:

-    transformacja — najczęstsza metoda

~ obecnie nienaturalnie (invitro), do kompetentnych komórek gospodarza

-    transdukcja

-    koniugacja - małe zastosowanie TRANSFORMACJA

-    w komórkach bakteryjnych proces łatwo można indukować, jest inna ściana komórkowa, łatwo DNA

wnika do komórki (głównie u E. coli)

-    konieczne wywołanie kompetencji w komórkach bakteryjnych do pobierania DNA ze środowiska

-    gorzej u Eucaryota - trudno uczynić komórkę kompetentną

•    usunięcie ściany, np. drożdży, żeby DNA mogło wniknąć, uzyskanie protoplastu lub sferoplastu zachowana część ściany)

•    trzeba użyć dużo sorbitolu (dobre warunki osmotyczne, komórka bez ściany nie będzie pękać)

•    dodanie CaCl? — powoduje kompetencję (także u bakterii) - powoduje rozszerzenie porów

•    3-5 tyś. transformantów drożdżowych uzyskuje się z 1 pg DNA

•    trudności - odpowiednia temperatura agaru

-    nieodpowiednia regeneracja ściany

-    długa procedura

-    metoda chlorku litu - usprawnienie procesu

•    kompetencja komórek drożdżowych

•    uzyskuje się mniej transformantów, ale duża wydajność reakcji i nie trzeba robić protoplastyzacji

*    rozluźnienie barier

kompetencja - zdolność do przyjęcia DNA

~ brane komórki z fazy logarytmicznej (nie stacjonarnej)

- ELEKTROPORATORY:

•    impuls elektryczny 2,7 kWcm2 w czasie 1/15 ms => powoduje elektroporację, otwarcie kanałowi w efekcie pobranie DNA

•    bardzo duża wydajność procesu na 1 pg DNA (kilka min)

•    sterowane komputerowo

•    u bakterii, drożdży, zwierząt, roślin

•    do organizmów wyższych stosuje się działo, kulki złote lub wolframowe (patrz dalej)

1