74654

DNA

Preparat DNA może być przechowywany

-    w temp. Pokojowej przez krótki czas

-    w temp. 4°C po dodaniu chlorofilu (5pl chloroformu/ lml DNA) przez długi okres czasu

-    w stanie zamrożenia przez nie ograniczony czas Przygotowanie materiału roślinnego do analizy DNA:

1.Sterylizować po 5 ziarniaków w 1,6% podchloiynie sodu przez 2 min

2.    Wysterylizowane ziarniaki przenieść do czystej wody destylowanej i płukać przez 5 minut

3.    Płukanie powtórzyć trzykrotnie

4.    Wysterylizowane ziarniaki przenieść na szalki Petriego wyłożone wilgotną sterylna bibułą

5.    Szalki przenieść do kiełkownika (25°C ) na 3 dni.

Izolacja DNA

1    Kilkudniowe skrawki liści umieścić w probówkach Eppendorfa i homogenizować w ciekłym azocie za pomocą moździerzników z tworzywa sztucznego, po czym dokonać lizy komórek w obecności 400 pl buforu ekstrakcyjnego

2    Próby umieścić w łaźni wodnej o temp. 65°C na 20 minut. Następie dodać 200 pl 5M octanu potasu, worteksować i inkubować przez 10 minut na lodzie, po czym wirować przez 15 min., przy 13000RPM.

3    Przenieść 500 pl supematantu do świeżych probówek Eppendorf, dodać lml 95% etanolu i wytrącać DNA w temp -20°C przez 20 min. Następnie wirować próby przy 13000 RPM przez 15 min.

4    Uzyskany osad przemyć 70 % etanolem po czym zawiesić w 200pl buforu TE.

Wybór metody izolacji DNA

-    rodzaj komórek lub tkanek z których izolowane będzie DNA

-    rodzaj izolowanego DNA (całkowite, chromosomalne, mitochondrialne, chloroplastydowe, plazmidowe)

-    czystość i jakość DNA niezbędna do dalszych analiz

-    wymagana ilość DNA

Wszystkie techniki izolacji DNA opierają się na dezintegracji (rozbiciu) komórek i

oddzieleniu DNA od struktur komórkowych związanych z nim białek i cząstek RNA

Etapy izolacji DNA

-Dezintegracja tkanek

-Niszczenie membran komórkowych

-Ekstrakcja DNA

-oczyszczanie

-precypitacja

-płukanie

-suszenie peletu

-zawieszenie w wodzie z RNazą -przechowanie