84770

Enzymy restrykcyjne rozcianją DNA na specyficzne fragmenty

Enzymy restrykcyjne (endonukleazy restrykcyjne) rozpoznają specyficzne sekwencje zasad w 2u nidowej DNA i rozcinają obie nici DNA w ściśle określonych miejscach. Są niezastąpione w badaniach struktury chromosomów, sekwencjonowania b.długich cząst. DNA. izolowaniu genów i tworzeniu nowych cząstek DNA. nadających się do klonowania. En.res. odkryli Arber i Smith, a Nathans zapoczątkował ich stosowanie.

En.res. występują u wielu prokariotów. Ich biologiczna rola polega na rozcinaniu obcych cząsteczek DNA. Nie degradują komórkowego DNA gospodarza, poniewź miejsca rozpoznawane przez własne En.res. są zmetylowane. Wiele En.res. rozpoznaje specyficzne sekwencje 4rech do 8miu par zasad i hydrolizuje wiązanie fosfodiestrowe w obu niciach DNA rozpoznawanego regionu. Charakt. cechą rozpoznawyanych miejsc jest ich podwójna symetria obrotowa - palindromowa (od przodu i tyłu tak samo sie czyta, np. radar), czyli odwrotnie powtórzona, a miejsca rozcinania łańcuchów DNA są usytuowane symtetrycznie.

Oczyszczono ponad 100 różnych En.res. Ich nazwy składają się z 3 literowego skrótu nazwy organizmu z jakiego pochodzą, np. Eco od Escherichia, za którym następuję oznaczenie szczepu (o ile jest to konieczne) i numer enzymu podany cyframi rzymskimi (jeśli dany szczep produkuje więcje niż 1den En.res.)

En.res. wykorzystuje się do rozcinania długich odcinków DNA na specyficzne fragmenty, jest na nich łatwiej pracować. Uzyskany w wyniku działania jednego En.res.może zostać specyficznie pocięty przez kolejny. Obraz takich fragmentów może stanowić odcisk palca. Stosując wiele En.res. można sporządzić mapy dużych chromosomów, zbudowanych z setek milionów par zasad.

Fragmenty restrykcyjne można rodzielić elektroforetycznie w żelu i uwidaczniać

Nawet małe różnice między spokrewnionymi DNA można wykryć dzięki rozdzieleniu w żelu i uwidocznieniu ich fragmentów restrykcyjnych, jest to elektroforeza żelowa. Ruchliwość elektroforetyczna DNA w różnych żelach jest w pewnych granicach odwrotnie proporcjonalna do logarytmu długości tego fragmentu, wyrażanej liczbą par zasad.

Żele poliakryloamidowe do rozdzielnia fragmentów o długości do 1000 par zasad. Żele agarozowe - długie, nawet do 20 kpz.

Ważną cechą żeli jest ich zdolność rozdzielcza. W odpowiednich żelach można rozdzielić fragmenty nawet różniące się tylko jednym nuklotydem, a stosując elektorforezę w pulsującym polu magnetycznym (PFGE) można rozdzielić całe chromosomy, zawierające miliony nukleotydów - rozciąganie i relaksacja DNA. przez włączanie i wyłączanie pola elektrycznego. Prążki lub plamy promieniotwórczego DNA można ukazywać przy pomocy autoradiografii. DNA może być też barwione bromkiem etydyny, który po związaniu się z 2u niciowym DNA i wzbudzeniem przez światło intensywnie fluoryzuje, daje pomarańczowe światło.

Fragment restrykcyjny, zawierający specyficzną sekwencję zasad, można wyryć przez hybrydyzowanie go z komplementarnym 1no niciowym DNA wyznakowanym promieniotwórczo. Metoda/Hvbrvdvzacia Southern (hybrydyzacja DNA-DNA). Mieszaninę fragmentów restrykcyjnych rozdziela się elektroforetycznie w Żelu agarozowym, denaturuje do formy 1no nidowej i przenosi na filtr nitrocelulozy. DNa związany z nitrocelulozą zostanie poddany

2