1905037839

DIAGNOSTYKA GENETYCZNA. TERAPIA GENOWA 181

W08-02

MOLEKULARNE PODSTAWY DIAGNOSTYKI NOWOTWORÓW

Janusz A. Siedlecki

Centrum Onkologii-lnstytut, Zakład Biologii Molekularnej, Warszawa

Obecny stan wiedzy o molekularnych mechanizmach karcinogenezy nie wydaje się stwarzać nadziei na znalezienie wielu jednoznacznych korelacji pomiędzy określona zmianą, a typem nowotworu. Dlatego większość opracowywanych obecnie testów diagnostycznych nastawiona jest raczej na jak najwcześniejsze odróżnienie komórki nowotworowej od normalnej. W warunkach początkowych, gdy masa nowotworu jest niewielka analiza morfologiczna jest często niewystarczająca do zidentyfikowania małej grupy zmienionych komórek. Podobnie zawodne mogą okazać się techniki immunocytochemiczne. Biologia molekularna oferuje narzędzia pozwalające na wykrycie zmian w DNA, RNA i białkach nawet w pojedynczej komórce.

Dzięki technice PCR możliwe jest otrzymanie ponad miliona kopii danego fragmentu DNA z pojedynczej nici cząsteczki obecnej w przednowotworowej lub nowotworowej komórce. Stało się więc możliwe wykrycie małej grupy nieprawidłowych komórek, które złuszczyły się z nowotworu do płynów ustrojowych - takich jak krew, mocz, plwocina, czy nawet wydzielina z sutka. W cytologicznie negatywnych próbkach plwociny, na 10 przebadanych przypadków w 8 stwierdzono obecność komórek z mutacją w genach Ki-RAS lub P53. We wszystkich tych przypadkach rak płuc został klinicznie potwierdzony w 1-4 miesięcy później, a w przypadku jednego z pacjentów aż 13 miesięcy później. Metoda PCR umożliwia również wykazanie obecności mikronacieków w obszarze otaczającym usuniętą wraz z odpowiednim marginesem zmianę pierwotną oraz ujawnienie mikroprzerzu-tów w węzłach chłonnych.

Technika PCR oparta o tkankowo-specyficzne markery pozwala na znalezienie nawet kilkuset komórek nowotworowych krążących we krwi obwodowej. Poszukuje się tą metodą komórek nowotworowych krążących we krwi obwodowej u chorych po radykalnym zabiegu chirurgicznym i/lub z czynnym procesem nowotworowym. Eksperymenty tego typu prowadzone są dla raka prostaty, sutka, płuca i czerniaka. W Centrum Onkologii opracowaliśmy dwumarkerową metodę pozwalającą na wykrycie (w całkowitym RNA izolowanym z krwi obwodowej) obecności mRNA dla tyrozynazy i MART 1 - transkrypów specyficznych dla komórek czerniaka. Z pobranej krwi izolowano całkowite RNA, a następnie przy pomocy odwrotnej transkryptazy syntetyzowano cDNA. W celu ujawnienia obecności transkryptów przeprowadzano reakcję PCR. Badania nad czułością reakcji amplifikacji pozwoliły na ustalenie, że możliwe jest wykrycie krążących komórek czerniaka, gdy ich liczba jest większa niż 1000 w pełnej objętości krwi.

Wysoce obiecujące jest wykorzystanie do identyfikacji komórek nowotworowych analizy sekwencji mikrosateli-tarnych. Zmiany w ich obrębie są świadectwem niestabilności genomu wywołanej na przykład mutacją w genie mutatorowym. Prostota analizy powtórzeń mikrosatelitarnych oraz możliwość pełnego jej zautomatyzowania stanowi o przewadze tej techniki w porównaniu z techniką wykrywania specyficznych mutacji.