ÿþM e t o d y b a d a n i a p o l i m o r f i z m u D N A
M e t o d y b a d a n i a p o l i m o r f i z m u D N A
d r A l e k s a n d r a S a Ba g a c k a
P r a c o w n i a B i o l o g i i M o l e k u l a r n e j i F a r m a k o g e n o m i k i
U n i w e r s y t e t M e d y c z n y w Ao d z i
M e t o d y w y k r y w a n i a m u t a c j i
M e t o d y w y k r y w a n i a m u t a c j i
n i e z d e f i n i o w a n y c h
n i e z d e f i n i o w a n y c h
P C R - S S C P
P C R - S S C P
" S i n g l e s t r a n d c o n f o r m a t i o n p o l y m o r p h i s m
p o l i m o r f i z m k o n f o r m a c j i f r a g m e n t ó w
j e d n o n i c i o w y c h
" s s D N A p r z y j m u j e w w a r u n k a c h n i e d e n a t u r u j c y c h
u n i k a l n s t r u k t u r d r u g o - i t r z e c i o r z d o w
" k o n f o r m a c j a t a j e s t z a l e |n a o d s e k w e n c j i n u k l e o t y d o w e j
" r ó |n e k o n f o r m e r y r ó |n i s i r u c h l i w o [c i e l e k t r o f o r e t y c z n a
" p o j e d y n c z e r ó |n i c e w s e k w e n c j i , w y w o Ba n e m u t a c j p u n k t o w
p o w o d u j z r ó |n i c o w a n m i g r a c j i c h a r a k t e r y s t y c z n e p o Bo |e n i e
w |e l u p o l i a k r y l a m i d o w y m .
P C R - S S C P e t a p y :
P C R - S S C P e t a p y :
1 ) r e a k c j a P C R p o w i e l e n i e b a d a n e g o f r a g m e n t u
D N A
1 ) d e n a t u r a c j a d s D N A ( s i l n a z a s a d a , f o r m a m i d ,
w y s o k a t e m p . ) - p o w s t a j s s D N A
1 ) e l e k t r o f o r e z a |e l o w a s s D N A w w a r u n k a c h
n i e d e n a t u r u j c y c h
1 ) w y k r y w a n i e k o n f o r m e r ó w p o j e d y n c z y c h n i c i w
|e l u ( n p . w y b a r w i e n i e b r o m k i e m e t y d y n y )
P C R - S S C P
P C R - S S C P
A A A B B B A A B B A B A A B B B B B B B B B B B B
P C R - H D A
P C R - H D A
" H e t e r o d u p l e x a n a l y s i s - a n a l i z a
h e t e r o d u p l e k s ó w
" s s D N A , p o w s t a Be w p r o c e s i e d e n a t u r a c j i d s D N A , p o d c z a s p o w o l n e j
r e n a t u r a c j i Ba c z s i p r z y p a d k o w o w s t r u k t u r y d w u n i c i o w e , t z w .
d u p l e k s y
" m o |l i w e j e s t Bc z e n i e s i n i c i w p e Bn i d o s i e b i e k o m p l e m e n t a r n y c h
( h o m o d u p l e k s y ) , j a k i n i e ( h e r e o d u p l e k s y )
h o m o z y g o t y h o m o d u p l e k s y
h e t e r o z y g o t y h e t e r o - i h o m o d u p l e k s y
P C R - H D A
P C R - H D A
H e t e r o d u p l e k s y p o s i a d a j m n i e j s z r u c h l i w o [ e l e k t r o f o r e t y c z n
( r o z l u zn i e n i e s t r u k t u r y w m i e j s c u n i e p e Bn e g o s p a r o w a n i a ) n i |
h o m o d u p l e k s y .
H D A e t a p y :
H D A e t a p y :
1 ) r e a k c j a P C R p o w i e l e n i e b a d a n e g o f r a g m e n t u
D N A
1 ) d e n a t u r a c j a d s D N A ( w y s o k a t e m p . ) p o w s t a j
s s D N A
1 ) r e n a t u r a c j a s s D N A Bc z e n i e s s D N A w h o m o -
i / l u b h e t e r o d u p l e k s y
1 ) e l e k t r o f o r e z a d u p l e k s ó w w |e l u
p o l i a k r y l a m i d o w y m
1 ) w y k r y w a n i e d u p l e k s ó w w |e l u ( n p . w y b a r w i e n i e
b r o m k i e m e t y d y n y )
P C R - H D A
P C R - H D A
P C R - C M C
P C R - C M C
" C h e m i c a l m i s m a t c h c l e a v a g e c h e m i c z n e
r o z s z c z e p i a n i e n i e s p a r o w a n y c h h e t e r o d u p l e k s ó w
" p o d o b n i e j a k H D A w y k o r z y s t u j e z j a w i s k o p o w s t a w a n i a
h e t e r o d u p l e k s ó w
" n i e s p a r o w a n e z a s a d y w h e t e r o d u p l e k s a c h p o d d a j e s i
m o d y f i k a c j i c h e m i c z n e j
( c y t o z y n a h y d r o k s y l a m i n a , t y m i n a c z t e r o t l e n e k o s m u )
" z m o d y f i k o w a n e c z s t e c z k i D N A u l e g a j p r z e c i c i u p o d
w p By w e m p i p e r y d y n y ’! z m i a n y w o b r a z i e e l e k t r o f o r e t y c z n y m
P C R - D G G E
P C R - D G G E
" D e n a t u r i n g G r a d i e n t G e l E l e c t r o p h o r e s i s
- e l e k t r o f o r e z a w |e l u z g r a d i e n t e m c z y n n i k a
d e n a t u r u j c e g o
" d s D N A u l e g a d e n a t u r a c j i p r z y r ó |n y c h s t |e n i a c h z w i z k ó w
d e n a t u r u j c y c h w z a l e |n o [c i o d s k Ba d u z a s a d i s e k w e n c j i
n u k l e o t y d o w e j
z w . d e n a t u r u j a c e : f o r m a m i d , m o c z n i k , c h l o r o w o d o r e k g u a n i d y n y
" p r o d u k t y P C R o r ó |n e j s e k w e n c j i b d w r o |n y c h m i e j s c a c h |e l u
u l e g a d e n a t u r a c j i ’! z m i a n y w o b r a z i e e l e k t r o f o r e t y c z n y m
" j e [l i c z y n n i k i e m d e n a t u r u j c y m j e s t t e m p e r a t u r a P C R - T G G E
P C R - D G G E
P C R - D G G E
P C R - D G G E
P C R - D G G E
M e t o d y w y k r y w a n i a m u t a c j i
M e t o d y w y k r y w a n i a m u t a c j i
z d e f i n i o w a n y c h
z d e f i n i o w a n y c h
P C R - R F L P
P C R - R F L P
R e s t r i c t i o n F r a g m e n t L e n g t h P o l y m o r p h i s m
p o l i m o r f i z m d Bu g o [c i f r a g m e n t ó w r e s t r y k c y j n y c h
E n z y m y r e s t r y k c y j n e ( r e s t r y k t a z y , e n d o n u k l e a z y )
§ð
e n z y m y b a k t e r y j n e
§ð
n a t u r a l n y m e c h a n i z m o b r o n n y b a k t e r i i o c h r o n a p r z e d
w i r u s o w y m D N A ( s y s t e m r e s t r y k c j i m o d y f i k a c j i )
§ð
p o s i a d a j z d o l n o [ d o r o z p o z n a w a n i a k r ó t k i c h 4 - 8 -
n u k l e o t y d o w y c h s e k w e n c j i D N A i i c h p r z e c i n a n i a
P C R - R F L P
P C R - R F L P
" R e s t r i c t i o n F r a g m e n t L e n g t h P o l y m o r p h i s m
p o l i m o r f i z m d Bu g o [c i f r a g m e n t ó w r e s t r y k c y j n y c h
" m u t a c j a p o w o d u j e p o w s t a n i e l u b z a n i k m i e j s c a
r o z p o z n a w a n e g o p r z e z o k r e [l o n y e n z y m r e s t r y k c y j n y
’! z m i a n a w o b r a z i e e l e k t r o f o r e t y c z n y m p o
t r a w i e n i u e . r e s t r y k c y j n y m
( z m i a n a l i c z b y i d Bu g o [c i f r a g m e n t ó w D N A )
P C R - R F L P e t a p y :
P C R - R F L P e t a p y :
1 ) r e a k c j a P C R p o w i e l e n i e b a d a n e g o f r a g m e n t u
D N A
1 ) t r a w i e n i e p r o d u k t u P C R e n z y m e m r e s t r y k c y j n y m
1 ) e l e k t r o f o r e z a p r o d u k t u r e a k c j i t r a w i e n i a
1 ) o c e n a w z o r u p r |k o w e g o
P C R - R F L P
P C R - R F L P
2 0 6 p a r z a s a d
1 3 0 p a r z a s a d
7 6 p a r z a s a d
[c i e |k i 1 , 2 , 5 - h e t e r o z y g o t a C T
[c i e |k a 3 - h o m o z y g o t a C C
[c i e |k a 4 - h o m o z y g o t a T T
A l l e l e S p e c i f i c P C R ( A S - P C R )
A l l e l e S p e c i f i c P C R ( A S - P C R )
" d w i e r ó w n o l e g Be r e a k c j e P C R d l a t e j s a m e j p r ó b y b a d a n e j
" j e d e n s t a r t e r w s p ó l n y d l a o b u r e a k c j i
" d r u g i s t a r t e r s w o i s t y d l a s e k w e n c j i z m u t o w a n e j l u b
n i e z m u t o w a n e j k o m p l e m e n t a r n y d o s e k w e n c j i , w k t ó r e j
m o |l i w a j e s t z m i a n a m u t a c y j n a
" o c e n a m u t a c j i o b e c n o [/ b r a k u p r o d u k t u w o b y d w u
r e a k c j a c h P C R
P C R - A S O
P C R - A S O
" A l l e l e s p e c i f i c o l i g o n u c l e o t i d e h y b r y d y z a c j a z
a l l e l o w o - s p e c y f i c z n y m i s o n d a m i o l i g o n u k l e o t y d o w y m i
" s o n d y z n a k o w a n e o l i g o n u k l e o t y d y ( f l u o r e s c e n c y j n i e ,
i z o t o p o w o )
" d w i e s o n d y - j e d n a k o m p l e m e n t a r n a d o a l l e l a d z i k i e g o ,
d r u g a d o a l l e l a z m u t o w a n e g o
P C R - A S O e t a p y :
1 ) r e a k c j a P C R p o w i e l e n i e b a d a n e g o f r a g m e n t u D N A
1 ) n a n i e s i e n i e p r o d u k t u P C R n a m e m b r a n y n y l o n o w e
1 ) n a n i e s i e n i e s o n d n a m e m b r a n y
1 ) h y b r y d y z a c j a s o n d y - p r o d u k t P C R
1 ) d e t e k c j a s y g n a Bó w d o s h y b r y d y z o w a n y c h s o n d
o c e n a g e n o t y p u
A n a l i z a m u t a c j i z a p o m o c
A n a l i z a m u t a c j i z a p o m o c
t e c h n i k i r e a l - t i m e P C R
t e c h n i k i r e a l - t i m e P C R
R T - P C R z a s a d a m e t o d y
R T - P C R z a s a d a m e t o d y
" p o l e g a n a m o n i t o r o w a n i u p r z y r o s t u i l o [c i D N A
w c z a s i e r e a k c j i a m p l i f i k a c j i
" i l o [ k o p i i D N A m i e r z o n a j e s t
p o k a |d y m c y k l u r e a k c j i a m p l i f i k a c j i
p o p r z e z p o m i a r f l u o r e s c e n c j i , k t ó r a p o c h o d z i o d b a r w n i k ó w
f l u o r e s c e n c y j n y c h w i |c y c h s i z p o w i e l a n y m D N A
" i n t e n s y w n o [ s y g n a Bu j e s t p r o p o r c j o n a l n a d o i l o [c i D N A w
m i e s z a n i n i e
A n a l i z a m u t a c j i
A n a l i z a m u t a c j i
A n a l i z a
A n a l i z a
S o n d y
S o n d y
k r z y w y c h
k r z y w y c h
s w o i s t e
s w o i s t e
t o p n i e n i a
t o p n i e n i a
d l a s e k w e n c j i
d l a s e k w e n c j i
S o n d y s w o i s t e d l a s e k w e n c j i
S o n d y s w o i s t e d l a s e k w e n c j i
" d w i e s o n d y s w o i s t e d l a s e k w e n c j i : d z i k i e j ,
z m u t o w a n e j
" w y z n a k o w a n e d w o m a r ó |n y m i f l u o r o f o r a m i
" g e n o t y p o k r e [l a n y n a p o d s t a w i e o b e n o [c i / b r a k u
s y g n a Bu p o c h o d z c e g o o d o b y d w u s o n d
+ + -
a l l e l d z i k i
- + +
a l l e l
z m u t o w a n y
h o m o z y g o t a h e t e r o z y g o t a h o m o z y g o t a
z m u t o w a n a
d z i k a
A n a l i z a k r z y w y c h t o p n i e n i e n i a
A n a l i z a k r z y w y c h t o p n i e n i e n i a
E t a p y :
a m p l i f i k a c j a b a d a n e g o f r a g m e n t u D N A
i n k u b a c j a w c e l u t w o r z e n i a h e t e r o d u p l e k s ó w
p r e c y z y j n a d e n a t u r a c j a ’! w y k r e [l e n i e k r z y w y c h t o p n i e n i a
p o r ó w n a n i e k s z t a Bt ó w k r z y w y c h d e n a t u r a c j i i p r e c y z y j n e
w y z n a c z e n i e t e m p e r a t u r y t o p n i e n i a
H o m o z y g o t a d z i k a v s h o m o z y g o t a z m u t o w a n a
r ó |n e w a r t o [c i T m
H o m o z y g o t y v s h e t e r o z y g o t a
k s z t a Bt k r z y w y c h d e n a t u r a c j i
S e k w e n c j o n o w a n i e
S e k w e n c j o n o w a n i e
s e k w e n c j a D N A k o l e j n o [ i r o d z a j n u k l e o t y d ó w w n i c i D N A
S e k w e n c j o n o w a n i e - p e Bn a i n f o r m a c j a o s e k w e n c j i D N A
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