8719220271

b) identyfikacja

Obecność białka w środowisku można wykazać za pomocą kilku reakcji:

•    Reakcja ksantoproteinowa (gr. ksantos - żółty, proteina - białko) polega na działaniu na próbę stężonym kwasem azotowym (HNO3). Jeżeli w próbie tej znajduje się białko zawierające aa aromatyczne, to ulegną one reakcji nitrowania, dając produkty dysocjujące do żółto-pomarańczowego anionu, np.:

Tyr + HNO3 —»AT, -H2O—► 3-nitrozotyrozyna

•    Reakcja biuretowa bierze swoją nazwę od biuretu (dwumocznika: H2N-CO-NH-CO-NH2) -najprostszego związku dającego jej pozytywny wynik. Pozwala ona na wykrycie obecności wiązania peptydowego, począwszy od trójpeptydów wzwyż. Przeprowadza się ją dodając do próby zasadowego roztworu siarczanu miedzi (CUSO4). Jeżeli w próbie znajduje się związek zawierający dwa sąsiadujące wiązania peptydowe, to utworzy on z jonami miedzi (II) połączenie kompleksowe o intensywnie fioletowym zabarwieniu. Należy jednak zaznaczyć, iż pozytywne miano nie potwierdza obecności w próbie związków aminokwasowych.

•    Reakcja cystynowa pozwala na wykrycie białek zawierających wiązania dwusiaczkowe (S-S). Przeprowadza się ją w środowisku zasadowym, z dodatkiem rozpuszczalnej soli ołowiu, np. octanu.

Pod wpływem wysokiego pH następuje rozpad wspomnianych wiązań z uwolnieniem anionu wodorosiarczkowego:

Cys-S-S-Cys + H₂0 + OH — 2 CH₃COCOOH + 2 NH, t + HS + S |, który łączy się z kationem ołowiu, prowadząc do strącenia czarnego osadu siarczku ołowiu: PbKCH₃COO)₂ + HS -► CH3COOH + CHjCOO + PbS I.

c) poziomy organizacji i fałdowanie

Białka należą do najbardziej złożonych związków chemicznych występujących w przyrodzie. Ich budowa wykazuje pewne poziomy organizacji, stąd dla precyzyjnego jej opisu wprowadzono pojęcie struktury I, II, III i IV-rzędowej. Metody laboratoryjne określania kolejnych struktur nieznanych białek opisane zostaną dalej.

•    Przez strukturę I-rzędową rozumiemy liczbę, budowę i kolejność (sekwencję) połączonych ze sobą reszt aa tworzących dane białko, wraz ze wskazaniem miejsc występowania wiązań dwusiarczkowych (S-S). Struktura I-rzędowa opisuje więc konfigurację peptydu. Przez konfigurację rozumiemy powiązania geometryczne między danym zbiorem atomów, których zmiana wiąże się z zerwaniem i ponownym uformowaniem wiązań kowalencyjnych.

•    Struktura II-rzędowa określa sposób skręcenia łańcucha polipeptydowego, czyli jego konformację. Konformacja to trójwymiarowa architektura cząsteczki, inaczej przestrzenne powiązania między atomami; może ona ulec zmianie przez reorganizację stabilizujących ją wiązań niekowalencyjnych (wiązania kowalencyjne zostają zachowane - por. wyżej). Cząsteczka białka o określonej konfiguracji (strukturze I-rz.), wobec możliwości swobodnej rotacji wokół dużej części (ok. 2/3) wiązań głównego łańcucha polipeptydowego, może posiadać nieproporcjonalnie dużą liczbę możliwych konformacji, choć zwykle tylko niektóre z nich umożliwiają cząsteczce pełnienie funkcji biologicznych. Liczba ta ograniczona jest częściowo podwójnym charakterem wiązania peptydowego, jak również rodzajem i kształtem grup bocznych (R) aa. Kąty rotacji cp i t|/ muszą więc przyjmować takie kombinacje wartości, aby wykluczyć przestrzenne konflikty między poszczególnymi atomami cząsteczki, a ich znajomość pozwala na jednoznaczne określenie konformacji wszystkich atomów gł. łańcucha polipeptydowego. Dozwolone wartości obejmują konformacje regularne - a-helisę, (5-kartkę, zwrot (5, superhelisę kolagenu oraz nieregularne - pętle i zwoje.

> Ogólnie rzecz biorąc, każda helisa (zwój) tworzona jest przez szkielet polipeptydowy skręcający się równomiernie wokół każdego atomu Ca Istnieją różne typy helis, różniące się między sobą rozmiarami i kierunkiem skrętu. Budowę helisy opisuje się więc przez podanie: liczby reszt aa przypadających na jeden skręt (n) oraz skoku śruby (p) lub odległości między sąsiednimi skrętami. Helisy polipeptydowe zabudowane z aa chiralnych są również chiralne, tzn. prawo- bądź lewoskrętne, przy czym w naturalnych białkach występują niemal wyłącznie te pierwsze. Taki kierunek skrętu zdeterminowany jest przez fakt budowy cząsteczki z enancjomerów L: w wyniku przyciągania się atomów wiązania peptydowego lżejsza grupa N-H zbliża się w stronę cięższej grupy C-0 właśnie w prawo, a-helisa cechuje się korzystnymi wartościami kątów rotacji oraz układem stabilizujących wiązań wodorowych. Zawiera zazwyczaj 4-50 (śr. ok. 12) reszt aa, posiada parametry: n=3,6, p=0,54 nm. Równoważne atomy z sąsiednich reszt łańcucha głównego oddalone są o 0,15 nm (mierzone wzdłuż osi). Grupy R skierowane są na zewnątrz helisy, co minimalizuje wzajemne interakcje przestrzenne. We wnętrzu helisy praktycznie brak wolnej przestrzeni. Dzięki maksymalnej liczbie wiązali wodorowych jest to konformacja o najniższej energii i tym samym największej stabilności, dlatego formuje się ona

47