2150626325

Zakład Biologii Molekularnej UMCS, wrzesień 2014

Izolacja kinaz białkowych z drożdży Saccharomyces cerevisiae

Kinazy białkowe uczestniczą w regulacji wielu procesów metabolicznych, biorą udział w transmisji sygnałów przez błony, regulują procesy wzrostu i różnicowania się komórek.

Oczyszczanie enzymów jest stosowane w badaniach ich struktury i funkcji. W tym celu stosuje się metody chromatografii jonowymiennej, chromatografii powinowactwa i sączenia molekularnego, w których wykorzystuje się takie cechy białek enzymatycznych jak: ładunek, powinowactwo wiązania do nośników, wielkość. Poniżej podana jest jedna z metod oczyszczania białek przez rozdział w procesie chromatografii jonowymiennej (ang. ion exchange chromatography - IEC). Rozdział białek w technice LEC polega na odwracalnej adsorpcji obdarzonych ładunkiem elektrycznym makromolekuł na nośniku jonowymiennym (jonowymieniaczu). Jonowym i eni acz to złoże chromatograficzne z unieruchomionymi na powierzchni polarnymi cząsteczkami posiadającymi ładunek elektryczny określonego znaku. W zależności od tego jakie jony wiąże jonowymieniacz, mówimy o anionowymieniaczu (anionicie) - wiążącym aniony lub o kationowymi eni aczu (kationicie) - wiążącym kationy.

Celem ćwiczenia jest oczyszczenie kinaz białkowych PKA i CK2 z frakcji cytoplazmatycznej komórek drożdży na DEAE-celulozie (anionit) i P-l 1 celulozie (kationit).

Materiały i odczynniki

1.    Supematant postrybosomalny z drożdży S. cerevisiae

2.    DEAE-celuloza (DE-52) i P-ll celuloza wyrównoważone w buforze do preparatyki kinaz białkowych

3.    Bufor C (do preparatyki kinaz białkowych)

4.    0,2 M NaCl w buforze C

5.    0,4 M NaCl w buforze C

6.    0,7 M NaCl w buforze C

7.    Bufor C z dodatkiem 50% glicerolu

8.    Wąż dializacyjny

Wykonanie ćwiczenia

Chromatografia na DEAE-celulozie

1. Do 5 ml celulozy dodać odpowiednią ilość wysolonej na wcześniejszych ćwiczeniach frakcji cytoplazmatycznej, przyjmując, że 1 ml DE-52 wiąże 5 mg białka.