3110398613

Liofilizowane frakcje zawierające rozpuszczono w soli fizjologicznej do końcowego stężenia 10 mg/ml. Tak przygotowane roztwory wyjściowe przechowywano w temp. 4°C. Roztwory właściwe, bezpośrednio używane w doświadczeniach otrzymano przez rozcieńczenie roztworów wyjściowych w płynach hodowlanych z dodatkiem FBS.

Określanie aktywności antyproliferacyjnei frakcji polisacharydowych - test MTT

Test opracowano do określenia proliferacji i żywotności komórek w obecności substancji o właściwościach cytostatycznych i cytotoksycznych. W komórkach aktywnych metabolicznie dehydrogenaza mitochondrialna redukuje żółty, rozpuszczalny w wodzie MTT (bromek dimetylotetrazoliowy) do niebieskiego formazanu, który w postaci nierozpuszczalnych w wodzie kryształów gromadzi się w komórkach. Do rozpuszczenia formazanu wymagane jest użycie detergentu rozbijającego błonę komórkową i jednocześnie rozpuszczającego barwnik, w tym celu stosuje się bufor SDS - HC1 o pH 7.4. Stężenie uwolnionego barwnika mierzy się spektrometrycznie. Intensywność barwy jest wprost proporcjonalna do ilości żywych komórek.

Na płytki 96-dołkowe wylano komórki linii LSI80 i HT-29 o gęstości 3 x 10⁴ kom/ml w płynie hodowlanym z 10% FBS. Po 24 godzinach inkubacji z płytek delikatnie usunięto płyn hodowlany i dodano roztwory badanych substancji w płynie hodowlanym z dodatkiem 10% FBS (po 100 pl na dołek). W oznaczeniu użyto frakcji o stężeniach: 1; 10; 50; 100; 250 pg/ml.

Komórki hodowano 96 godzin w 37°C w inkubatorze z 5% przepływem CO2. Po tym czasie określono efekt działania badanych substancji za pomocą testu MTT. W tym celu do każdego z dołków na płytkach 96-dołkowych dano po 15 pl roztworu MTT (o stężeniu 5 mg/ml w PBS z jonami Ca²⁺ i Mg²⁺). Po 3 godzinach inkubacji w temp. 37°C, do każdego dołka dodano 100 pl buforu SDS-HC1 o pH 7.4. Płytki umieszczono na 24 godziny w inkubatorze (37°C, 5% CO2). Następnie odczytano gęstość optyczną przy długości fali 570 nm przy użyciu czytnika do mikropłytek ELx800 Absorbance Microplate Reader (BioTek).

Oznaczanie cvtotoksvczności frakcji polisacharydowych - test LDH

Oznaczenie zawartości dehydrogenazy mleczanowej (LDH) w płynie hodowlanym pobranym znad hodowli potraktowanej badaną substancją pozwala ocenić cytotoksyczny wpływ preparatów na komórki. Substancje toksyczne uszkadzają ich błony komórkowe i w konsekwencji powodują uwalnianie do płynu hodowlanego składników cytoplazmy, m.in. dehydrogenazy mleczanowej (enzym szlaku oddychania beztlenowego). Dość LDH uwolnionego do podłoża hodowlanego jest proporcjonalna do ilości komórek z uszkodzoną błoną komórkową. Metoda opiera się na redukcji NAD do NADH przez komórkową LDH. Powstały NADH reaguje z barwnikiem tetrazoliowym, który przekształca się w formazan, czemu towarzyszy zmiana barwy. Natężenie barwy jest proporcjonalne do ilości LDH