5192605646

36 A. KOZIK [4]

charakterystyczne m.in. dla enzymów allosterycznych (21, 22). Często stosowany, półilościowy sposób charakteryzowania kooperatywności w układach białko-ligand polega na podaniu tzw. współczynnika Hilla (23) tj. współczynnika n_H w równaniu

(równanie 5)

nk [L]"^H 1 + k [Lp

przy czym n_H ^ n. W przypadku kooperatywności ujemnej n_H < 1, w przypadku kooperatywności dodatniej n_H>l.

III. Chromatograficzne sączenie molekularne

III-l. Najprostsze zastosowania

W przypadkach, gdy tworzenie kompleksu białko-ligand jest procesem bardzo powolnym (24), izotermę wiązania można wyznaczyć w bardzo prosty sposób. Białko inkubuje się z ligandem do ustalenia równowagi, po czym oddziela się ligand wolny od białka zawierającego ligand związany (ryc. 1A). Z ilości ligandu we frakcji białkowej oblicza się wartości r i [L], odnoszące się do wyjściowej mieszaniny inkubacyjnej. Stanowią one współrzędne pojedynczego punktu izotermy.

Metodą tą wyznaczano m.in. parametry oddziaływania hormonów sterydowych z receptorami, przy zastosowaniu chromatografii na żelach Sephadex, zarówno kolumnowej (25—27) jak i cienkowarstwowej (28).

Jeżeli w trakcie chromatografii może występować częściowa dysocja-cja kompleksu białko-ligand, mierzone wartości r są systematycznie zaniżane. Powoduje to nie tylko błędy w oszacowaniu parametrów wiązania,

— — —~ — — —-— —

Objętość eluatu

Ryc. 1. Profile wymywania w metodach chromatograficznego sączenia molekularnego, wykorzystywanych do wyznaczania parametrów oddziaływania ligand-białko. A. Prosty rozdział ligandu związanego z białkiem od ligandu wolnego, B. Metoda Hummela i Dryera, C. Technika analizy czołowej. Z zakreskowanych obszarów na Ryc. A i B oblicza się ilość ligandu związanego z białkiem.