8009766952

ĆWICZENIE 1

Enzymy restrykcyjne i rekombinacja DNA itt vitro Część teoretyczna

Zjawisko restrykcji - modyfikacji

Zjawisko restrykcji i modyfikacji (RM) zostało po raz pierwszy opisane w latach pięćdziesiątych zeszłego wieku (Luria i Humań, 1952; Bertani i Weigle, 1953). Zaobserwowano, że namnażanie się bakteriofagów bywa w pewnym stopniu hamowane w zależności od rodzaju szczepu bakteryjnego podlegającego infekcji. Biochemiczne podłoże i enzymy odpowiedzialne za to zjawisko scharakteryzowali Arber i Dussoix (1962). W 1978 r. Werner Arber, Hamilton O. Smith i Daniel Nathans otrzymali Nagrodę Nobla w dziedzinie medycyna za odkrycie enzymów restrykcyjnych, które doprowadziło do rozkwitu technologii rekombinacji DNA.

W systemie RM wyróżnia się dwie aktywności enzymatyczne: endonukleolityczną (endonukleaza restrykcyjna, ang. restriction endonuclease, REaza) oraz modyfikującą (metylotransferaza DNA, metylaza DNA, ang. methy/transferase, MTaza), które rozpoznają w DNA tę samą, specyficzną sekwencję. MTaza modyfikuje określoną zasadę w sekwencji rozpoznawanej. Jeśli sekwencja docelowa nie jest zmetylowana, REaza przeprowadza cięcie endonukleolityczne DNA (Ryc. 1.1 i 1.2).

Zmodyfikowany genomowy DNA, w komórce posiadającej system RM, nie jest substratem dla REazy z tego systemu. Natomiast obcy DNA (np. infekującego faga) zostaje rozpoznany przez REazę i strawiony. Mechanizm obronny komórek bakteryjnych przed obcym DNA np. bakteriofagowym jest główną postulowaną funkcją systemów RM (Arber i Dussoix, 1962). Według innej hipotezy są one samolubnymi elementami genetycznymi, których utrzymanie w genomie jest warunkiem przetrwania - rodzaj systemu „trucizna-odtrutka” (Kobayashi, 2001). Sugeruje się też ich udział w utrzymywaniu tożsamości gatunkowej bakterii (Jeltsch, 2003) oraz, to, że przez indukowanie rearanżacji genomowych przyczyniają się do zróżnicowania genetycznego (Arber, 2000).

3