8857685808

Badanie oddziaływań białek - Drożdżowy system dwuhybrydowy 17

Badanie oddziaływań białek - Drożdżowy system dwuhybrydowy 17

UWAGA: P-merkaptoetanol i X-gal sa substancjami szkodliwymi, należy pracować w rękawiczkach! P-merkaptoetanol należy dodawać pod wyciągiem!

Materiały:

-    Bufor Z: 60 mM Na₂P0₄; 10 mM KC1; 1 mM

MgS0₄. pH 7,00    0]

-    Bufor Ż/X-gal: 100 ml buforu Z; 40 mM \J? p-merkaptoetanol; 1,67 ml X-gal z roztworu wyjściowego o stężeniu 20 mg/ml (P-merkaptoetanol i X-gal dodać tuż przed użyciem!)

Paski papieru półkredowego Krążki bibuły Whatmann dopasowane wielkością do średnicy szalki Puste szalki

2% X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolilo-p-D-galaktopiranozyd) rozpuszczony w dimetyloformamidzie Ciekły azot

stronie paska papieru. Każdy układ analizować na osobnej szalce.

9. Szalki inkubować w 37°C przez 12-24 godziny.

Dzień 2.

1.    Wyjąć szalki z cieplarki

2.    Zanalizować zabarwienie/brak zabarwienia na szalkach

3.    Zinterpretować otrzymany wynik

Otrzymane wyniki z testu dwuhybrydowego powinno się potwierdzać za pomocą innych metod. Jedną z nich jest technika „pull-down”. Polega ona na dodaniu do mieszaniny obu analizowanych białek, przeciwciała skierowanego przeciwko jednemu z nich. Jeżeli białka te oddziałują ze sobą można „wyciągnąć” (za pomocą jednego

Wykonanie: (ok. 30 minut)

1.    Przygotować roztwór 40 ml Z/X-Gal

2.    Na 2 lub 3 z rozprowadzonych kolonii drożdży z każdej z szalek

-WO-trp-leu,

-    WO-trp (kontrola negatywna)

-    WO-leu (kontrola negatywna)

-    WO-leu zawierającej drożdże z plazmidem pLC 1 (kontrola pozytywna)

przyłożyć pasek półkredowego papieru i delikatnie odcisnąć na jego kredowej stronie daną kolonię.

3.    Zdjąć paski z szalek, położyć oddzielnie każdy pasek stroną z drożdżami do góry na aluminiowej miseczce i zamrozić w ciekłym azocie

4.    Położyć paski na bibule (stroną z drożdżami do góry) do momentu rozmrożenia kolonii.

5.    W tym czasie przygotować 4 puste szalki (na koloniez szalek WO-trp, WO-trp-leu, dwie szalek WO-leu: kontroli negatywnej i pozytywnej),

6.    Wyciąć krążki bibuły (dopasowane do średnicy szalek) i wyłożyć po trzy krążki na każdą szalkę

7.    Warstwę bibuły nasączyć buforem Z/X-gal i zlać nadmiar buforu z szalki

8. Na tak przygotowane szalki wyłożyć paski bibuły z rozmrożonymi koloniami drożdży, tak aby kolonie drożdży znajdowały się na górnej