Biochemia ogólna i żywności
Biochemia ogólna i żywności
Opracował: mgr Jacek Borgulat
Opracował: mgr Jacek Borgulat
Kierunek: Dietetyka
Właściwości chemiczne białek i aminokwasów.
1. Cel ćwiczenia: zapoznanie studenta z wybranymi cechami fizyko-chemicznymi aminokwasów i
białek. Doskonalenie praktycznych umiejętności studenta, w zakresie posługiwania się szkłem
(probówka, pipeta szklana, pipeta automatyczna, cylinder miarowy, kolba miarowa, zlewka,
naczyńko wagowe, zakraplacz) oraz sprzętem laboratoryjnym (waga laboratoryjna, mieszadło
magnetyczne, łaz
nia wodna). Doskonalenie umiejętności praktycznych studenta w zakresie
sporządzania naważek oraz roztworów.
2. Wstęp teoretyczny: aminokwasy należą do dwufunkcyjnych pochodnych węglowodorów,
zawierających w cząsteczce grupę karboksylową oraz aminową. Na szczególną uwagę zasługują
ą -L- aminokwasy, ze względu na to, iż wchodzą w skład peptydów i białek. Określenie
ą -aminokwasy oznacza, iż obie główne grupy funkcyjne przyłączone są do tego samego,
I-rzędowego atomu węgla. ą  aminokwasy posiadają wzór ogólny w postaci:
H2N-CH(R)-COOH, gdzie R jest fragmentem zmiennym, charakterystycznym dla każdego
aminokwasu i decydującym o jego właściwościach. Jedną z istotniejszych cech aminokwasów jest
możliwość tworzenia (przy udziale odpowiednich biomolekuł) wiązań kowalencyjnych
(tzw.: wiązań peptydowych) dzięki którym powstają cząsteczki o wyższym poziomie organizacji:
peptydy, polipeptydy oraz białka. Ponadto aminokwasy mogą brać udział między innymi w takich
procesach fizjologicznych jak: przekaz
nictwo w układzie nerwowym (np.: glicyna, kwas gamma
aminomasłowy) oraz biosynteza: zasad azotowych, porfiryn oraz mocznika.
Białka należą do najbardziej złożonych związków chemicznych obecnych w przyrodzie. Ich
budowa wskazuje na pewne poziomy organizacji, stąd też dla precyzyjnego jej opisu
wprowadzono pojęcie struktury I, II ,III i IV rzędowej. Białka pełnią w organizmie bardzo wiele
funkcji w tym m. in: budulcową (wchodzą w skład wszystkich plazmatycznych struktur
komórkowych), enzymatyczną (są biokatalizatorami), transportującą (np.: hemoglobina),
lokomotoryczną (białka kurczliwe np.: aktyna), regulatorową (hormony białkowe), receptorową
(np.: rodopsyna) oraz odpornościową. Każde białko może pełnić swoją funkcję dzięki określonej
budowie przestrzennej a degradacja tej struktury wiąże się z jej utratą.
1
Śląska Wyższa Szkoła Medyczna w Katowicach
 Biochemia ogólna i żywności
Biochemia ogólna i żywności
Opracował: mgr Jacek Borgulat
Opracował: mgr Jacek Borgulat
3. Zagadnienia do kolokwium: budowa i reakcje charakterystyczne dla aminokwasów,
kryteria podziału aminokwasów, pojęcie punktu izoelektrycznego oraz jonu obojnaczego,
aminokwasy egzo i endogenne, wiązanie peptydowe oraz reakcje pozwalające na jego
wykrycie, poziomy organizacji białek, funkcje białek, denaturacja i wysalanie białek, szereg
liotropowy.
4. Ćwiczenia do wykonania:
I . Przykładowe reakcje charakterystyczne dla aminokwasów
Ćwiczenie 1. Reakcja ninhydrynowa.
Związki posiadające pierwszorzędową grupę aminową (w tym aminokwasy) w reakcji z
ninhydryną wytwarzają zasadę Schiffa, która następnie rozpada się z wytworzeniem pochodnej
aminoidenu (2  amino -3- hydroksyiden-1-onu). Aminokwasy białkowe w tej reakcji ulęgają
również reakcji dekarboksylacji, w wyniku której grupa karboksylowa ulega przekształceniu do
aldehydowej. Powstała pochodna aminoidenu reaguje następnie z kolejną cząsteczką
ninhydryny tworząc kolejną zasadę Schiffa o barwie fioletowo niebieskiej. Z aminami 2-go
rzędowymi ninhydryna tworzy sole iminowe o barwie żółto  pomarańczowej.
Sprzęt: probówki (5 sztuk), naczyńka wagowe, zlewki, zakraplacz, cylinder miarowy.
Odczynniki: (do przygotowania samodzielnie przez studentów  każdego odczynnika z
wyjątkiem roztworu ninhydryny należy przygotować po 25 ml, gdyż będą potrzebne do
następnych ćwiczeń) 1% roztwór glicyny, 1% roztwór alaniny, 1% roztwór proliny, 1% roztwór
białka jaja kurzego, 0,1% roztwór ninhydryny w acetonie (lub 50% etanolu).
Wykonanie: do czterech probówek dodać odpowiednio po 2 ml wcześniej sporządzonych jedno
procentowych roztworów: glicyny, alaniny, proliny i białka jaja kurzego. Do osobnej probówki
dodać 2 ml wody (próba ślepa). Następnie do wszystkich 5 probówek dodać po 0,5 ml roztworu
ninhydryny (ok. 4 krople). Następnie probówki umieścić we wrzącej łaz
ni wodnej i ogrzewać
przez 2 -3 minuty. Zanotować obserwacje i wyciągnąć odpowiednie wnioski.
Ćwiczenie 2. Reakcja aminokwasów z metalami ciężkimi.
Aminokwasy białkowe posiadają zdolność do tworzenia nierozpuszczalnych kompleksów
chelatowych z jonami metali ciężkich takich jak: Cd2+, Zn2+ czy Cu2+.
2
Śląska Wyższa Szkoła Medyczna w Katowicach
 Biochemia ogólna i żywności
Biochemia ogólna i żywności
Opracował: mgr Jacek Borgulat
Opracował: mgr Jacek Borgulat
Sprzęt: probówki (5 sztuk), naczyńka wagowe, zlewki, sączki, lejki, łaz
nia wodna, , cylinder
miarowy, waga laboratoryjna.
Odczynniki: (przygotowane w poprzednim ćwiczeniu) 1% roztwór glicyny, 1% roztwór
alaniny, 1% roztwór proliny, 1% roztwór białka jaja kurzego (można do niego dodać kilka mg
NaCl), CuCO .
3 (s)
Wykonanie: do czterech probówek dodać odpowiednio po 2 ml wcześniej sporządzonych 1%
roztworów: glicyny, alaniny, proliny i białka jaja kurzego. Do osobnej probówki dodać 2 ml wody
(próba ślepa). Następnie do wszystkich 5 probówek dodać po 0,1 g CuCO i ogrzewać do
3 (s)
wrzenia w łaz
ni wodnej. Po wyciagnięciu z łaz
ni i odczekaniu ok. 1 minuty, przesączyć.
Zanotować obserwacje i wyciągnąć odpowiednie wnioski.
Ćwiczenie 3. Badanie zachowania aminokwasów wobec mocnych kwasów i zasad
Sprzęt: probówki, zakraplacz, cylinder miarowy.
Odczynniki: 4 % r-r glicyny (lub innego obojętnego aminokwasu), 0,05M r-r H SO , 0,1M r-r
2 4
NaOH, oranż metylowy, fenoloftaleina.
Wykonanie: do opisanych probówek dodać odpowiednią ilość odczynników (H O, 4% r -r
2
glicyny  patrz schemat).
- wersja a. Następnie do wszystkich probówek dodać 1-2 krople oranżu metylowego. Do
probówki III i IV dodawać równymi porcjami 0,05M r-r H SO .
2 4
- wersja b. Następnie do wszystkich probówek dodać 1-2 krople fenoloftaleiny. Do probówki III
i IV dodawać równymi porcjami 0,1M r-r NaOH.
3
Śląska Wyższa Szkoła Medyczna w Katowicach
 Biochemia ogólna i żywności
Biochemia ogólna i żywności
Opracował: mgr Jacek Borgulat
Opracował: mgr Jacek Borgulat
4
Śląska Wyższa Szkoła Medyczna w Katowicach
 Biochemia ogólna i żywności
Biochemia ogólna i żywności
Opracował: mgr Jacek Borgulat
Opracował: mgr Jacek Borgulat
Przykładowe reakcje charakterystyczne dla białek
Ćwiczenie 4. Denaturacja białek
Pod wpływem mocnych kwasów i zasad, wysokiej temperatury, soli metali ciężkich,
niskocząsteczkowych alkoholi i aldehydów, białka wytrącają się z roztworów w sposób
nieodwracalny. Zjawisko to nosi nazwę denaturacji białka i (najczęściej) jest nieodwracalne. W
wyniku wspomnianych czynników następują zmiany w strukturze drugo- i trzeciorzędowej. Następuje
rozerwanie wiązań wodorowych i odsłonięcie grup funkcyjnych  SH i OH.
Rozpuszczalniki organiczne (np.: etanol, aceton, eter) i detergenty reagują bezpośrednio z
naładowanymi grupami na powierzchni białek dezorganizując tzw. płaszcz wodny. Działanie
denaturujące etanolu objawia się dopiero przy większych jego stężeniach, po dłuższym czasie
działania i w wyższej temperaturze (20-300C).
a) Denaturacja cieplna białek.
Sprzęt: probówki, naczyńka wagowe, zlewki, cylinder miarowy, łaz
nia wodna.
Odczynniki: 2,5 % roztwór białka jaja kurzego, 1% roztwór kwasu octowego, NaCl .
(s)
Wykonanie: do czystej probówki dodać 5 ml 5% roztworu białka jaja kurzego i umieścić
we wrzącej łaz
ni wodnej. Po zagotowaniu oziębić. Po zupełnym ostudzeniu dodawać kroplami
2,5% roztwór kwasu octowego lub dodać szczyptę stałego NaCl. Zanotować obserwacje i
wyciągnąć odpowiednie wnioski.
b) Denaturacja białek pod wpływem związków organicznych i nieorganicznych.
Sprzęt: probówki (6 sztuk), naczyńka wagowe, zlewki, cylinder miarowy waga
laboratoryjna.
Odczynniki: 2,5% r-r białka jaja kurzego, 96% r-r etanolu, 1M r-r H2SO4, 1M r-r NaOH,
1% roztwór FeCl3, 10% r-r CuSO4, 0,01M NaOH.
5
Śląska Wyższa Szkoła Medyczna w Katowicach
 Biochemia ogólna i żywności
Biochemia ogólna i żywności
Opracował: mgr Jacek Borgulat
Opracował: mgr Jacek Borgulat
Wykonanie: Wykonanie: do 4 oznaczonych probówek dodać po 2 ml roztworu białka.
Następnie dodawać kroplami (1-2ml):
Probówka I: 96% etanol,
Probówka II: 1M r-r H2SO4,
Probówka III: 1M r-r NaOH,
Probówka IV: 1 % roztwór FeCl3,
Probówka V: 10% r-r CuSO4 a następnie dodać 0,01M NaOH,
Probówka VI: aceton.
Zanotować obserwacje i wyciągnąć odpowiednie wnioski.
W przypadku probówki V roztwór powinien zmienić zabarwienie z koloru niebieskiego na fioletowy
(max = 505 nm). Jest to spowodowane powstawaniem anionowych związków kompleksowych, w
których jon Cu2+ jest kompleksowany przez minimum dwie grupy peptydowe. Reakcja ta nosi nazwę
próby biuretowej i służy do wykrywania wiązania peptydowego występującego m. in.: w białkach,
peptydach oraz moczniku.
Ćwiczenie 5. Wysalanie białek
Rozpuszczalność białek jest zależna od ilości ładunków wszystkich rodzajów jonów znajdujących się
w roztworze. Wartości te określają tzw. siłę jonową roztworu. Rozpuszczalność białka w wodzie
destylowanej jest bardzo mała, natomiast rośnie wraz ze wzrostem siły jonowej, gdy wzrośnie liczba
jonów nieorganicznych na powierzchni białka zapobiegających ich agregacji. Zjawisko to nazywa się
wysalaniem lub zasalaniem. Przy odpowiednio dużej sile jonowej, sól odciąga cząsteczki wody od
powierzchni białek i doprowadza do ich agregacji. Zjawisko to nosi nazwę wysalania białka. Białko(a)
wysolone rozpuszcza się ponownie po usunięciu soli lub po rozcieńczeniu roztworu. Zdolność
wysalająca soli zależy zarówno od charakteru kationu, jak i anionu. Ze względu na siłę wysalającą
można uszeregować kationy i aniony w następujący sposób:
Aniony: cytrynian3- > winian2-> siarczan2- > octan- > chlorek- > azotan- > rodanek-
Kationy:Th3+> Al2+> Se2+> Sr2+> Ca2+> Mg2+> NH4+> Na+> Li+
Szeregi te noszą nazwę szeregów liotropowych lub szeregów Hofmeistera.
6
Śląska Wyższa Szkoła Medyczna w Katowicach
 Biochemia ogólna i żywności
Biochemia ogólna i żywności
Opracował: mgr Jacek Borgulat
Opracował: mgr Jacek Borgulat
Sprzęt: probówka (2 sztuki), naczyńka wagowe, zlewki, waga laboratoryjna, cylinder miarowy.
dczynniki: 2,5% r-r białka jaja kurzego, NaCl , CaCl (s).
(s) 2
Wykonanie: Wykonanie: do 2 probówek dodać po 2 ml 2,5% r-r białka roztworu białka. Następnie
dodawać równymi małymi porcjami (0,1  0,5g) do probówki 1 NaCl , do probówki 2 CaCl (s). Po
(s) 2
dodaniu soli do obydwu probówek każdorazowo potrząsnąć w celu wymieszania. Czynność
powtarzać aż do wytrącenia się osadów. Następnie do obydwu probówek dodać ok. 8 ml H O.
2
Zanotować obserwacje i wyciągnąć odpowiednie wnioski.
5. Warunkiem zaliczenia ćwiczeń jest obecność na ćwiczeniach oraz wykonanie przez każdego
studenta sprawozdania zawierającego:
a. Wstęp teoretyczny
b. Materiały i metody
c. Wyniki
d. Obserwacje
e. Wnioski
f. Piśmiennictwo
6. Zalecana literatura:
1. Bańkowski E.: Podręcznik dla studentów studiów licencjackich i magisterskich. Medpress,
Piaseczno 2006
2. Hames B.D., Hooper N.M., Houghton J.D.: Krótkie wykłady z biochemii. PWN, Warszawa
2002
3. Kłyszejko L.: Ćwiczenia z biochemii. WN PWN, Warszawa 2005.
4. Murray R.K., Granner D.K., Mayes P.A., Rodwell V.W.: Biochemia Harpera, wydanie 4.
PZWL, Warszawa 2008
5. Włodek L.: Biochemia. Ćwiczenia praktyczne dla studentów Wydziału Farmaceutycznego.
Wydawnictwo Uniwersytetu Jagiellońskiego, Kraków 2000.
7
Śląska Wyższa Szkoła Medyczna w Katowicach