PuÅ‚apkowanie spinowe tlenku azotu Przygotowanie do ćwiczenia: Fizyczne podstawy elektronowego rezonansu paramagnetycznego (ERP). Parametry widma ERP. OddziaÅ‚ywanie nadsubtelne (3,4). WstÄ™p W niektórych sytuacjach detekcja paramagnetyków metodÄ… ERP jest niemożliwa. Powodem może być duża reaktywność danego zwiÄ…zku (krótki czas życia) albo poszerzenie sygnaÅ‚u (krótkie czasy relaksacji). W tego typu przypadkach czÄ™sto stosuje siÄ™ technikÄ™ puÅ‚apkowania spinowego. Polega ona na obserwacji widma ERP tzw. adduktu spinowego, który powstaje w reakcji badanej czÄ…steczki paramagnetycznej z puÅ‚apkÄ… spinowÄ…. PuÅ‚apkÄ… spinowÄ… może być dowolna substancja egzo- lub endogenna zdolna do tego typu reakcji. Addukty spinowe cechujÄ… siÄ™: * charakterystycznym i Å‚atwym w detekcji sygnaÅ‚em ERP * dużą stabilnoÅ›ciÄ… w porównaniu z substancjÄ… puÅ‚apkowanÄ… W ukÅ‚adach biologicznych najczÄ™stszymi substancjami badanymi z wykorzystaniem puÅ‚apkowania spinowego sÄ… wolne rodniki, a zwÅ‚aszcza anionorodnik ponadtlenkowy i tlenek azotu (1). Tlenek azotu staÅ‚ sie w ostatnich latach przedmiotem zainteresowania przedstawicieli różnych dyscyplin naukowych. WiÄ…zaÅ‚o siÄ™ to m.in. z odkryciem, że NO peÅ‚ni istotnÄ… rolÄ™ w utrzymaniu homeostazy ukÅ‚adu krążenia, w przewodnictwie nerwowym oraz w niespecyficznej odpowiedzi obronnej organizmu (2, 5, 10). NO jest w normalnych warunkach paramagnetycznym gazem, dlatego może być mierzony za pomocÄ… techniki ERP. Niestety, sygnaÅ‚ wolnego NO widoczny jest tylko w przypadku pomiaru próbek gazowych. W roztworach wodnych sygnaÅ‚ ulega znacznemu poszerzeniu i w możliwych do uzyskania stężeniach, a tym bardziej niskich stężeniach fizjologicznych, jest niewykrywalny. WiÄ™kszość opracowanych metod polega na obserwacji specyficznych poÅ‚Ä…czeÅ„ NO z różnymi puÅ‚apkami spinowymi, zarówno endogennymi (np. hemoglobina, żelazo niehemowe), jak i egzogennymi (np. DETC - diethyldithiocarbamate, sól sodowa kwasu dietyloditiokarbamowego) (5). Podczas systematycznych badaÅ„ (z wykorzystaniem spektroskopii ERP) tkanek prawidÅ‚owych i nowotworowych w temperaturze ciekÅ‚ego azotu uzyskano bardzo charakterystyczne sygnaÅ‚y, które okreÅ›lono jako ''sygnaÅ‚y trypletowe'' (sygnaÅ‚y skÅ‚adajÄ…ce siÄ™ z trzech linii struktury nadsubtelnej, wynikajacej z oddziaÅ‚ywania 14 niesparowanych elektronów z jÄ…drami azotu N (I=1); tym mianem okreÅ›la siÄ™ potocznie sygnaÅ‚y nitrozohemoprotein). Interpretacja genezy tych sygnałów przez dÅ‚ugie lata byÅ‚a dość ogólnikowa. W każdym razie nie dopatrywano siÄ™ żadnego zwiÄ…zku pomiÄ™dzy sygnaÅ‚ami trypletowymi, a funkcjonowaniem ukÅ‚adu odpornoÅ›ciowego. Sytuacja ta zmieniÅ‚a siÄ™ w latach 80-tych, gdy okazaÅ‚o siÄ™, że cytotoksycznie aktywowane makrofagi produkujÄ… tlenek azotu (5, 9). Analiza struktury widma ERP biaÅ‚ek hemowych (5, 8) Badania nad tym zagadnieniem pomogÅ‚y w rozszyfrowaniu natury chemicznej zwiÄ…zków, które mogÄ… być zródÅ‚em sygnałów trypletowych. Przede wszystkim wykazano, że 3 linie widma ERP jakie pojawiajÄ… siÄ™ po zmieszaniu hemoglobiny z tlenkiem azotu nie stanowiÄ… niezależnych sygnałów singletowych, lecz sÄ… trzema skÅ‚adnikami struktury nadsubtelnej tego samego sygnaÅ‚u ERP. NastÄ™pnie udowodniono, że przesuniÄ™cie wartoÅ›ci g (współczynnika spektroskopowego rozszczepienia, charakteryzujÄ…cego oddziaÅ‚ywanie centrów paramagnetycznych danego typu z zewnÄ™trznym polem magnetycznym) wzglÄ™dem g wolnorodnikowego, spowodowane jest lokalizacjÄ… elektronu w sÄ…siedztwie ciężkiego jÄ…dra, które zidentyfikowano jako żelazo 57 Fe. Tak wiÄ™c, zródÅ‚em omawianego sygnaÅ‚u ERP jest kompleks tlenku azotu z hemoglobinÄ…, przy czym tlenek skompleksowany jest z żelazem w szóstej pozycji koordynacyjnej, tam gdzie zwykle obecny jest tlen lub czÄ…steczka wody (rys.1). W tym ukÅ‚adzie niesparowany elektron, pochodzÄ…cy od czÄ…steczki NO, zlokalizowany jest na orbitalu wewnÄ™trznej powÅ‚oki jonu dwuwartoÅ›ciowego żelaza hemowego. Nitrozohemoglobina, czyli hemoglobina ze skompleksowanym tlenkiem azotu, zrobiÅ‚a karierÄ™ jako model w badaniach nad oddziaÅ‚ywaniem biaÅ‚ek hemowych z ligandami, a zwÅ‚aszcza tlenem i tlenkiem wÄ™gla. OkazaÅ‚o siÄ™, że kompleks Hb-NO jest okoÅ‚o 1000 razy trwalszy niż z Hb-CO, a 500 000 razy trwalszy, niż Hb-O2 (10). Kompleksy NO z hemoproteinami (nitrozylohemowe) wystÄ™pujÄ… w formie szeÅ›ciokoordynacyjnej, której odpowiada szeroki sygnaÅ‚ ERP oraz piÄ™ciokoordynacyjnej, dajÄ…cej sygnaÅ‚ trypletowy. ''Tryplet'' pojawia siÄ™ jako efekt zwiÄ™kszenia prawdopodobieÅ„stwa lokalizacji elektronu na azocie, gdy biaÅ‚kowa część czÄ…steczki jest zmodyfikowana np.przez: dehydratacjÄ™ czÄ…steczki, siarczan dodecydu sodu lub szeÅ›ciofosforan inozytolu (IHP). Jest wysoce prawdopodobne, że czynniki modyfikujÄ…ce kompleks Hb-NO zaburzajÄ… system His-Fe-NO wywoÅ‚ujÄ…c zmiany w konformacji czÄ…steczki biaÅ‚kowej- stwierdzono to dla szeÅ›ciofosforanu inozytolu. IHP powoduje rozerwanie wiÄ…zania miÄ™dzy atomem żelaza ukÅ‚adu hemowego i histydynÄ… Å‚aÅ„cucha peptydowego. WedÅ‚ug innej teorii sygnaÅ‚ z trzema liniami rozszczepienia nadsubtelnego pochodzi od znieksztaÅ‚conego kompleksu szeÅ›ciokoordynacyjnego, w którym wiÄ…zanie Fe-His nie jest rozerwane ale znacznie wydÅ‚użone. Badania nitrozowanych podjednostek Ä… i ² hemoglobiny oraz wpÅ‚ywu IHP na ich strukturÄ™ wykazaÅ‚y, że jedynie kompleksy NO z hemem Å‚aÅ„cucha Ä… mogÄ… wykazywać trzy linie struktury nadsubtelnej. Ponadto modelowe badania kompleksów nitrozohemoglobiny wykazaÅ‚y, że staÅ‚e asocjacji NO z podjednostkami Ä… i ² sÄ… jednakowe, natomiast różnice dotyczÄ… staÅ‚ych dysocjacji. Na ustalanie siÄ™ równowagi w kompleksach nitrozohemoglobiny w wyniku przemieszczania siÄ™ NO miÄ™dzy podjednostkami Ä… i ² wpÅ‚ywa także pH. Przemieszczanie siÄ™ ligandu nastÄ™puje przy pH wynoszÄ…cym okoÅ‚o 6, przy pH >8 proces ten nie zachodzi. Bardzo istotnym czynnikiem wpÅ‚ywajÄ…cym na stosunek kompleksów piÄ™ciokoordynacyjnych, którym odpowiada sygnaÅ‚ trypletowy, do szeÅ›ciokoordynacyjnych (sygnaÅ‚ szeroki) jest wysycenie hemoglobiny tlenkiem azotu (hemoglobina jest wysycona tlenkiem azotu gdy wszystkie jej podjednostki wiążą NO). Zmniejszeniu sygnaÅ‚u trypletowego towarzyszy nasilenie sygnaÅ‚u szerokiego wraz ze zwiÄ™kszaniem siÄ™ wysycenia hemoglobiny tlenkiem azotu. Struktura widma ERP żelaza niehemowego w ukÅ‚adach biologicznych (5, 6, 8) W widmach ERP kompleksów NO z żelazem niehemowym obserwujemy sygnaÅ‚ anizotropowy. Przeprowadzono również w tym przypadku liczne obserwacje tego sygnaÅ‚u w tkankach nowotworowych i zdrowych organach oraz analizÄ™ jego cech. W przypadku kompleksu z żelazem niehemowym oddziaÅ‚ywanie jonu centralnego jest tak silne, że niesparowany elektron przesuwa siÄ™ caÅ‚kowicie w jego obrÄ™b, caÅ‚ość uzyskuje charakter jonu paramagnetycznego, a sygnaÅ‚ takiego kompleksu nie posiada w ogóle struktury nadsubtelnej. Badania te doprowadziÅ‚y do stwierdzenia, że centrami paramagnetycznymi odpowiedzialnymi za wspomniany sygnaÅ‚ anizotropowy sÄ… dinitroksylowe kompleksy żelaza (DNIC) z endogennymi ligandami zawierajÄ…cymi grupy SH. Tlenek azotu zwiÄ…zany z żelazem wystÄ™puje w postaci jonu nitrozoniowego (NO+) (rys. 2). WiÄ™kszość DNIC zwiÄ…zana jest z grupami sulfhydrylowymi w biaÅ‚kach. W komórce powstajÄ… także niskoczÄ…steczkowe kompleksy DNIC z ligandami tiolowymi np. cysteinÄ…, jednak ich ilość jest bardzo maÅ‚a w porównaniu z kompleksami biaÅ‚kowymi. Problemem, który budzi znaczne kontrowersje, jest pochodzenie żelaza wystÄ™pujÄ…cego w DNIC. WedÅ‚ug niektórych autorów pochodzi ono z biaÅ‚ek żelazowo-siarkowych, głównie z mitochondrialnego Å‚aÅ„cucha przenoÅ›ników elektronów. BiaÅ‚ka te po przyÅ‚Ä…czeniu NO ulegajÄ… inaktywacji. Jednak inni badacze uważajÄ…, że w tworzeniu DNIC bierze udziaÅ‚ głównie luzno zwiÄ…zane żelazo i grupy sulfhydrylowe różnych biaÅ‚ek. Za tÄ… drugÄ… koncepcjÄ… przemawia fakt, iż wiÄ™kszość powstajÄ…cych w komórkach kompleksów DNIC nie jest zlokalizowana w mitochondriach, lecz w cytozolu. Na podstawie wiedzy jakÄ… dysponujemy obecnie nie można jednoznacznie okreÅ›lić charakteru żelazowych centrów wiążących NO w komórce. Nie ma caÅ‚kowitej pewnoÅ›ci, czy obserwowane za pomocÄ… spektroskopii ERP kompleksy nitrozylożelazowe bezpoÅ›rednio wyrażaja wywoÅ‚ane przez NO uszkodzenia komórki. MogÄ… być jednak dobrym jego wyznacznikiem. Literatura 1. "Spin Labeling. Theory and Applications" w Biological Magnetic Resonance, vol. 8, pod redakcjÄ… L.J. Berliner, J. Renben, Plenum, New York, NJ, 1989 2. A. DembiÅ„ska-Kieć, "Biosynteza i fizjologiczna funkcja tlenku azotu", w Molekularne mechanizmy przekazywania sygnałów w komórce, pod red. L. Konarskiej, rozdziaÅ‚ 10, str. 177-189, PWN, Warszawa, 1995 3. Z. KÄ™cki, "Podstawy spektroskopii molekularnej", PWN, Warszawa 1992 4. S.J. Aukiewicz, "Spektroskopia in vivo elektronowego rezonansu paramagnetycznego w biologii i medycynie", w Problemy biocybernetyki i inżynierii biomedycznej, pod red. M. NaÅ‚Ä™cza, tom 2 Biopomiary, str.329-366, Wydawnictwa Komunikacji i AÄ…cznoÅ›ci, Warszawa, 1990 5. Nitric Oxide in Transplant Rejection and Anti-Tumor Defense, pod redakcjÄ… S. Lukiewicz, J.L. Zweier, Kluwer Academic Publishers, Boston, MA, USA, 1998 6. Nitric Oxide. Principles and Actions, J. Lancaster, Jr. (red.), Academic Press, New York, NJ, USA, 1996 7. M. Lomnicka, W.K. Subczynski, "Spin-label NO-metry", Curr. Top. Biophys., 21, str.. 76-80, 1996 8. B. PÅ‚onka, Monitorowanie generacji tlenku azotu przez makrofagi w funkcji stanu ukÅ‚adu odpornoÅ›ciowego i rodzaju gospodarza, Praca doktorska, UJ Kraków, 1998 9. P. PÅ‚onka, Analiza mechanizmu interakcji pomiÄ™dzy nowotworem a organizmem jego gospodarza metodÄ… elektronowego rezonansu paramagnetycznego, Praca doktorska, UJ Kraków, 1993 10. G. Stochel, M. Pawelec, Z. Stasicka, "Wybrane aspekty chemii i biochemii tlenku azotu", WiadomoÅ›ci chemiczne, 51, str. 163-188, 1997 Wykonanie ćwiczenia Ćwiczenie obejmuje: I PuÅ‚apkowanie spinowe NO przez hemoglobinÄ™; II PuÅ‚apkowanie spinowe NO przez żelazo niehemowe; III PuÅ‚apkowanie spinowe NO w materiale biologicznym. Przebieg ćwiczenia (wg 9): 1) MateriaÅ‚y Odczynniki: a. 50 mg hemoglobiny (Hb) b. 10 mg chlorku żelaza (FeCl2 * 4H2O) c. 5 mg azotynu sodowego (NaNO2) d. 200 mg ditionianu sodowego (Na2S2O4) e. 50 ml PBS (phosphate buffered saline - zbuforowana sól fizjologiczna) UWAGA ! Przed użyciem PBS należy przedmuchać azotem lub argonem przez 30 min (w celu usuniÄ™cia tlenu) SprzÄ™t laboratoryjny: a. cylinder o pojemnoÅ›ci 50 ml (na PBS) b. pipeta pasteurowska (do przedmuchania PBS) c. 4 szklane homogenizatory (maÅ‚e) d. pipety z koÅ„cówkami jednorazowymi (0.1-1 ml, 1-5 ml) e. zamykane naczynka szklane o pojemnoÅ›ci 1-5 ml (11-15 szt.) f. rurki ze szkÅ‚a o podwyższonej wytrzymaÅ‚oÅ›ci na różnice temperatur o wymiarach: dÅ‚ugość okoÅ‚o 4 cm i wewnÄ™trzna Å›rednica 4mm g. parafilm h. zestaw narzÄ™dzi chirurgicznych i. kilka szalek Petriego j. ciekÅ‚y azot k. termos z szerokim otworem do zamrażania próbek w ciekÅ‚ym azocie l. kwarcowy Dewar palcowy do pomiarów ERP Aparatura: a. spektrometr ERP pracujÄ…cy w paÅ›mie X b. waga laboratoryjna Jako materiaÅ‚ nowotworowy mogÄ… być użyte lite guzy biaÅ‚aczki limfatycznej L5178Y-R rosnÄ…ce u gospodarza syngenicznego, inbredowego (myszy DBA/2) i gospodarza allogenicznego, outbredowego (myszy Swiss) ze wzglÄ™du na duże różnice w intensywnoÅ›ci sygnałów ERP. Standardowa technika uzyskiwania guzów tej biaÅ‚aczki polega na wszczepieniu podskórnym 20 milionów komórek. Ćwiczenie należy przeprowadzić w 11-tym dniu rozwoju choroby nowotworowej. Inny możliwy do wykorzystania w tym ćwiczeniu nowotwór to mysia melanoma Cloudman S91. UWAGA! Należy uzyskać zezwolenie na wykorzystanie zwierzÄ…t laboratoryjnych do celów dydaktycznych (1 mysz DBA/2 i 1 mysz Swiss na grupÄ™). 2) Przygotowanie próbek: Nr próbki Zawartość próbek 1 11 mg Hb 0.1ml pr.11 0.9 ml PBS 2 11 mg Hb 0.1ml pr.11 0.5 ml PBS 0.4 ml pr.14 3 11 mg Hb 0.1 ml pr.11 0.5 ml PBS 0.4 ml pr.15 42 mg FeCl2 0.1 ml pr.11 0.9 ml PBS 52 mg FeCl2 0.1 ml pr.11 0.5 ml PBS 0.4 ml pr.14 62 mg FeCl2 0.1 ml pr.11 0.5 ml PBS 0.4 ml pr.15 7 homogenat guza* 0.1 ml pr.11 8 homogenat guza* 0.1 ml pr.11 0.4 ml pr.14 9 homogenat guza** 0.1 ml pr.11 10 homogenat guza** 0.1 ml pr.11 0.4 ml pr.14 11 118 mg Na2S2O4 2 ml PBS 12 21 mg Na2S2O4 5 ml PBS 13 3 mg NaNO2 5 ml PBS 14 3 ml pr.13 2 ml pr.12 15 pr.14 (200 razy rozcieÅ„czona) * guz pochodzÄ…cy od gospodarza DBA/2, ** guz pochodzÄ…cy od gospodarza Swiss Kolejne czynnoÅ›ci: 1. ponumerować naczynka i szklane rurki (1-10) 2. rurki zawinąć szczelnie z jednej strony parafilmem 3. odważyć Hb, FeCl2 oraz NaNO2 i rozpuÅ›cić w PBS 4. uÅ›pić zwierzÄ™ta (przedawkowanie barbituranu albo asfyksja azotem) 5. wyciąć guzy, odważyć po 800 mg na próbkÄ™ a nastÄ™pnie poddać je homogenizacji (nie ma potrzeby przenoszenia homogenatu, homogenizatory można wykorzystać jako naczynka 7-10) UWAGA ! Na2S2O4 odważyć bezpoÅ›rednio przed dodaniem PBS (aby siÄ™ nie utleniÅ‚) i jak najszybciej (pipetÄ…) przenieść do odpowiednich naczynek 6. 118 mg Na2S2O4 rozpuÅ›cić w 2 ml PBS, a nastÄ™pnie dodać po 0.1 ml do próbek1-10 (redukcja próbek) 7. 21 mg Na2S2O4 rozpuÅ›cić w 5 ml PBS i dodać 2 ml do pr. 14 (redukcja azotynu) 8. rozcieÅ„czyć pr. 14 (200 razy) 9. dodać po 0.4 ml pr. 14 do naczynek 2, 5, 8, 10 oraz po 0.4 ml pr. 15 do naczynek 3 i 6 Po przygotowaniu próbek (nr 1 10) 0.4 ml każdej z nich umieÅ›cić w osobnej szklanej rurce, a nastÄ™pnie zamrozić w temperaturze 77 K (Uwaga! Należy ograniczyć do minimum czas od przygotowania próbek w naczynkach do przeniesienia ich do rurek i wreszcie zamrożenia). Pomiary wykonać na spektrometrze ERP z użyciem kwarcowego Dewara palcowego do badaÅ„ w temperaturze ciekÅ‚ego azotu. Zarejestrować widma ERP próbek 1-10, przy parametrach: amplituda modulacji 0.5 mT (w razie sÅ‚abych sygnałów 1 mT), pole 328Ä…25 mT, czÄ™stotliwość mikrofal 9.5 GHz, moc 20 mW. Opracowanie wyników: A) 6 zmierzyć amplitudÄ™ sygnałów trypletowych (II linia struktury nadsubtelnej) 6 przeliczyć wszystkie amplitudy na to samo wzmocnienie 6 przedstawić w tabelce: nr próbki zawartość sygnaÅ‚ sygnaÅ‚ amplituda sygnaÅ‚u UWAGI próbki "trypletowy" "anizotropowy" "trypletowego" (+/-) (+/-) przeliczona na to samo wzmocnienie B) Odpowiedzieć na pytania: 1. W jakim celu dodajemy dwutionian? Czy musimy go dokÅ‚adnie odważyć? 2. Z czego wynikajÄ… różnice sygnaÅ‚u ERP kompleksów Hb i FeCl2 z NO? Co można sÄ…dzić na temat siÅ‚y kompleksowania? 3. Z czego wynikajÄ… różnice pomiÄ™dzy sygnaÅ‚ami ERP z "nadmiarem" i "niedomiarem" NO? 4. Co można sÄ…dzić na temat natężenia produkcji NO w badanej tkance nowotworowej? 5. Jakie rodzaje puÅ‚apek spinowych NO wystÄ™pujÄ… w badanej tkance nowotworowej? 6. Czy ilość puÅ‚apek w badanej tkance nowotworowej jest nadmiarowa? Uzasadnij. 7. Które z badanych próbek peÅ‚niÄ… rolÄ™ kontroli negatywnych, a które kontroli pozytywnych?