• Ćw 57. Pomiar widma absorpcji stężenia ryboflawiny w roztworach wodnych za pomocą spektrofotometru.

Światło (promieniowanie optyczne) jest w spektroskopii przedziałem długości fal elektromagnetycznych obejmującym fale widzialne (Vis), podczerwień (IR) i ultrafiolet (UV). Oddziaływanie światła z substancją obserwuje się zazwyczaj jako zjawiska załamania, odbicia, pochłaniania i rozproszenia.

Światło ulega osłabieniu podczas przejścia przez substancję. Jeżeli strumień świetlny o natężeniu I₀ pada na substancje, to część energii może ulec odbiciu (I₁), rozproszeniu (I₂) i absorpcji (I₃), a pozostała ilość energii przechodzi (I).

I₀ = I₁ + I₂ + I₃ +I

Zazwyczaj zjawiska odbicia, rozproszenia i absorpcji występują jednocześnie. Jeżeli jednak I₁ + I₂ << I₃ to możemy mówić, że zachodzi tylko zjawisko absorpcji światła.

Zmiana natężenia światła -dI przy przejściu przez warstwę o dowolnie małej grubości dl w roztworze, w którym stężeniu substancji pochłaniającej wynosi c, wyraża się wzorem:

-dt =  c I dl

gdzie  jest współczynnikiem absorpcji. Z tego równania można wyliczyć natężenie światła przechodzącego.

I = I₀ e ^-cl

Jest to prawo Lamberta-Beera, które mówi, że natężenie światła przechodzącego przez roztwór substancji absorbującej zależy od natężenia światła padającego, stężenia i grubości warstwy roztworu oraz od współczynnika absorpcji. Współczynnik absorpcji jest wielkością charakteryzującą właściwości absorpcyjne substancji.

lg
c lg e

Wprowadzając oznaczenie

lg
A (absorbancja) i  lg e = (molowy współczynnik absorpcji)

można napisać:

A = cl

W spektroskopii wielkość ta nosi nazwę absorbancji (A), ekstynkcji (E) lub gęstości optycznej (D). Stosunek natężeń wiązek świetlnych można łatwo zmierzyć, dlatego absorbancja jest podstawową wielkością optyczną, którą wyznacza się doświadczalnie.

Molowy współczynnik absorpcji  ma taki sam sens fizyczny jak współczynnik absorpcji . Współczynnik absorpcji  liczbowo jest równy absorbancji warstwy roztworu o jednostkowej grubości i jednostkowym stężeniu.

Inną wielkością używaną w spektroskopii jest transmitancja T wyrażona w %.

Związek między transmitancją a absorbancją jest następujący

Substancje w różny sposób absorbują światło o różnej częstotliwości. Dlatego współczynnik ekstynkcji  jest funkcją częstotliwości lub inaczej długości fali.

Zależność współczynnika absorpcji  od długości fali lub częstotliwości nazywa się widmem absorpcji. Jest ono charakterystyczne dla danej substancji w danych warunkach fizykochemicznych.

Typowymi przyrządami do pomiaru widm absorpcji są różnego rodzaju spektrofotometry, za pomocą których można zmierzyć ekstynkcję badanej substancji w zależności od długości fali lub częstotliwości światła absorbowanego. Widmo absorpcji można również badać dowolnym zestawem pomiarowym, który pozwoli wyznaczyć E = f().

Absorpcję światła widzialnego i ultrafioletu przez cząsteczki wykorzystuje się w badaniach biologicznych i technologicznych do:

 analizy jakościowej substancji; z położenia maksimum pasm absorpcji można wnioskować o tych parametrach określających strukturę substancji, które są związane z elektronami  i σ.

• analizy ilościowej; z wartości absorbancji A wyznacza się stężenie substancji, co stanowi podstawę analizy ilościowej. Jest to metoda zwana spektrofotometrią absorpcyjną. Jeżeli w metodzie tej wykorzystuje się światło widzialne to często nazywa się ją metodą kolorymetryczną.

• Zestawienie pomiarów

Z roztworu o stężeniu 1*10^-5 mol/l korzystając ze wzoru:

gdzie:

C₀ =1*10^-5 mol/l − dane stężenie

V_x − potrzebna ilość danej substancji w celu uzyskania odpowiednich stężeń

C₁ − stężenie jakie chcemy uzyskać

V₀ = 10 ml − ilość substancji jaką chcemy uzyskać

uzyskaliśmy:

L p	C1 [mol/l]	Vx [ml]	Woda destylowana [ml]
1	1•10^-5	10	0
2	2•10^-6	8	2
3	3,5•10^-6	6,5	3,5
4	5•10^-6	5	5
5	6,5•10^-6	3,5	6,5
6	8,5•10^-6	1,5	8,5

Stężenie odczytane z wykresu:

dla E = f(C)

C = 4,7•10^-6 mol/l

dla T = f(C)

C = 2,4•10^-6mol/l

• Rachunek błędu:

Błędy wielkości odczytywanych:

E = 0,005 dla wielkości 0÷0,4

E = 0,001 dla wielkości 0,4÷1

T = 1%

 = 1 [nm]

Błąd pipety ±0,05 ml jedno nabranie cieczy

V₀ = 0,1 ml dwa nabranie cieczy

Błąd w obliczaniu stężeń dla wzoru:

Wyniki błędu obliczeń stężeń zestawione w tabeli powyżej.

Błąd odczytu stężeń odczytanych z wykresu wynosi:

dla E = f(C) oraz T = f(C):

C = 2•10^-7 − minimalna podziałka z jaką jest wyskalowana oś x czyli oś z zaznaczonymi stężeniami

Wyniki pomiarów:

Stężenie roztworu g/ml	Absorbancja A	Przepuszczalność T
1•10^-5	0,62	24%
8.5•10^-6	0,53	29%
6,5•10^-6	0,43	37%
5•10^-6	0,33	47%
3,5•10^-6	0,235	58%
2•10^-6	0,13	74%
Cx1	0,315	41%
Cx2	0,16	69%

Stężenie roztworu	λ ( nm)	E(A)	T
` 2•10^-6	400	0,08	83%
		410	0,095	80%
		420	0,105	78,5%
		430	0,125	75%
		440	0,13	74%
		450	0,125	75%
		460	0,115	77%
		470	0,10	80%
		480	0,095	80%
		490	0,04	91%
		500	0,035	93%
		510	0,01	98%
		520	0,005	99%

2

---