Ćwiczenie 07

MUTACJE I MUTAGENEZA.

Określanie mutagenności związków chemicznych - test Ames'a.

Dołączone materiały:

1. Test Ames'a jako standardowy test biologiczny służący do badania nowych związków chemicznych pod względem ich własności mutagennych (rys. 1, 2).

2. Podział mutacji genowych ze względu na charakter zmian wywoływanych w DNA (rys. 3).

3. Sposób działania mutagenów chemicznych i fizycznych (tab. 1).

4. Skutki mutacji punktowych na poziomie DNA, mRNA i białka (rys. 4).

Materiały:

1. Szczepy Salmonella typhimurium:

a) S. typhimurium TA 104
b) S. typhimurium TA 1538
c) S. typhimurium TA 1537.

2. Podłoża i bufory:

a) bufor fosforanowy
    Na₂HPO₄ (0,1M)     - 61 ml
    NaH₂PO₄ (0,1M)     - 39 ml
    pH = 7,0.

b) podłoże Davisa stałe
    K₂HPO₄    - 7,0 g
    KH₂PO₄    - 3,0 g
    Cytrynian Na₃ x 5H₂O    - 0,5 g
    Cytrynian Na₃ x 2H₂O    - 0,5 g
    MgSO₄ x 7H₂0    - 0,1 g
    (NH₄)₂SO₄    - 1,0 g
    H₂O dest.    - 1000 ml
    Agar    - 1,5 g
    Glukoza    - 0,2% dodać jałowo przed wylaniem podłoża.

c) LB płynne
    Bacto-tryptone    - 10 g
    Bacto-yeast extract    - 5g
    NaCl    -10 g
    H₂O dest.    -1000 ml
    pH = 7,0.

3. Roztwory mutagenów oraz składników wzbogacających podłoże minimalne:

a) mutageny
    0,2% 5- BUdR
    2% NTG
    10% HA
    0,5% OA

b)    składniki wzbogacające podłoże minimalne

Wykonanie:

1. Badając dany mutagen, dla każdego szczepu S. typhimurium przygotować 4 sterylne probówki z 0,5 ml buforu fosforanowego.

2. Do każdej probówki dodać 0,1 ml całonocnej bulionowej hodowli szczepu  S. typhimurium.

3. Do jednej probówki dodać 0,1 ml badanego mutagenu, do drugiej 0,05 ml, do trzeciej 0,025 ml, zaś czwartą pozostawić jako kontrolę mutacji spontanicznych.

4. Probówki umieścić w termostacie z wytrząsaniem w temperaturze 37°C na 20 min (preinkubacja).

5. Po inkubacji do każdej probówki dodać histydynę, biotynę i glukozę w ilościach podanych w tabeli powyżej.
   
   UWAGA! Z kontroli mutacji spontanicznych (bez mutagenu) pobrać 100µl - patrz pkt. 8.

6. Na koniec do każdej próby dodać 2 ml rozpuszczonego top-agaru (stałe podłoże Davisa), szybko wymieszać i wylać na płytki ze stałym podłożem Davisa.

7. Płytki inkubować w temperaturze 37°C przez 48 h. Po okresie inkubacji policzyć wyrosłe kolonie na wszystkich płytkach.

8. Z próby, stanowiącej kontrolę negatywną (bez dodatku mutagenu), wykonać szereg rozcieńczeń w płynie fizjologicznym aż do rozcieńczenia 10-8. Na płytki z agarem odżywczym wysiać po 0,1 ml rozcieńczeń 10^-5, 10^-6, 10^-7 i 10^-8. Płytki inkubować w temperaturze 37°C przez 48 h, a następnie policzyć kolonie i obliczyć liczbę bakterii w 1 ml badanej próby.

Zadania:

1. Ocenić czy badany związek ma właściwości mutagenne i jaki jest mechanizm jego działania.

2. Określić częstość rewersji u każdego szczepu S. typhimurium pod wpływem danego mutagenu.

TEST AMES'A - WPROWADZENIE

We współczesnym świecie liczba związków chemicznych znajdujących się w powszechnym użyciu jest niezwykle długa. Według szacunków jest wśród nich około 1500 substancji aktywnych stosowanych w pestycydach, 6000 substancji aktywnych znajdujących się w lekach, 3000 konserwantów stosowanych w produktach spożywczych, 2500 substancji o wartościach odżywczych i jeszcze około 50000 innych związków znajdujących się w codziennym użyciu. Niektóre z tych związków chemicznych mogą akumulować się w organizmie przez lata a następnie wywoływać działanie mutagenne. Ważne jest określenie, które ze stosowanych związków chemicznych, mogą stanowić zagrożenie dla ludzkiego zdrowia lub życia.

Rakotwórczość związków chemicznych można ustalać na podstawie badań epidemiologicznych. Są to jednak badania bardzo długie (trwają latami) i niezwykle drogie. Inną metodą są testy biologiczne na zwierzętach. Pozwalają na przewidywanie niebezpieczeństwa działania kancerogennego u ludzi, ale również są czasochłonne, drogie i niejednoznaczne etycznie (kilkaset zwierząt na jedno badanie). Z tych powodów, możliwość zastosowania szybkich i tanich testów biologicznych opartych na wykorzystaniu drobnoustrojów do wstępnej oceny potencjalnych mutagenów, stanowi bardzo cenną alternatywę.

Możliwość indukowania mutacji u różnych gatunków zwierząt przez czynniki fizyczne lub chemiczne sugeruje, że ludzie również mogą być wrażliwi na środowiskowe czynniki mutagenne. Pomimo różnic międzygatunkowych w metabolizmie ksenobiotyków, naprawie DNA i innych procesach fizjologicznych, które wpływają na częstość indukcji mutacji przez związki chemiczne, uniwersalność DNA jako materiału genetycznego uzasadnia stosowanie do przewidywania mutagenności badanych związków chemicznych tak różnych systemów badawczych jak bakterie, owady, zwierzęta doświadczalne i kultury komórek ssaków. Uzyskiwanie zbliżonych wyników w różnych testach pozwala na przewidywanie podobnych skutków genetycznych w odniesieniu do organizmu człowieka. Ogólna ocena efektu mutagennego polega na wykryciu zmian w materiale genetycznym wywołanych przez badany związek chemiczny lub czynnik fizyczny. W systemach bakteryjnych wynikiem może być zwiększona liczba kolonii bakteryjnych powstałych na skutek rewersji mutacji w szczepach zmutowanych, nie mogących tworzyć kolonii bez zewnętrznego źródła niezbędnego składnika, jakim może być np. aminokwas, taki jak np.: histydyna lub tryptofan. Zmiana barwy powstałych kolonii może również być wynikiem świadczącym o indukcji mutacji przez badany czynnik (test na aktywność β-galaktozydazy).

Istnieje wiele odmian testów badających częstość pojawiania się mutacji w DNA bakterii. Najczęściej stosowanym jest test Ames'a. Test ten jest wykorzystywany przez wiele laboratoriów i służy wykrywaniu mutacji powrotnych u bakterii Salmonella typhimurium. Otrzymane wyniki posłużyły do utworzenia licznych baz danych dotyczących właściwości mutagennych wielu związków chemicznych. Oprócz testu rewersji mutacji w histydyno-zależnych szczepach Salmonella, naukowcy opracowali inne szczepy bakteryjne, w których poprzez rewersję mutacji można oceniać mutagenny wpływ substancji chemicznych. Test na rewersję mutacji w systemie Escherichia coli lacZ został opracowany w 1990 roku. Jest on alternatywą dla testu Ames'a. Do oceny mutagenności zostały wykorzystane szczepy E. coli lacZ-. Bakterie z allelem lacZ- kodują nieaktywną formę β-galoktozydazy. W obecności laktozy jako źródła węgla, bakterie te wymagają do wzrostu aktywnej formy tego enzymu, który hydrolizuje laktozę do glukozy i galaktozy. Rewersja do formy lacZ+ pozwala na wzrost szczepów na podłożu zawierającym laktozę. Innym testem używanym w ocenie mutagenności substancji, jest test rewersji mutacji w systemie E. coli WP2. Procedura jest taka sama jak w teście Ames'a z tym, że wzrost bakterii wymaga tryptofanu a nie histydyny, ponieważ E. coli WP2 nie potrafią rosnąć na podłożu nie zawierającym tryptofanu w wyniku mutacji w operonie tego aminokwasu.
Standardowy test Ames'a oparty jest na wykorzystaniu zdolności do rewersji histydyno-zależnych auksotroficznych mutantów bakterii Salmonella typhimurium do form prototroficznych, które posiadają zdolność do wzrostu na podłożu minimalnym, pozbawionym czynnika wzrostowego (w tym przypadku aminokwasu L-histydyny). Skonstruowano wiele szczepów testowych zawierających różne mutacje w operonie biosyntezy histydyny (9 genów - 9 enzymów). Działanie czynnika mutagennego na komórki takiego szczepu może powodować rewersję mutacji dającą w efekcie przywrócenie funkcjonalnego genu i w konsekwencji, zdolności komórek do wzrostu na podłożu nie zawierającym histydyny.

Szczepy Salmonella typhimurium stosowane w teście Ames'a:

• TA 1535 - mutant z substytucją, która powoduje mutację mylną w genie kodującym pierwszy enzym w szlaku syntezy histydyny. Zmutowany enzym ma prolinę podstawioną w miejscu leucyny w normalnym białku;

• TA 100 - ma podobny defekt do szczepu TA 1535, ale wykrywa szerszy zakres mutagenów;

• TA 1537 - ma mutację typu przesunięcia ramki odczytu (delecja 1 nukleotydu) w innym genie niż TA 1535;

• TA 1538 - ma mutację typu przesunięcia ramki odczytu (insercja 1 nukleotydu) w tym samym genie co szczep TA 1537;

• TA 98 - jest podobny do szczepu TA 1538, ale wykrywa szerszy zakres mutagenów;

• TA 102 i TA 104 w miejscu zapisu rewersji zawierają mutacje ochre (kodon "stop").

Oprócz opisanych mutacji każdy z tych szczepów ma jeszcze dodatkowe mutacje takie jak:

1. Mutanty nie mają systemów naprawy uszkodzeń typu "reperacji przez wycinanie nukleotydów" - NER, które w dzikich szczepach są odpowiedzialne za naprawę uszkodzeń DNA powstałych pod wpływem mutagenów. W efekcie, uszkodzenia DNA powstałe pod wpływem kontaktu z badanym w teście Ames'a mutagenem nie są naprawiane i wszystkie mutacje punktowe są widoczne fenotypowo.

2. Mutanty posiadają defekty w budowie lipopolisacharydu (LPS) co pozwala na łatwiejszą penetrację związków chemicznych do wnętrza komórki w porównaniu z dzikim szczepem.

Podłoże minimalne używane do testu zawiera śladowe ilości histydyny dodawane tylko do tzw. top-agaru, tworzącego wierzchnią warstwę agaru. Te śladowe ilości histydyny są konieczne, ponieważ niektóre mutageny działają tylko na replikujące DNA. Kiedy mutanty Ames'a są wysiewane na takie podłoże, rosną tylko dotąd dokąd nie wyczerpią histydyny (2 - 3 podziały komórkowe trwające ok. w1 godziny) i tworzą ledwie widoczne zmętnienie w miękkim agarze. W przeciwieństwie do nich rewertanty tworzą duże kolonie, ponieważ ich wzrost nie jest limitowany ilością histydyny w podłożu.

Wiele związków chemicznych występujących w przyrodzie nie jest mutagenna dopóki nie zostanie skonsumowana przez zwierzę (lub człowieka). Jedną z przyczyn jest fakt, że w wątrobie w procesie detoksykacji niektórych związków chemicznych powstają związki, które są bardzo silnymi mutagenami. Z tego powodu wiele związków badanych w teście Ames'a powinno być rutynowo inkubowanych z wyciągiem z wątroby szczura (frakcja S9) w środowisku tlenowym, aby oksygenazy wątroby "aktywowały" badany związek. Dopiero zaktywowany związek powinien być stosowany do testu na bakteriach.

W ocenie mutagenności związków za pomocą testu Ames'a przyjmuje się, że mutagenem jest każdy związek, który indukuje powstanie dwukrotnie większej liczby mutantów (rewertantów) w stosunku do liczby mutantów spontanicznych.

 

rys. 1. Schemat standardowego testu Ames'a

 

rys. 2. Skrócona instrukcja wykonania mikropłytkowego testu Ames MPF Fluctuation Assay.

 

rys. 3. Podział mutacji genowych ze względu na charakter zmian wywoływanych w DNA

 

rys. 4. Skutki mutacji na poziomie DNA, RNA i białka

---