Chromatografia
Chromatografia jest techniką analityczną i preparatywną wykorzystującą rozdzielanie mieszanin substancji na poszczególne składniki, bądź ich grupy (frakcje), dzięki różnicom w zachowaniu się tych składników w układzie dwóch faz, w których jedna nie zmienia swego położenia (faza nieruchoma, stacjonarna), druga zaś porusza się względem pierwszej w określonym kierunku (faza ruchoma, roztwór rozwijający).
Podział chromatografii zależnie od dominującego mechanizmu procesu rozdziału:
a. adsorpcyjna - gdy fazą ruchomą jest ciecz lub gaz, a nieruchomą ciało stałe o właściwościach adsorbujących i odpowiednim rozdrobnieniu (np. żel krzemionkowy, tlenek glinowy, węgiel aktywny itp.). Rozdział jest powodowany różnicami współczynników adsorpcji.
b. podziałowa - gdy fazą ruchomą jest ciecz lub gaz, a stacjonarną ciecz zatrzymana na odpowiednim nośniku (bibuła, ziemia okrzemkowa, kulki szklane itp.). Rozdział jest wynikiem różnic współczynników podziału.
c. jonowymienna - gdy fazą ruchomą jest ciecz, a stacjonarną wymieniacz jonowy. Rozdział zależy od różnic w sile wiązania składników przez wymieniacz.
d. żelowa - gdy fazą ruchomą jest ciecz, a nieruchomą granulowany, jednorodny spęczniały żel. Rozdział jest powodowany różnicami w zdolnościach dyfundowania do cząsteczek żelu, a więc różnicami w wielkości cząsteczek składników.
Podział chromatografii w zależności od sposobu przeprowadzania rozdziału:
a) bibułowa (PC) której fazą nieruchomą jest odpowiednio przygotowana (np. zaimpregnowana ) specjalna bibuła chromatograficzna pocięta na arkusze, paski lub krążki. W pobliżu krawędzi arkusza bądź paska lub środka krążka nanosi się na tzw. punkt startowy (krople badanego roztworu), a następnie powoduje się przepływ fazy ruchomej, co prowadzi do rozdzielenia składników mieszaniny (tzw. rozwijanie chromatogramu). Proces odbywa się w odpowiednim szczelnym naczyniu tzw. komorze chromatograficznej. Po zakończeniu rozwijania otrzymuje się plamy (lub pasma) chromatograficzne poszczególnych składników (lub frakcji), które uwidacznia się, np. przez przeprowadzenie reakcji barwnych (tzw. wywoływanie chromatogramu), obserwację w świetle nadfioletowym itp. Przez porównanie z analogicznie wykonanym chromatogramem mieszaniny substancji wzorcowych identyfikuje się poszczególne składniki, a przez porównanie wielkości intensywności plam uzyskuje się wyniki ilościowe.
b. cienkowarstwowa(TLC) - w której fazę nieruchomą nanosi się w postaci cienkiej równomiernej warstewki na płytkę szklaną, arkusik folii aluminiowej czy tworzywa sztucznego. Dalsze postępowanie jest podobne jak w chromatografii bibułowej
c. kolumnowa - kolumnę (najczęściej szklaną) wypełnia się fazą nieruchomą (adsorbentem, nośnikiem nasyconym ciekłą fazą nieruchomą, jonitem, granulowanym żelem) i na jej szczyt wprowadza badany roztwór, a następnie fazę ruchomą (eluent). Zachodzi rozdzielanie składników, które bądź pozostają w kolumnie (tworząc oddzielne pasma) lub są kolejno wymywane (elucja). W poszczególnych porcjach wycieku (eluatu) przeprowadza się oznaczenia rozdzielanych składników, np. przez miareczkowanie, pomiar refrakcji itd.
d. gazowa - w której fazą ruchomą jest gaz, a faza nieruchoma jest umieszczona w kolumnie. Próbkę (gaz, ciecz) wstrzykuje się przed kolumną do strumienia przepływającego z określoną prędkością i pod określonym ciśnieniem gazu nośnego. Za kolumną znajduje się detektor czuły na zmiany składu gazu, którego sygnały są zapisywane w postaci chromatogramu. Chromatografię gazową wykonuje się w chromatografach gazowych wyposażonych w urządzenia sterujące przepływem gazów, temperaturą pracy, różnego typu detektory itp. W ustalonych warunkach pracy czas wyjścia składnika z kolumny umożliwia jego identyfikację, a powierzchnia piku jest proporcjonalna do jego zawartości. Chromatografia gazowa jest stosowana powszechnie do celów analitycznych (chromatografia gazowa analityczna); do otrzymywania czystych substancji (chromatografia gazowa preparatywna) oraz w badaniach fizykochemicznych.
e. cieczowa - w której fazą ruchomą jest ciecz przepływająca przez kolumnę sposób ciągły i pod ciśnieniem do kilkudziesięciu MPa. Wykonuje się ją w chromatografach cieczowych działających podobnie jak chromatograf gazowy. Oznaczenie całkowitego stężenia soli stanowi ważną dziedzinę zastosowania metody jonitowej. Roztwór analizowany przepuszcza się przez kolumnę kationitową i po przemyciu wodą destylowaną otrzymany roztwór miareczkuje się mianowanym roztworem ługu sodowego. Ponieważ w roztworze oznaczanym mogą znajdować się kwasy należy uwzględnić to podczas wykonywania analizy. W celu oznaczenia całkowitej zawartości soli w roztworze za pomocą miareczkowania uwolnionego kwasu, należy odjąć od wartości otrzymanej z miareczkowania wycieku tę ilość kwasu, która istnieje w roztworze pierwotnym (H2SO4 ,H2CO3 ,H3PO4 ) lub w analizie zamienić różne sole w chlorki, przed przystąpieniem do oznaczania poprzez gotowanie próbki z kwasem solnym (ok. 30 minut).
Wiadomości ogólne: dotyczące chromatografii bibułowej i cienkowarstwowej
Podstawą działania chromatografii bibułowej (PC) jest podział substancji rozdzielanych miedzy fazę nieruchomą, którą stanowi woda unieruchomiona przez celulozę dzięki jej higroskopijności, oraz fazę ruchomą rozpuszczalnik organiczny lub mieszaninę rozpuszczalników, często nawet z wodą, wędrujące po bibule dzięki siłom kapilarnym. Celuloza stanowiąca nośnik dla fazy stacjonarnej (wody) ma niewielkie właściwości adsorpcyjne i prawie nie zniekształca przebiegu rozdzielania opartego na podziale substancji między wodę a wędrujący rozpuszczalnik. Jeżeli współczynniki podziału substancji naniesionych na bibułę są różne, to w trakcie wędrówki po bibule następuje ich rozdzielenie
Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) jest również odmianą chromatografii podziałowej. Fazę nieruchomą stanowi woda zatrzymana w cienkiej warstwie sorbenta typu krzemionki lub tlenku glinu, naniesionej na płytkę szklaną. Fazą ruchomą jest rozpuszczalnik wędrujący przez tę warstewkę na zasadzie sił kapilarnych. Substancje rozdzielane, naniesione na płytkę, po której następnie posuwa się rozpuszczalnik, rozdzielają się na zasadzie podziału między fazę nieruchomą na sorbencie a fazę rozpuszczalnika. Gdy ich współczynniki podziału są różne, następuje rozdzielenie. Wielkością charakteryzującą substancję w określonym układzie chromatografii bibułowej lub chromatografii cienkowarstwowej jest wielkość Rf (współczynnik retencji) zdefiniowana jako stosunek drogi, którą od punktu startowego na bibule lub płytce przebyła dana substancja Ds do drogi, którą w tym samym czasie przebył rozpuszczalnik (Dr):
Rf = Ds/Dr
Technika wykonania
W przypadku rozdzielania związków bardziej polarnych lub związków mało różniących się między sobą polarnością lepiej jest korzystać z chromatografii podziałowej, a więc stosować chromatografię bibułową, a w przypadku cienkowarstwowej korzystać ze słabo adsorbującej warstwy, np. warstwy celulozowej. Przy rozdzielaniu związków słabo polarnych i związków różniących się znacznie polarnością należy wybrać chromatografię cienkowarstwową z dość silnym adsorbentem, np. żelem krzemionkowym.
Pewną orientację w stosowaniu adsorbentów w chromatografii cienkowarstwowej może dać następująca klasyfikacja adsorbentów:
a) tlenek glinu-rozdzielanie zasad i steroidów,
b) ziemia okrzemkowa-cukry,
c) żel krzemionkowy-wszystkie klasy związków (zależnie od przygotowania żelu),
d)celuloza- związki polarne (także aminokwasy i nukleotydy),
e) poliamidy, antocyjaniny, flawony,
f) pochodne dwu- i trójetyloaminocelulozy oraz karboksymetylocelulozy barwniki, nukleotydy, fosfolipidy, glikolipidy.
Dobierając rozpuszczalnik trzeba kierować się jego polarnością, której najlepszym liczbowym wyrazem jest stała dielektryczna. Zwykle najlepsze działanie wykazują mieszaniny 2-3 rozpuszczalników.
Chromatografia kolumnowa
Technika chromatografii kolumnowej znajduje zastosowanie w chromatografii: adsorpcyjnej, podziałowej i jonowymiennej. Ze względu na zakres pracy dyplomowej omówiona będzie technika chromatografii adsorpcyjnej kolumnowej. Kolumna chromatograficzna i jej napełnianie. Jako kolumny chromatograficzne stosuje się zwykle rurki szklane o długości i średnicy ściśle określonej dla danego nośnika i badanej substancji (dł. od 15 cm do kilku metrów i szer. od 0.2 cm do kilkudziesięciu cm); wyciągnięte z jednego końca i zaopatrzone powyżej tego końca doszlifowany korek szklany oraz porowatą płytką szklaną. Właściwą kolumnę stanowi złoże nośnika i badanej substancji, na którym zachodzi proces chromatograficzny. Dolny otwór kolumny zamyka się watą i następnie napełnia ją przesianym adsorbentem. Wsypuje się go stopniowo, lekko ugniata pręcikiem szklanym. Należy go równomiernie rozmieścić w kolumnie, aby uniknąć powstania nieregularnych pasm pęcherzyków powietrza. Ilość adsorbenta powinna być 30-krotnie większa od masy zaadsorbowanej substancji. Złoże można przykryć od góry dobrze dopasowanym krążkiem bibuły filtracyjnej; ułatwia to wprowadzenie badanego roztworu i rozpuszczalnika bez deformowania górnej warstwy złoża. W celu uniknięcia strat można także od dołu kolumnę przykryć krążkiem bibuły. Oprócz napełnienia kolumny suchym nośnikiem można napełnić ją także nośnikiem mokrym. W tym celu rozciera się adsorbent z rozpuszczalnikiem na papkę, po czym wlewa go małymi porcjami do kolumny. Gdy ciecz odcieknie wlewa się niezwłocznie nową porcję. Po odcieknięciu rozpuszczalnika adsorbent przykrywa się i zaczyna wkraplać roztwór badany