Piotr Świątczak
Tomasz Ramięga
Marcin Kopciara
Ćwiczenie 4
ENZYMATYCZNA HYDROLIZA SUROWCÓW SKROBIOWYCH
Celem ćwiczenia będzie enzymatyczna hydroliza surowców skrobiowych z wykorzystaniem α -amylazy i glukoamylazy.
Schemat budowy skrobi. Amylaza katalizuje hydrolizę wewnętrzną wiązań α(1-4) glikozydowych.
α -amylaza (EC 3.2.1.1) hydrolizuje wiązania α-1,4-glukanowe w polisacharydach zawierających trzy lub więcej jednostek α-D-glukozy powiązanych w pozycjach 1,4. Działa w sposób niewybiórczy, wykazuje małe powinowactwo do oligosacharydów o niskiej masie cząsteczkowej; szybkość hydrolizy jest wprost proporcjonalna do stopnia polimeryzacji substratu. Wraz ze wzrostem jednostek glukozy w łańcuchu, wzrasta stopień hydrolizy. W zależności od pochodzenia α -amylazy produkty hydrolizy skrobi mogą być różne: maltoza, maltotrioza, maltotetroza, maltodekstryny, glukoza. Enzymy z tej grupy umożliwiają hydrolizę wiązań α -1,4-glikozydowych zarówno w amylozie jak amylopektynie. Nie są aktywne w stosunku do wiązań α-1,6- (np. w amylopektynie). Produktami hydrolizy w tym przypadku są oligosacharydy posiadające konfiguracje α przy węglu C1. Enzymy te działają w środku łańcucha polimerowego.
Powoduje to gwałtowny spadek lepkości hydrolizowanego kleiku skrobiowego.Znane są dwa rodzaje α-amylazy: termostabilna i termolabilna. α -amylaza termostabilna jest enzymem pochodzenia bakteryjnego. Termolabilne α-amylazy są enzymami pochodzenia grzybowego. Produktami hydrolizy skrobi
w tym przypadku są: maltoza i maltotrioza. Enzymy pochodzenia grzybowego wykazują większą w porównaniu do swoich bakteryjnych odpowiedników odporność na zmiany pH środowiska
reakcji.
Glukoamylaza (EC 3.2.1.3) hydrolizuje wiązania α-1,4-glukanowe w skrobi, glikogenie, oraz pokrewnych poli- i oligosacharydach usuwając jednostki glukozy od nieredukujących końcow łańcucha. Enzym ten działa na skrobie odcinając po jednej jednostce glukozowej, aż do miejsca rozgałęzienia. Hydroliza wiązań 1,6- glikozydowych z udziałem glukoamylazy również jest możliwa choć proces ten przebiega z bardzo niska szybkością, 20-30 razy mniejszą niż wiązanie α-1,4-glukanowe i tylko w jego obecności. W przypadku wysokich stężeń glukozy lub enzymu możliwa jest także podobnie jak w przypadku hydrolizy kwasowej reakcja repolimeryzacji
(rewersji) glukozy z wytworzeniem maltozy i izomaltozy. Glukoamylaza charakteryzuje sie dużą odpornością na zmiany pH. Enzym ten najwyższa aktywność przejawia przy pH z
zakresu 4,0-5,6 w temperaturze 40-65±C. Odwrotnie niż w przypadku α--amylazy jony Ca2+
wykazują inhibicyjne działanie na proces enzymatycznej hydrolizy z udziałem glukoamylazy.
Enzymatyczna metoda oznaczenia zawartości skrobi polega na całkowitej hydrolizie tego polisacharydu do glukozy przy wykorzystaniu α -amylazy i glukoamylazy. W pierwszym etapie prowadzi się proces upłynnienia skrobi przy wykorzystaniu α -amylazy, następuje spadek lepkości roztworu. W drugi etapie wytworzone dekstryny są hydrolizowane do glukozy przy wykorzystaniu glukoamylazy.
Wykonanie ćwiczenia:
Sporządziliśmy naważkę 1g surowca skrobiowego, którą zawiesiliśmy w 15ml wody. Do zawiesiny wprowadziliśmy 0,2ml roztworu α -amylazy. Zawiesinę ogrzaliśmy w 70ºC w czasie 15 minut, mieszając periodycznie. Następnie roztwór ochłodziliśmy i przelaliśmy do kolby miarowej na 100ml, dodaliśmy 1ml glukoamylazy i uzupełniliśmy buforem octanowym o pH 4,7 do 100ml. Próbę ogrzaliśmy w temp. 60ºC, w czasie 30 minut. Po ochłodzeniu roztworu oznaczyliśmy zawartość glukozy zgodnie z instrukcją.
Wykonanie prób do oznaczenia
|
Próba odczynnikowa |
Próba wzorcowa |
Próba badana |
Odczynnik |
2 ml |
2 ml |
2 ml |
Wzorzec |
- |
0,02 ml |
- |
Roztwór badany |
- |
- |
0,02 ml |
H2O |
0,02 ml |
- |
- |
Obliczenia ze wzorów
Gdzie:
AB absorbancja próby badanej
AWZ absorbancja wzorca
Gdzie:
0,9 współczynnik wynikający z przeliczenia glukozy na skrobię
mg skrobi w 1g surowca w naszym przypadku to 65 mg skrobi w 1g surowca.
Tabela z wynikami:
Surowiec |
% skrobi |
AWZ |
AB |
Glukoza [mg/100] |
% hydrolizy |
Mąka grochowa |
45 |
0,455 |
1,35 |
296,7 |
59,34 |
Płatki owsiane |
69 |
0,365 |
1,80 |
507,0 |
66,00 |
Kleik ryżowy |
85 |
0,455 |
1,55 |
340,7 |
36,07 |
Mąka pszenna |
65 |
0,500 |
2,00 |
400,0 |
55,38 |
Mąka ryżowa |
75 |
0,200 |
0,48 |
240,0 |
28,80 |
Mąka Ziemniaczana |
80 |
0,200 |
2,00 |
900,0 |
~100 |
Kleik ryżowy |
85 |
0,520 |
2,00 |
384,0 |
40,70 |
Mąka kukurydziana |
75 |
0,520 |
1,30 |
250,0 |
30,00 |
Wnioski:
α -amylazy i glukoamylazy są enzymami efektywnie hydrolizującymi skrobię. W surowcach poddanych badaniu zawartość skrobi jest różna . Inna jest również wydajność hydrolizy dla każdego z produktów. Wśród badanych surowców, produkty ryżowe oraz mąka kukurydziana charakteryzują się najniższym procentem hydrolizy. Uzyskane wyniki są jednak obarczone pewnym marginesem błędu, wynikającym z niedokładności podczas wykonywania oznaczenia. Widoczne jest to przy mące ziemniaczanej, gdzie % hydrolizy wynosił w granicach 100%, co jest wynikiem niemożliwym do uzyskania w naszych warunkach.