INSEMINACJA KLACZY
Zalety sztucznego unasieniania: Eliminacja niekorzystnych czynników związanych z transportem koni - stres, koszty, urazy Mniejsze koszty i warunki utrzymania (klacz nie przebywa w stajni ogiera) Osobisty nadzór nad rozrodem Kontrola jakości nasienia Ograniczenie przenoszenia chorób Wady: Słaba jakość konserwowanego nasienia od niektórych ogierów (nasiene ogierów źle się mrozi) Koszty związane z zabiegami weterynaryjnymi czasochłonność Trudność pobierania nasienia Koszty sprzętu i materiałów oraz transportu nasienia
Współpraca z właścicielami: wywiad (dotychczasowa kariera hodowlana = ilość ciąży, porody, poronienia, odchów źrebiąt, ostatni poród, ilość kryć na ciążę, przebyte choroby i zastosowana kuracja, ruje - częstotliwość, stopień nasilenia objawów, długość)
Wydajność krycia - 80-90%
Wydajność inseminacji - 60%
Przygotowanie klaczy do inseminacji: badanie przez prostnicę (jajniki - zmiany, faza cyklu, macica), badanie USG, wymazy bakteriologiczne, bad. cytologiczne (stany zapalne macicy),biopsja, wziernikowanie pochwy, endoskopia, badanie profili hormonalnych (ale raczej brak wskazań) Określanie optymalnego terminu sztucznego unasieniania: maksymalne skrócenie odstępu czasu między unasienianiem a owulacją zwiększa odsetek zaźrebień próby w obecności ogiera stopień nasilenia zewnętrznych objawów rujowych badanie poziomu progesteronu w surowicy krwi Tylko poprzez bezpośrednie badanie jajników (przez prostnicę) badanie palpacyjne - wielkość, tkliwość, konsystencja USG - wymiary (powyżej 35 mm), kształt Wziernikowanie pochwy - stopień rozwarcia szyjki macicy (na ok. 3 palce)
Rodzaje nasienia używanego do sztucznej inseminacji: Świeże - podajemy bezpośrednio po podaniu Świeże rozrzedzone - przechowywane w temp. Pokojowej do 12 h Rozrzedzone schłodzone do 4°C, przechowywane do 72 h Mrożone - przechowywanie w temp. ciekłego azotu -196°C - wieczność Inseminacja świeżym nasieniem gdy: Ryzyko niebezpieczeństwa i uszkodzenia ciała dla klaczy lub ogiera Arteritis - ogier jest nosicielem, ale w nasieniu nie ma wirusa Klacz nie akceptuje ogiera W celu wcześniejszego zbadania nasienia Postępowanie z klaczą przy sztucznej inseminacji nasieniem świeżym, rozrzedzonym i schłodzonym: Badanie jajników co 12-24h Wielkość pęcherzyka jajnikowego powyżej 3,5 cm, konsystencja miękka, fluktująca, duża tkliwość, zmiana kształtu, rozwarcie szyjki Inseminacja od 48 h przed owulacją do 6 h (ew. 12h) po owulacji Inseminacja pojedyncza Ewentualnie reinseminacja po 48 h nową porcją nasienia
Technika obchodzenia się z nasieniem rozrzedzonym, schłodzonym: Metody transportu nasienia (Equitainer, Equine Express II) Dopuszczalny czas konserwacji nasienia - duże różnice indywidualne, ale geberalnie od 24-72 h , w temp. 4-5°C Technika obchodzenia się z nasieniem mrożonym Przeżywalność w drogach rodnych ok. 12 h Inseminacja 6 h przed i 6 h po owulacji Badanie klaczy co 6 h (max co 8 h) Badanie klaczy i gdy pęcherzyk powyżej 3,5 cm podajemy hCG 1500 - 6000 JU Lub podać GnRH i obserw. przez 36 h Optymalne parametry dawki inseminacyjnej nasienia świeżego: 80% plemników o ruch postępowym, koncentracja 20-30 mln plemników/ml Optymalne parametry nasienia mrożonego: 1 słomka o objętości 4-5 ml (maxi) 4 słomki o objętości 2,5 ml (midi) 8 słomek o objętości 1-1,5 ml (mini) liczba plemników ruchliwych 300 mln odsetek plemników o ruchu postępowym 30% koncentracja 120-150 mln/ml Technika rozmrażania nasienia (łaźnia): małe słomki 37-38°C, 20-40 sek. duże słomki 37°C, 20-30 sek. rozcieńczalnik 5-15 ml, 37°C Opis technik rozmrażania powinien być przesłany wraz z nasieniem.
INSEMINACJA KRÓW
Dojrzałość płciowa - przed ukończeniem 1 roku (pełen rozwój 16-24 m-ce, mleczne wcześniej, mięsne później)
Długość cyklu - 18-24 dni, asezonalne, policykliczne
Długość rui - śr. 18h (u jałówek krótsza)
Owulacja - 12h po rui
Cykl rujowy
- okres przedrujowy 12-18 h (do 24h)
- okres rui właściwej 2-36 h
- okres porujowy 12-18 h (do 24h)
Okres przedrujowy - objawy:
próby obskakiwania innych krów, lizanie innych krów, porykiwanie, zmniejszenie apetytu i spadek produkcji mleka, srom wilgotny, nabrzmiały, zaczerwieniony, gorący, śluz skąpy, przezroczysty, konsystencją przypominający białko jaja kurzego
Okres rui właściwej - objawy:
obskakiwanie innych krów
odruch stania (tolerancji) w czasie obskakiwania przez inne krowy
niepokój, wzmożona ruchliwość, częste wstawanie, niepokojenie sąsiadujących krów
lizanie innych krów
obecność przezroczystego, obfitego, szklistego śluzu
śluz na kosmku włosów (pędzelku) dolnego spojenia sromu, ogonie i zadzie
dodatnia reakcja na dotyk w okolicy zadu - podniesienie ogona, wygięcie grzbietu, oglądanie się
otarcia na nasadzie ogona u sztuk utrzymywanych wolno
Okres porujowy - objawy:
zachowanie i reakcja na otoczenie normalne
śluz skąpy, mętny, czasem z domieszką krwi (pojawienie się krwi oznacza, że już po owulacji, nie inseminujemy), skłonność do leżenia
Rozpoznawanie rui - trudności:
zbyt krótki czas obserwacji krowy
nieodpowiednia pora obserwacji (większość krów przejawia objawy między godz.18 a 6 rano)
20% krów nie przejawia zewnętrznych objawów rui
nieodpowiednia metoda wykrywania rui
schorzenia kończyn - krowy nie obskakują i brak odruchu tolerancji, objawy rui mogą występować także u już zacielonych krów (3-4%), nieregularne cykle rujowe, zmiany na jajnikach (torbiele), brak ruchu, niewłaściwe prowadzenie notatek dotyczących reprodukcji
Metody rozpoznawania
obserwacja - minimum 2 razy dziennie (lepiej 3) przez co najmniej 30 minut - rano, południe, wieczór
ciągła, automatyczna obserwacja za pomocą kamery z zapisem
identyfikacja każdej krowy w oborze (respondery na szyi) i analiza komputerowa ilości pobieranej paszy, ilości oddawanego mleka
czujniki naklejane na zad - wysyłają sygnał do komputera gdy krowa jest obskakiwana (też ile razy - obskakiwanie 3 razy w ciągu 4h, każdy skok ponad 2 sek. = ruja)
elektryczne urządzenia zakładane na nogę (podometry, aktynometry) mierzące ilość kroków (w rui zwiększona aktywność ruchowa)
pomiar oporu śluzu szyjkowego (duży procent błędów- zapalenia, stany chorobowe, niedoborowe powodują błędy w odczycie)
pomiar temperatury ciała i mleka
pomiar ilości progesteronu w mleku lub krwi (poniżej 0,5 mg/ml = ruja)
kontrola jajników przy pomocy USG (opatrzone dużym błędem)
test algoryzacji - pobranie śluzu na szkiełko, wysuszenie - gdy krowa w rui po wysuszeniu widoczny kształt liścia paproci
wykorzystywanie psów do wykrywania rui u krów
Optymalny termin krycia - 12h od momentu wykrycia rui
INSEMINACJA OWIEC
Rozpoznawanie rui
Unasienianie
Doszyjkowo - najczęściej - pod kontrolą wzroku (wziernik dopochwowy), kateter ze strzykawką
Domacicznie
Laparoskopowo domacicznie (do rogu)
Rozpoznawanie rui - problematyczne u owiec
słabe objawy rujowe, jedynie przy wprowadzeniu tryka do stada owce reagują, zbierają się wokół niego, wykazują odruch tolerancji, śluz gromadzi się w pochwie, brak wypływu
Dojrzewanie płciowe
wiek - 7-10 miesięcy
6 miesięcy - rasa afrykańska
14 - 18 m-cy - dojrzałość hodowlana
krycie uzależnione od masy ciała
Okres użytkowania do rozrodu 6-8 lat (3-4 rok - najwyższa płodność)
Cykl rujowy:
owce prymitywne - krótki jesienny sezon reprodukcyjny z jednym cyklem rujowym
długość cyklu - 16,5 - 17,5 dni
ciężko rozgraniczyć poszczególne fazy
dominuje faza lutealna
oestrus - 30-36 h, metestrus - 2-4 dzień, diestrus - 5-15 dzień, proestrus - 16-17 dzień
ruja - 3-84 h (zwykle 24-36 h )
okres anestrus - ok.100 dni
Objawy rui:
przekrwienie i nieznaczny obrzęk sromu (nie widać)
zachowanie w obecności tryka (przyciąganie jego uwagi, odruch tolerancji), owulacje mogą przebiegać bez zewnętrznych objawów rui (ciche ruje)
Owulacja:
20-40 h od rozpoczęcia rui (2 połowa rui), spontaniczny charakter, obecność tryka może przyspieszyć owulację, liczba owulacji uwarunkowana genetycznie, ale można sprowokować podając PMSG, FSH, HCG.
W produkcji przemysłowej dąży się do uzyskania ciąż bliźniaczych. Jedną z metod jest tzw. „flushing” - intensywne żywienie podczas sezonu rozrodczego.
Podawanie w końcowej fazie cyklu analogów GnRH pozwala na uzyskanie 2 owulacji.Jednak ciąże mnogie często kończą się śmiercią płodów (dochodzi do zaburzeń metabol. - ketoza).Im więcej tym gorzej.
Synchronizacja rui:
prostaglandyny i progestageny
melatonina
„ram effect” (wprowadzanie tryka do stada)
Pozwala na uzyskanie rui (ciąży) poza sezonem.
Gąbki dopochwowe
oparte na progestagenach, nasycone FGA (octan fluorogestonu - Cranolon) lub MGA (octan medroksyprogesteronu - Melengeston). Stosuje się 12-14 dni.
Superowulacja gonadotropinami PMSG 1-2 dni przed użyciem gąbek. Ruja 1-2 dni później.
Schemat stosowania gąbek:
FGA(mg) długość stosow, dawka PMSG
Anestrus 30 12 dni 400-600
Oestrus 30-4 12-14 dni 300-500
Wkłady dopochwowe:
silikonowy wkład nasycony progesteronem (CIDR), nie upośledza drenażu i sekrecji wydzieliny z pochwy, 12 dni stosować, ruja w ciągu 5 dni, może powodować znaczny wzrost flory beztlenowej w pochwie
Melatonina
nie am praktycznie zastosowania
bodziec dnia krótkiego
preparat Meluvine, Regulin
„Ram effect”
owulacja spowodowana feromonami tryka, nagłe wprowadzenie tryka do stada
Unasienianie nasieniem świeżym rozrzedzonym:
wziernik pochwowy szczękowy lub rurowy
pipeta inseminacyjna ze strzykawką
źródło światła
Przeprowadzanie inseminacji doszyjkowej:
unieruchomienie owcy, wprowadzenie wziernika
odnalezienie ujścia zewn. Szyjki macicy
wprowadzenie pipety do szyjki na głębokość 0,5 - 1 cm
wprowadza się 0,1 - 0,2 cm3 rozrzedzonego nasienia, minimalna dawka wynosi 0,05 cm3
Naturalna objętość nasienia tryka - 0,8 - 1 ml, gęste
Unasienianie domaciczne
coraz szerzej stosowane w związku z wprowadzeniem nasienia mrożonego
możliwe osiągnięcie wysokiego % zapłodnień - 88-93%
klasyczny zabieg wymaga przeprowadzenia laparotomii
POZYSKIWANIE ZARODKÓW
IN VITRO - pozyskujemy oocyty niedojrzałe do zapłodnienia (dojrzały oocyt = taki, który owuluje)
IVP = in vitro production :
IVM = in vitro maturation (dojrzewanie in vitro)
IVF = in vitro fertilization (zapłodnienie in vitro)
IVC = in vitro culture (hodowla in vitro) (produkcja in vitro)
Uzyskiwanie in vitro zarodków bydlęcych:
Plemniki Oocyty niedojrzałe
Kapacytacja in vitro (1h45min) Dojrzewanie in vitro (18-27h)
Reakcja akrosomowa Wznowienie mejozy do M2
Hiperaktywacja (metafaza 2 podziału mejotyczn.)
Pierwsze ciałko kierunkowe
Zapłodnienie in vitro (20h) (penetracja osłonki przejrzystej, blok polispermii, fuzja błon komórkowych gamet)
Hodowla in vitro (17h)
Dekondensacja Zakończenie mejozy
główki plemnika (2. ciałko kierunkowe)
wytworzenie przedjądrzy
podziały komórkowe
morula/blastula
przenoszenie zarodków do macicy
Pozyskiwanie zarodków:
Przez wypłukiwanie z macicy (ok. 7. dnia cyklu - wtedy dopiero są w macicy)
W tym czasie zarodki sa w stadium blastocysty (ale i tak są lepiej rozwinięte niż zarodki pozyskiwane in vitro). Posiadaja oslonkę przejrzystą - ochrona zarodka przed manipulacjami na nim)
Pozyskiwanie w stadium blastocysty pozwala na dojrzewanie zarodka w macicy biorczyni
Wypłukiwanie z jamy macicy:
Jałowe (aby nie zakazić zarodka w sposób przypadkowy)
Wprowadza się płyn (Dulbecco?) z dodatkiem albuminy lub gotowy płyn komercyjny - roztwór soli z dodatkiem glukozy, antybiotyków,jonów,albumin. podgrzany do temperatury 37°C aby nie uszkodzić termicznie zarodka, pH 7,2 -7,6, buforowane
Lewarowanie płynu wraz z zarodkiem
Używa się kateteru Foley'a z perforowaną końcówką, który deponuje się trzonu macicy lub do każdego rogu oddzielnie
Szyjka ok. 7 dnia cyklu jest zamknięta (faza diestrus)
Mandryl, który usztywnia zgłębnik, ułatwia wprowadzenie do szyjki
Kateter Foley'a ma kołnierz uszczelniający (jak rurka intubacyjna), który stanowi korek i zapobiega wylewaniu się płynu innymi drogami
Po wprowadzeniu do szyjki mandryl usuwa się
Do katetera podłącza się przewód przedłużający z dwoma rurkami (jadna do wlewania, druga do lewarowania)
Zbieranie płynu z zarodkami na różne sposoby (do naczynie z kranikiem, zarodki = osad opadają na dno i zlewa się je, otwierając kranik, na szalkę i ocenia lub na specjalny filtr) Do jednego zabiegu używa się ok. 1,5 l płynu
Wstępne określanie liczby zarodków:
Stwierdzenie liczby ciałek żółtych pod kontrolą USG (orientacyjne)
A potem porównywanie z faktyczną uzyskana ilością (przy każdym kolejnum zlewaniu płynu sprawdzamy ile jest i jak osiągniemy spodziewaną po USG ilość kończymy płukanie)
Po zakończeniu płukania:
Do macicy - roztwór antybiotyku
PGF2α do macicy aby zapobiec ew. ciąży , jeśli zostałby jakiś zarodek w macicy
Pozyskiwane zarodki można implantować jako świeże lub zamrażać. Częściej używa się zarodków pozyskanych in vivo niż in vitro, zarodki świeże i mrożone 50:50%.
Zarodki można dzielić na połówki aby uzyskać więcej potomstwa.
TRANSFER ZARODKÓW-
Przyczyny stosowania u bydła *Ekonomiczna - spodziewany zysk z wyprodukowanego zwierzęcia; *Hodowlana - podnoszenie wydajności; *Weterynaryjna - zwalczanie chorób zakaźnych bez straty wartości genetycznej reprezentowanej przez zakażone stado. eliminacja ryzyka przenoszenia chorób zakaźnych, *Hodowlana i ekologiczna - tworzenie rezerw genetycznych zanikających ras i typów; *Naukowa - prowadzenie doświadczeń z zakresu embriologii eksperymentalnej oraz stosowanej i genetyki. *Obecnie od jednej dawczyni w jednej poliowulacji nawet 40 zarodków, z tego nawet 35 urodzonych cieląt! Możliwości: Zwielokrotnienie liczby potomstwa (cykl powtarzany co 60 - 80 dni każdorazowo uzyskujemy kilka - kilkanaście egzemplarzy potomstwa); *Produkcja bliźniąt u ras mięsnych *Przenoszenie nowych genotypów bez konieczności transportu zwierząt *Zmniejszenie ryzyka przenoszenia chorób zakaźnych; *Wprowadzenie nowych metod oceny wartości użytkowej; *Tworzenie rezerw genetycznych określonych ras i typów; *Eksperymentowanie w zakresie zapłodnienia in vitro oraz wczesnego rozwoju zarodków. Konieczne do transferu: - dawczynie i biorczynie; *stymulacja dawczyń do poliowulacji; *pozyskanie zarodków do transferu na świeżo (musimy zsynchronizować biorczynie z dawczyniami) lub do mrożenia (wtedy synchronizacj biorczyń nie jest konieczna); *unasienniamy dawczynie; *zarodki zstępują z jajowodów do macicy po 4 - 5 dniach; *pozyskujemy 7 dnia w stadium moruli lub blastocysty. Stymulacja poliowulacji -, ruja = dzień 0,biorczynie otrzymują PGF2L 12-18h. przed dawczyniami.,unasiennianie12h. po wystapieniu objawów rui i powtarzane co 12h **3metody,1)-10dzień cyklu2.500j.PMSG,12dzień PGF2L,14 i 15dzień- unasiennianie. 21dzień-płukanie zarodków.2)10-11-12-13 dzień cyklu- 2xdziennie -malejące dawki FSH-P (od 5mg-2mg), 12dnia PGF2L, 14-15unasien.21-wypłukiwanie zarodków.3)-j.w.(5mgFSH-P-const.) **Prostaglandynę podajemy przy wszystkich trzech metodach; Metoda z malejącymi dawkami świńskiego FSH ma podobną skuteczność jak metoda ze stałymi dawkami; *PMSG działa jak FSH ale ma znacznie dłuższy okres półtrwania (ok. 150 h) dlatego wystarczy je podać raz na całą stymulację a FSH trzeba podawać dwukrotnie każdego dnia. Stymulację rozpoczynamy w 9-11 dniu cyklu, musimy podać PGF 2α żeby doprowadzić do luteolizy. Przy podawaniu PMSG na jajnikach oprócz poliowulacji dochodzi do powstawania licznych torbieli, bo pęcherzyki zaczynają rosnąć w różnych fazach. Przy podawaniu FSH to zjawisko nie występuje. Przy podawaniu PMSG można stosować przeciwciała monoklinalne anty - PMSG, które skracają okres półtrwania i w pewnym stopniu ograniczają powstawanie torbieli na jajnikach. Ciałka żółte powstałe po superowulacji produkują progesteron. Stężenie progesteronu może więc odzwierciedlać stopień sukcesu w wywołaniu superowulacji. W zasadzie w transferze zarodków poliowulacja to jedyny problem natury biologicznej, bo nie wszystkie dawczynie reagują tak samo i dlatego jest to najbardziej zawodny element. Pozostałe problemy są natury technicznej.
Metody synchronizacji rui: PGF 2α - warunek obecność wrażliwego ciałkażółtego. Po I iniekcji - skuteczność synchronizacji - 80%, jeżeli powtórzymy iniekcję po 10-11 dniach to mamy praktycznie 100% skuteczności. **Bydło, owce, kozy - progestageny: wkładki dopochwowe, implanty podskórne, PGF 2α iniekcje; **Świnie - odsadzenie prosiąt (ruja po 5-7 dniach) lub progestageny doustnie; **klaczy: niezależnie od fazy cyklu: dzień 0- PGF2L, dz 7- hCG, dz 14-15- PGF2L, dz 21- hCG owulacja do 48h po zastrzyku, dz 22- unasienianie lub krycie naturalne. Cel- Zorganizowanie grup technologicznych w produkcji zwierzęcej;/ Organizacja unasienniania;/ Przenoszenie zarodków;/ Superowulacja; /Pozyskiwanie oocytów.
Metoda off-synch: I dzień iniekcja GnRH; VIII dzień - PGF 2α; X dzień - GnRH; XI dzień - unasiennianie.
Przechowywanie zarodków: gotowe r-ry, pH 7,2-7,6, wilgotność 100%, osmolarność: 270 - 310 mOsM/kg, temp.37 st, bufor fosforanowy lub dwuwęglan sodu w atmosferze 5% CO2, dodatek ab; penicylina, genta, dodatek albumin, surowicy płodów bydlęcych jako odżywki, wszystki niezbędne jony.
Przenoszenie zarodków
Zdeponowanie zarodka do rogu macicy biorczyni, najlepiej jałówki w fazie cyklu adekwatnej do wieku zarodka (jak pobrany 7 dnia cyklu to przeniesiony musi też być w 7. dniu cyklu biorczyni).
Trudność przenoszenia to pokonanie bariery szyjki macicy
Klacze - najlepiej kilkuletnie (do 10 lat), zdrowe, aby jej rozmiary ciała były porównywalne z dawczynią i z rasą zarodka
Metody deponowania Chirurgiczne (nie stosowane) i
Niechirurgiczne
Sprzęt do implantacji - pistolet Kassou, wprowadza się go do rogu macicy.
Trzeba zminimalizować uszkodzenia błony śluzowej macicy (lepiej zdeponować płycej niż pchać i spowodować urazy)
Zabieg nie powinien przekraczać 5 minut
Skuteczność
U bydła 50-70%, U klaczy 40-70%, Średnio ok. 50%
Ocena oocytów i zarodków uzyskanych in vivo
Płytki do wyszukiwania i oceny oraz do zapłodnienia in vitro oraz wszystkie inne przyrządy wykonane są z materiałów o minimalnej toksyczności dla zarodka.
Przy ocenie zwracamy uwagę na :
Strukturę komórki jajowej - ziarnistość cytoplazmy - im większa tym gorsza jakość, bo to znaczy że w kom zaszły już procesy degeneracyjne, oraz zaciemnienie cytoplazmy - również oznaka degeneracji.
Osłonkę przejrzystą - czy kompletna i czy odpowiednia grubość
Komórki wzgórka jajonośnego
Wielkość przestrzeni okołożółtkowej - im większa tym gorzej - bo obkurczenie się cytpolazmy
In vivo - większa liczba komórek w zarodku niż w tych pozyskiwanych in vitro.
Morfologiczne kryteria używane w ocenie rozwoju embrionalnego u bydła:
kompaktowa morula
wczesna blastocysta
blastocysta albo średnia blastocysta
rozszerzona blastocysta
wylęganie się blastocysty
Ocena jakości zarodka:
Stopien I -bardzo dobry - kuliste, symetryczne, komórki jednorodne pod względem kolory konsystencji
St II - dobry - nikłe nieprawidłowości, np. oddzielenie jednego blastomeru, nieregularny kształt, pęcherzykowaty twor w blastomerze
St. III - dostateczny - bardziej nasilone nieprawidłowości, kilka blastomeroww przestrzeni okolootoczkowej, pęcherzykowate twory lub zdegenerowane kom, zianistosci w cytoplazmie
St. IV - niedostateczny - luźne blastomery, zdegenerowane komórki, popekane bl. Komorkowe, kom roznej wielkości, zmiany koloru, uszkodzona otroczka przejrzysta, czesc kom o prawidłowym wygladzie
St.V - zarodek martwy - masa kom całkowicie zdegenerowana
Implantuje się zarodki 1 i 2, ale też 3 (gdy implantuje się więcej niż jeden), lub też kombinuje się 1+2, 2+3.
Przy przeszczepianiu większej liczby zarodków większa odpowiedź biorczyni na przeszczep, a wtedy zwiększa się szansa implantacji zarodka lepszej jakości.
Zamrażanie - tylko zarodki z 1. (bo zamrażanie osłabia zarodki i niższy odsetek zacieleń mrożonymi, a gdy zamrozimy bardzo dobre to zwiększamy szanse).
Ocena przydatności zarodków na podstawie testów laboratoryjnych:
test fluorescencyjny FDA
test fluorescencyjny DAPI
barwienie barwnikiem HOECHST 33342
testy oceniające metabolizm zarodków :
zużycie glukozy
aktywność LDH
zużycie tlenu
ZABIEG PRZENOSZENIA ZARODKÓW
-od zwierząt o wysokim potencjale genetycznym
-procedura superowulacji (superstymulacji) - przy udziale gonadotropin
-równocześnie z pobieraniem zarodków przygotowuje się „biorczynie”, a gdy ich nie ma - zamrażanie (powolne lub szybkie)
-nie wykonuje się superowulacji u klaczy - bo pęch. dojrzewają w części rdzennej, trudny dostęp i u świni - bo i tak jest „wielokrotna”
- hormony wpływające na rozwój pęcherzyków i owulację :
FSH Estrogeny LH
Do pobudzenia wzrostu pęcherzyka stosuje się:
- FSH (eCG) - stymuluje rozwój pęcherzyków
- LH (hCG) - indukuje owulację
- GnRH - uwalnianie FSH i LH
Leki stymulujące -
Vaginal Pessaries Cidrs - VERAMIX Cidrr
Prostaglandydy - LUTALYSE, ESTRUMATE
Czynniki wpływające na przygotowanie do superowulacji:
Rasa, wiek (młodsze - większa wydajność), kondycja, stan utrzymania, moment laktacji - mniejszy procent superowulacji w szczycie laktacji, pora roku, właściwy moment inseminacji, jakość nasienia, stres
Sposób pozyskiwania:
wypłukiwanie zarodków
pozyskiwanie oocytów
Cel pozyskiwania oocytów:
zapłodnienie in vitro
przechowywanie (kriokonserwacja)
ocena procedur hormonalnych (weryfikacja metod superowulacji)
GRAFT - pozyskiwanie gamet i ich transfer dopęcherzykowy
Metody pozyskiwania oocytów:
In vitro
- przez pozyskiwanie jajników (wycięcie - u mięsożernych, poubojowo - u krów, po naturalnej śmierci - u rzadkich gatunków)
- z jajników przez: krojenie tkanki jajnika, nakłuwanie, punkcję widocznych pęcherzyków i aspiracja zawartości
COC - cumulus oocyt complex - centralnie położony oocyt, otoczony komórkami ziarnistymi (tzw. wzgórek jajonośny). Oocyt owuluje wraz z nim.
In vivo - przyżyciowo z jajników
- Metoda laparoskopowa (otwory, kamera, narzędzia przez otwór roboczy i zasysanie)
- Punkcja pęcherzyków pod kontrolą USG (met. OPU - ovum pick up) - u dużych zwierząt
Cel OPU:
- Pozyskanie oocytów
- Pozyskanie płynu pęcherzykowego (FF - folicular fluid) - dodawany do pozywek mikrobiologicznych lub poddawany badaniom biochemicznym, w celu wyszukania zmian niekorzystnych dla funkcji gamety
- Sterowanie cyklem jajnikowym przez destrukcję pęcherzyka dominującego (wydziela estradiol i inhibinę, które hamują wydzielanie FSH i inne pęcherzyki nie mogą wzrastać, a więc jego destrukcja stymuluje folikulogenezę)
Dawcy oocytów:
Zwierzęta zdrowe
Dorosłe (dojrzałe płciowo)
Regularny cykl jajnikowy
Ale też:
- Zwierzęta młodociane (przy odpowiednim sprzęcie) - w celu szybszego rozpoczęcia pozyskiwania potomstwa od dobrych genetycznie sztuk. Jednak te oocyty nie są w takim samym stopniu zdolne do zapłodnienia in vitro jak od dojrzałych
- Zwierzęta niepłodne - przez uszkodzenie błony śluzowej macicy, z zaburzoną owulacją
- Ciężarne
Przygotowanie zwierząt:
- Zwierzęta bez przygotowania - brane ze stada przypadkowo. Musi być - pęcherzyk o odpowiedniej wielkości, z płynem w środku. Minimalna wielkość 3-4 mm, zazwyczaj kilka pęcherzyków
- Zwierzęta stymulowane gonadotropinami przed owulacją (superstymulacja) - wtedy więcej pęcherzyków i większe
- Zwierzęta użytkowane regularnie - nakłuwanie pęcherzyka 2x w tygodniu co 3-4 dni przez kilka tygodni. Nie ma to wpływu na stan jajnika i późniejszy rozród, ale są inne skutki, np.: - brak fazy lutealnej, - synchronizacja folikulogenezy(fale wzrostu pęcherzyków po nakłuwaniu) , - brak pęcherzyków starych (w stadium atrezji) - stopniowe zwiększanie się puli pęcherzyków, dostępnych do punkcji (bo brak pęcherzyka dominującego)
Przygotowanie do zabiegu:
- Znieczulenie nadoponowe
- Środki uspokajające
- Śr. Zwiotczające
Ma to na celu uspokojenie i zniesienie czucia w obrębie sromu i krocza i unieruchomienie zwierzęcia (bo zabieg wymaga precyzji)
Sprzęt:
Musi współdziałać z konkretnym USG
Głowica sektorowa USG (wiązka do przodu), w uchwycie
Prowadnica igły
Igła 4 cm, średnica ok. 1 mm
Pompa podciśnieniowa do zasysania płynu pęcherzykowego
Pojemnik na płyn
Wydajność metody - zależy od sprzętu, wprawy lekarza. Wynosi śr. 60% (nigdy 100%).
Długość rui, moment owulacji i najlepszy moment na zapłodnienie u suki, kotki, klaczy, krowy i świni.-suka- ruja4-12dni średnio 9. Moment owulacji w estrus na około 24-72h po wylewie LH, Zapłodnienie 2-5 dni po owulacji, najlepiej 2krotne w0,4 . Kotka- dł. rui zależy od wystąpienia lub braku owulacji, u owulujących śr. 6dni, brak owulacji 8dni.moment owulacji sprowokowany poprzez akt kopulacyjny.-48-52h szczytowego wyrzutu LH, zapłod.- w trakcie rui. Klacz-ruja-3-5dni ,termin owulacji 24-48h przed końcem rui, optymalny termin 12h przed owulacją lub do 6h po owulacji. Krowa- ruja 18h.,owulacja 8-12h po rui, druga połowa rui termin unasi. Świnie- ruja 2-3dni(około60h),owulacja 30-40h od początku rui. moment zapłod.-8-12h od odruchu tolerancji, reinseminacja po dalszych 10-20h.
Zaburzenia płodności samców
Niedostateczny popęd płciowy - anaphrodisia; częste u knurów, wpływ światła u tryka Niemożliwość pokrycia - impotentia coeundi; - trudności we wspięciu, zaburzenia odruchu szukania, wysuwania prącia, brak odruchu dobicia; - choroby aparatu ruchu - bardzo ważne, zmiany w odcinku lędźwiowo-krzyżowym, paraliż zadu, pionizowane tylne kończyny, porażenie i spastyczny przykurcz kończyn, schorzenia szpary racicowej; zapalenia stawów - wrodzony niedorozwój mięśni wciągaczy prącia. Choroby układu krążenia; Zapalenia płuc; Anemia; Choroby infekcyjne, Niemożliwość zapłodnienia - impotentia generandi. ***Wady wrodzone;Wnętrostwo 2%; Hipoplazja jąder na tle aberracji chromosomalnej; Obojnactwo - prawdziwe i rzekome; Hernia scrotalis - występuje często u świń jako wrodzony defekt; Spermiostaza - brak drożności dróg wyprowadzających nasienie; ***nabyte -Zapalenia jąder i najądrzy - mogą być na tle brucelozy, Arcanobacterium i innych; Atrofia jąder - pozapalna lub na tle żywieniowym; Torbiele jąder i najądrzy; Nowotwory jąder - bardzo rzadko. Wrodzone wady narządu kopulacyjnego: Phimosis;*Hypospadiasis; *Hypoplasia penis; *Nieprawidłowości glans penis; *Frenulum persistens - przetrwałe wędzidełko; *Dysfunkcja musculus retractor penis; *Diphalia - podwójne prącie i moszna. Zmiany nabyte: Phimosis; *Paraphimosis; *Balanoposthitis; *Prolapsus preaeputi *Akroposthitis (zebu, żubry); *Ropień napletka; *Skaleczenia błony śluzowej napletka; *Guzy napletka; *Złamanie prącia; *Zmiany wytwórcze na prąciu - brodawczaki i włókniaki. Patologia dodatkowych gruczołów płciowych: *Wrodzone wady wynikające z aplazji odcinkowej przewodów Wolffa; *Nabyte:-Vesiculus seminalis; Ampulitis; Choroby gruczołów opuszkowo-cewkowych oraz prostaty. Patologia jąder, najądrzy i moszny: **Jądra - wady wrodzone:, Kryptorchizm; Aplasia testis; Hypoplasia testis Hermaphroditismus; obojnactwo i obojnactwo rzekome - często u tryków, a u kozłów jeszcze częściej Wady nabyte: Orchitis i zwyrodnienie jąder; Atrofia jąder; Zwłóknienie jąder; Guzy jąder połączone ze złą jakością nasienia - nekrospermią, oligospermią i azoospermią; **Najądrza - wady wrodzone: Aplasia segmentalis ductus Wolffi; Nabyte: Torbiele i zapalenia; Krwiaki moszny; Wrodzona lub nabyta zła jakość nasienia lub zaburzenia spermatogenezy.
BUHAJ-
Ocena przydatności do rozrodu Buhaj osiąga dojrzałość płciową (pełna stabilizację parametrów nasienia) około 18 miesiąca życia. Plemniki produkuje już około 9 miesiąca życia. Jądra zwiększają masę od 240 gramów ( w wieku 9 miesięcy) do 325 około roku i 400 gramów wieku dwóch lat. Po siódmym roku życia zaczyna się inwolucja i atrofia jąder. Od buhaja pobieranie nasienia do sztucznej pochwy, ewentualnie masaż baniek nasieniowodów per rectum lub przetoka nasieniowodów. Przy ocenianiu buhaja należy: *przeprowadzić dokładny wywiad, *wykonać badanie ogólne *zbadać stan narządu ruchu *badania w kierunku chorób zakaźnych (gruźlicy, brucelozy, białaczki bydła, otrętu, chlamydofilozy, leptospirozy) wykonać badanie szczegółowe narządów rozrodczych**worek mosznowy (wielkość, symetria, zmiany na skórze) **jądra (wielkość, symetria, kształt, położenie, konsystencja) **najądrza (głowa, trzon, ogon - wielkość,położenie, konsyst) i powrózki nasienne **gruczoły pęcherzykowe (wielkość, symetria, bolesność, konsystencja) **bańki nasieniowodów (jw) **prostata, **napletek **prącie, **uczoły opuszkowo-cewkowe są u buhaja niemacalne, poza zasięgiem ręki. **U młodych byczków - stulejka - cecha dyskwalifikująca- zwężenie napletka uniemożliwiające jego zsuwanie poza żołądź. **wadą wrodzoną dyskwalifikującą jest też przykurcz mm wciągaczy prącia Badanie w kier chorób wenerycznych- rzęsistek, mątwik płodowy, otręt, wirus BVD, mykoplazmy, ureoplazmy Ocena libido- Etapy aktu płciowego u buhaja: pobudzenie płciowe - excitatio sexualis, *wzwód prącia - erectio penis *wspięcie z ufiksowaniem, *odruch szukania, *wprowadzenie prącia, *odruchy kopulacyjne, *zejście z partnera. ocena nasienia *ocena wstępna. *badanie szczegółowe mikroskopowe *badania dodatkowe. ocena końcowa - przydatny, wątpliwie przydatny (ponowne badanie), nieprzydatny, **Objętość ejakulatu buhaja - 2-8 ml, *Barwa ejakulatu - biała, kremowa (gdy brązowa, czerwona, zielono-żółta - patologia), *Konsystencja - śmietanowata, mleczna, wodnista niedopuszczalna, *Zapach - bezwonny *pH - 6,6 - 6,8, *W 1 l nasienia znajduje się 0.6-1.2mln plemników *Parametry- odsetek plemników o ruchu postępowym-60-70%, rodzaj ruchu - oscylacyjny, zegarowy, ruch masy +++ (+); ze zmianami morfologicznymi do 25%, Osocze byka zawiera 400-600mg% fruktozy, kwas cytrynowy 620-800mg%, nie zawiera ergotioneiny.
KNUR
-Knur osiąga stabilizację produkcji plemników w wieku około 7 miesięcy, jądra rosną do około 3 lat -Libido u knura nie jest zbyt wysokie. Zab odruchów- Przyczyna 17,7% brakowań knurów, choroby stawów i kręgołupa - 20%. ; Ale nadmierny popęd płciowy - występuje często u młodych osobników, towarzyszą mu często przedwczesna ejakulacja i masturbacja; Pobieranie nasienia od knura: metodą japońską na rękę; do sztucznej pochwy. Frakcje nasienia: 1) faza wstępna - frakcja przednasienna głównie z gruczołów cewkowych, objętość 5-15 ml; 2 -10 % objętości ejakulatu; 2)pierwsza faza główna ejakulacji - mleczno - wodnista do szaro - białej; Wysoka koncentracja plemników do 400 tyś w 1 μl; Zawiera wydzielinę prostaty i gruczołów pęcherzykowych, Objętość 120 - 350 ml, 40 - 60 % objętości ejakulatu; 3)druga faza główna ejakulacji - szarobiała wydzielina, zawiera soczewkowate, galaretowate twory, bardzo uboga w plemniki; Wydzielina gruczołów pęcherzykowych i opuszkowo-cewkowych; 50 - 300 ml; 20 -40% objętości ejakulatu. Dużo ergotioneiny Parametry nasienia knura- W zasadzie nie ma ruchu masy, ewentualnie + lub +-; Rodzaje ruchu i morfologia jak u buhaja; pH ok. 7,2. Koncentracja 150-600 x10 do 6/ ml, Objętość po filtracji 80ml, >50% o ruchu postępowym, <25% ze zmianami morfologicznymi, Konsyst wodnisto śmietanowata do mlecznej, Barwa szara-biła, Osocze- fruktoza 9mg%, ergotioneina 17mg%, kw cytrynowy 380-630mg%
TRYK-Charakterystyka rozrodu-
Pierwsze plemniki - w 5 miesiącu życia; Nasienie można pobierać już pomiędzy 6 a 9 miesiącem życia. Około 16 miesiąca - stabilizacja cech nasienia. Nasienie od tryka pobiera się do sztucznej pochwy. Masa-wrzosówka 40kg, merynos-80. Użytkowanie samca 5-7lat do krycia naturalnego (haremowe albo z ręki) lub jako dawcy. Tryk próbnik. Sezonowość rozrodu, poza sezonem- mniejsza koncetracja plemników, mniej testostronu i mniejsza masa jąder. Zapalenia jąder u tryka są często wywoływane przez Brucella ovis Badanie odruchów płciowych- odróch wzwodu prącia, wspięcia, wyszukiwania szpary sromowej, wepchnięcie prącia do pochwy (jedno), zeskok. Cechy nasienia: jedna frakcja, bardzo gęste; V=0.5-2ml, pH6.6, barwa biała-kremowa, zapach charakterystyczny, konsystencja śmietana mleko, koncentracja 1,5 do 4mln/ microl, ruch masy 4+, 60% ruch postępowy; 20%zmiany morfologiczne, bardzo źle się mrozi (podobnie jak u knura) - niska zapładnialnośc po mrożeniu. Osocze- fruktoza 250mg%, kwas cytrynowy 110-260mg%, ergotioneina brak.
PIES
Nasienie: Pobieramy metodą manualną „na rękę” lub na sztuczną pochwę w obecności suki prowokatorski. Fazy pobierania: *masaż prącia przez napletek za opuszką prącia *wydobycie prącia z napletka *nieustanny masaż aż do ejakulacji. Fragmenty frakcji: *f. przednasienna: 0,1-2ml, barwa klarowna, jest to wydzielina prostaty z domieszką nabłonków, moczu, bakterii *f.nasienna: zawiera większość plemników, 0,1-3 ml, barwa:szarobiała, mleczna lub mleczno-biała, są tu plemniki zawieszone w osoczu nasienia, trwa 5-300 sek *f.ponasienna: największa część ejakulatu, decyduje o obj.całego ejakulatu, barwa: klarowna, przejrzysta, jest to wydzielina prostaty, trwa: 60 s-20 min. Ocena: *makro: obj-2,5-80 ml, opalizujące, zapach swoisty, pH 6,6-6,7 *mikro: koncentracja- 4-400x10do6/ml, liczba plemników- 300-1000x10do6, % o ruchu postępowym: >70%, prawidłowe morfologicznie > 80% Ocena popędu: zawsze w obecności suki w estrus, nieprawidłowy gdy: L0 lub L4. Warunki skutecznej inseminacji: min. 0,5-5ml nasienia, 150-200 mln plemników, 70% plemników o ruchu prawidłowym , szacunkowa ocena pod mikroskopem, sprzęt ogrzany do temp ciała, suka w okresie płodnym Mrożone u psa: 80% o ruchu postępowym, 200-300 mln plemników, powolne obniżanie do temp -196st. Dawka inseminacyjna: 150-200 mln, 2-4 słomki po 0,5ml.Inseminacja: *dopochwowa- nasienie świeże, zabieg nie później niż 5-10 min po pobraniu *domaciczna (doszyjkowa) -mrożone, endoskopowo lub wziernikujemy *chirurgicznie- mrożone, laparoskopowo.
Metod. wykrywania owulacji u suki. 1)oznaczenie poziomu LH we krwi, szczytowy wylew stęż. 6-9 ng/ml. Owulacja 1-2 dni później. 2.) Oznacz. stęż. Progesteronu 5ng/ml 3.)wykonanie rozmaz. pochwow.4.)oporność elektr. śluzu pochwy.
OGIER Ocena przydatności do rozrodu: Należy sprawdzić - dane ogólne (dotychczasowa płodność); - ogólny stan zdrowia; stan układu ruchu - specyficzne badanie i ocena funkcji rozrodczych. Dojrzałość płciowa ogiera (pełna stabilizacja cech nasienia) ok. 2,5 - 4 lata. Najlepsze parametry jakościowe nasienia w wieku 4 - 5 lat, w miesiącach od grudnia do czerwca. Ogierek po urodzeniu może nie mieć jąder w worku mosznowym, powinny one zstąpić do 10 dnia po urodzeniu. Po porodzie jadra są bardzo małe - ważą ok. 5 - 20 gramów. Intensywny wzrost jąder następuje między 12 a 18 miesiącem życia. U ogiera nasienie pobiera się zawsze do sztucznej pochwy. Badanie narządów rozrodczych ogiera: **Badanie jąder- czy nie jest wnętrem, konsyst(tęga i elastyczna ok.), symetria, badanie najądrza, czy nie ma skrętu jądra, przepukliny mosznowej, omacywanie skóry moszny. W jądrach można wykryć zmany o chrakt hypoplastycznym, hipertroficznym, zapalnym lub nowotworowym, USG. Maksymalny rozmiar jądra występuje u ogierów w wieku 7 -17 lat. Optymalna długość jądra - 9,5 cm, szerokość - 5,5 cm. Odchylenia od tych wymiarów u poszczególnych osobników są niewielkie. **Prącie- błona śluzowa prącia, napletek, oglądanie ujścia cewki, pobieranie próbek w kierunku Taylorella equigenitalis Z zachyłka podcewkowego;, Z cewki; Z jamy napletka. **per rectum, można wykonać badanie USG- gruczoł krokowy, pęcherzykowe, bańki nasieniowodu Badanie odruchów płciowych- Kolejno: 1)ogier wącha klacz, 2)wyciąga szyję i wywija wargę górną do góry (odróch Flehmen), 3)wzwód, 4)dotyka lewym barkiem i to wyzwala odruch wspięcia 5)wspięcie, 6)odruch szukania szpary sromowej, 7)wprowadzenie prącia 8)5-10 ruchów kopulacyjnych i ejakulacja- 5-7 wyrzutów nasienia, w czasie ejaklacji wzwód żałędzi prącia. 9)moment odrętwienia. 10) libido L3-L4 Cechy nasienia ogiera: -sezonowość jakości nasienia, najlepsze grudzień-maj. *nasienie wyrzucane porcjami - do 8 wyrzutów - I wyrzut to głównie przepłukująca wydzielina, kolejne frakcje najbogatsze, potem coraz rzadsze - w początkowych frakcjach 500 tyś/mm3, w dalszych f200 - 300 tyś/mm3. *Odsetek plemników w ruchu postępowym u ogiera - 50 - 60% to już jest dobrze. Ogiery powinny mieć corocznie przeprowadzaną ocenę jakości nasienia. *Konie ras prymitywnych (koniki polskie, araby) dają lepsze, gęstsze nasienie niż pozostałe. *Objętość: 20 - 120 ml; *Konsystencja: wodnisto-mleczna, do mlecznej; *pH: 7,0 - 7,5; *Odsetek plemników ruchliwych: 60 - 90%; ) *Odsetek plamników o ruchu postępowym: 30 - 60%; *Odsetek plemników żywych: 70 - 90%; *Koncentracja: 100 - 350 x10 do 6/ mm3; *Ogólna liczba plemników w ejakulacie 5 - 15 mld; *Odsetek plemników morfologicznie prawidłowych: 60 - 90% ,*Główka położona abaksjalnie Zaburzenia płodności Etiologia zaburzeń rozrodu u ogierów: **Wady anatomiczne i czynnościowe narządów rozrodczych, często wrodzone i dziedziczne (np. wnętrostwo), powinny prowadzić do eliminacji ogierów z rozrodu; **Zmiany chorobowe w narządach rozrodczych, nabyte na skutek zadziałania czynników patologicznych (u ogierów obserwuje się szczególna podatność na czynniki patogenne, które mogą zaburzać płodność tego gatunku); **Zmiany atroficzne narządów rozrodczych u starych osobników (a ogiery użytkuje się bardzo długo). Zaburzenia odruchów płciowych u ogiera: ważny problem; zaburzenia endokrynowe, choroby narządów rozrodczych, schorzenia ogólne, brutalne postępowanie ze zwierzęciem; - pozorne zaburzenia popedu mogą wystąpić u ogierów młodych i przemijać. **Leczenie: Przy podłożu endokrynologicznym analogi GnRH - Biogonadyl (HCG), nie ma pewności sukcesu. -*Zaburzenia erekcji - opaska uciskowa na trzon prącia; -*Zaburzenia ejakulacji - pozorowane odruchy oddawania nasienia, niepełna ejakulacja, urospermia. Przyczyny - dysregulacja na tle nerwowym. Próby leczenia β-blokerami, np. Suacron. Wady wrodzone: Wnętrostwo -kryptorchismus /Skręcenie jąder/ Niedorozwój jąder i najądrzy (hipoplazja) oraz braki odcinkowe (aplasia segmentalis ductus Wolffi)/, niedorozwój narządu kopulacyjnego - rzadko u koni;/ Choroby prącia- Balanitis - zapalenie błony śluzowej po kopulacji;/ Posthitis (silna sekrecja, zak bakt, obrzęk) /paraphimosis/ Wypadnięcie prącia;/ Krwiak prącia;/ Skaleczenie prącia;/ Nowotwory prącia. Wady dodatkowych gruczołów płciowych: aplasia segmentalis ductus Wolffi - u ogierów rzadka; Zapalenie jąder i najądrzy: - dosyć często u ogierów;/ pogorszenie jakości nasienia/ zmiany zwyrodnieniowe i zanikowe jąder. **Czynniki etiologiczne- β-hemolityczne paciorkowce; hemolityczne gronkowce; Actinobacillus; Salmonella abortus equi - wirus arteritis; wirus otrętu (EHV - 3); wirus anemii zakaźnej. Nowotwory jąder u ogierów: - u starszych osobników; - głównie nasieniaki - seminoma, ale też inne. choroby przenoszone z nasieniem ogiera: Bakteryjne: **Taylorella equigenitalis - zakaźne zapalenie macicy (CEM); **Zapalenia pochwy i macicy - paciorkowce, gronkowce, Pseudomonas, E. coli, Salmonella AE, Klebsiella; Wirusowe: **Otręt - EHV - 3; **EAV - togawirus; Grzybicze - różne - zapalenia łożyska i macicy.
Wyszukiwarka