Adach Krzysztof |
WTŻ- zaoczne |
|
Rok II grupa I nr.1 |
Właściwości kinetyczne enzymów
Wstęp.
Ilościowe badanie i interpretacja wyników szybkości reakcji enzymatycznych wchodzi w zakres kinetyki procesów - obejmuje ona badanie wpływu stężenia substratu, stężenia enzymu, temperatury, pH oraz mechanizmu reakcji katalizowanych przez enzymy. Enzymy mogą katalizować reakcje metaboliczne w organizmach żywych ( in vivo), lub poza komórką czyli ( in vitro).
Charakterystyczną cechą reakcji enzymatycznych jest zjawisko wysycania enzymu substratem.
Zgodnie z teorią działania enzymów enzym E tworzy z substratem S kompleks enzym - substrat ES, który następnie rozpada się na produkt P i wolny enzym E.
Energia kompleksu ES określa poziom do którego w danych warunkach musi wzrosnąć energia układu reagującego, aby reakcja mogła przebiegać. Tworzenie kompleksu ES obniża wartość energii aktywacji niezbędnej do zapoczątkowania reakcji i tym samym przyśpiesza przebieg reakcji. Stężenie kompleksu jest tym większe przy stałym stężeniu enzymu, im wyższe jest stężenie substratu. Przy odpowiednio wysokim stężeniu substratu praktycznie wszystkie cząsteczki enzymu znajdują się w kompleksie ES wówczas reakcja osiąga szybkość maksymalną V i staje się proporcjonalna do aktualnego stężenia enzymu.
Stała Km jest to takie stężenie substratu (w molach na litr), przy którym szybkość reakcji enzymatycznej osiąga połowę szybkości maksymalnej. Wartość stałej Km waha się w granicach od 10 - 1 do 10 - 8 i zależą od rodzaju enzymu, substratu i pH. Wskaźnikiem obecności czynnego enzymu jest stwierdzenie określonej przemiany chemicznej, którą on katalizuje. Natomiast o ilości enzymu wnioskuje się na podstawie szybkości reakcji w określonych warunkach stężenia substratu,pH mieszaniny reakcyjnej, temperatury itp. Aktywność enzymów jest zmienna i zależy od wielu czynników jak np. stężenie substratu, czas trwania reakcji, temperatura, pH, hamowanie przez produkty reakcji itp. Szybkość przemiany chemicznej, mierzona ilością substratu przekształconego w jednostce czasu i przeliczona na ilość badanego materiału, jest miarą aktywności enzymu. Do jednostek aktywności enzymów zaliczamy:
Jednostkę standardową - jest to ilość enzymu, która katalizuje przemianę 1 μmola substratu w ciągu 1 minuty, w temperaturze 30°C i optymalnych warunkach pH oraz stężeniu substratu.
Katal - jest to taka ilość enzymu, która w ciągu 1 sekundy w temperaturze 30°C i optymalnych warunkach pH oraz stężenia substratu powoduje przemianę 1 mola substratu.
Fosfatazy należą do enzymów klasy hydrolaz, podklasy esteraz i katalizują hydrolizę różnych estrów fosforanowych. Fosfatazy wykazują niską specyficzność substratową i w związku z tym zależnie od optimum pH dla ich działania klasyfikowane są na:
fosfatazy kwaśne - o optimum pH około 5
fosfatazy alkaliczne - o optimum pH około 9
Jednym z wyżej wymienionych czynników wpływających na aktywność enzymów jest temperatura. W miarę wzrostu temperatury reakcja enzymatyczna początkowo ulega przyśpieszeniu w związku z dostarczeniem energii cieplnej do układu. Zgodnie z regułą van't Hoffa podwyższenie temperatury o 10°C powoduje około dwukrotny wzrost szybkości reakcji enzymatycznych.
W określonej temperaturze zostaje osiągnięte optimum działania enzymu, a przy dalszym jej wzroście następuje gwałtowny spadek szybkości reakcji, co jest związane z denaturacją cieplną białka enzymu. Optymalna temperatura dla działania większości enzymów waha się w granicach 30 - 50°C
Najodpowiedniejsze stężenie jonów wodorowych, tzn. takie przy którym szybkość działania enzymu jest największa, nazywamy optimum pH i dla większości enzymów wynosi 5 - 7.
Kolejnym czynnikiem wpływającym na szybkość reakcji enzymatycznej jest obecność inhibitorów enzymów. Są to substancje powodujące zmiany w obrębie centrum aktywnego. Proces hamowania przez nie reakcji enzymatycznych nazywamy inhibicją. W zależności od sposobu działania inhibitora na enzym rozróżnia się inhibicję odwracalną i nieodwracalną.
Dane.
Po wykonaniu wszystkich kolejnych czynności mających na celu określenie wpływu czynników takich jak (stężenie enzymu, pH, oraz temperatura ), na aktywność fosfatazy kwaśnej wyznaczam absorbcję w fotometrze i otrzymuję następujące wyniki:
Wpływ stężenia enzymu.
C1,25 ml = 1,120
C1,0 ml = 0,951
C0,75 ml = 0,741
C0,5 ml = 0,491
C0,25 ml = 0,214
Wpływ pH.
pH6,6 = 0,077
pH5,2 = 0,101
pH4,4 = 0,166
pH3,0 = - 0,11
Wpływ temperatury.
0°C = 0,040
38°C = 1,986
100°C = 0,228
Obliczenia.
Obliczam ilość µg uwolnionwgo w reakcji 4- nitrofenolu w zależności od stężenia enzymu.
Dla C1,25 ml : 1,120 ÷ 0,002 ÷ 139 mol ÷ 10 min. = 0,4028 mmol/ 4- nitrofenolu · min- 1
Dla C1,0 ml : 0,951 ÷ 0,002 ÷ 139 mol ÷ 10 min. = 0,3420 mmol/ 4- nitrofenolu · min- 1
Dla C0,75 ml : 0,741 ÷ 0,002 ÷ 139 mol ÷ 10 min. = 0,2665 mmol/ 4- nitrofenolu · min- 1
Dla C0,5 ml : 0,491 ÷ 0,002 ÷ 139 mol ÷ 10 min. = 0,1766 mmol/ 4- nitrofenolu · min- 1
Dla C0,25 ml : 0,214 ÷ 0,002 ÷ 139 mol ÷ 10 min. = 0,0769 mmol/ 4- nitrofenolu · min- 1
Obliczam ilość µg uwolnionego w reakcji 4- nitrofenolu w zależności od wpływu pH dodanego buforu cytrynowego.
Dla pH6,6 : 0,077 ÷ 0,002 ÷ 139 mol ÷ 10 min. = 0,02769 mmol/ 4- nitrofenolu · min- 1
Dla pH5,2 : 0,101 ÷ 0,002 ÷ 139 mol ÷ 10 min. = 0,03633 mmol/ 4- nitrofenolu · min- 1
Dla pH4,4 : 0,166 ÷ 0,002 ÷ 139 mol ÷ 10 min. = 0,05971 mmol/ 4- nitrofenolu · min- 1
Dla pH3,0 : - 0,11 ÷ 0,002 ÷ 139 mol ÷ 10 min. = -0,03956 mmol/ 4- nitrofenolu · min- 1
Obliczam ilość µg uwolnionego w reakcji 4- nitrofenolu w zależności od wpływu temperatury inkubacji.
Dla 0°C : 0,040 ÷ 0,002 ÷ 139 mol ÷ 10 min. = 0,01438 mmol/ 4- nitrofenolu · min- 1
Dla 38°C : 0,228 ÷ 0,002 ÷ 139 mol ÷ 10 min. = 0,7143mmol/ 4- nitrofenolu · min- 1
Dla 100°C : 1,986 ÷ 0,002 ÷ 139 mol ÷ 10 min. = 0,08201mmol/ 4- nitrofenolu · min- 1
4. Wnioski.
4.1 Wpływ stężenia na ilość uwolnionego 4- nitrofenolu.
Jak widac na wykresie zależności ilości uwolnionego 4- nitrofenolu od stężenia enzymu ilość uwolnionego 4- nitrofenolu jest wprost proporcjonalna do rosnącego stężenia enzymu, zaś wykrez ma chrakter prosto linowy.
4.2. Wływ pH enzymu na ilość uwolnionego 4- nitrofenolu.
Jak widac na wykresie ilości uwonionego 4- nitrofenolu od wartości pH enzymu ilość uwolnionego 4- nitrofenolu w znacznym stopniu zależy od pH dodanego enzymu i przy wartości pH- 3,2 uwalnianie 4- nitrofenolu nie odbywa sie co swiadczy o nie odpowiednim pH środowiska co prowadzi do zachamowania procesu. Natomiast przy pH > 3,0 następuje wzrost ilości uwolnionego 4- nitrofenolu i przy pH = 4,4 osiąga najwyższą wartość co świadczy że wartość ta jest optymalną wartościa dla tego enzymu. Natomiast przy pH > 4,4 następuje spdadek ilości uwolnionego 4- nitrofenolu.
4.3. Wływ temperatury inkubacji na ilość uwolnionego 4- nitrofenolu.
Jak widac na wykresie zależności iości uwolnionego 4- nitrofenolu od temperatury inkubacji ilośc uwolnionego 4- nitrofenolu rosnie wraz ze zwrostem temperatury. Przy temperaturze 0°C ma najniższą wartość zaś przy temperaturze 38°C ilość uwolnionego 4- nitrofenolu jest maksymalna co swiadczy o osiągnięciu optymalnej temperatury. Natomiast przy dalszym wzroście następuje gwałtowny spadek, co wiąże się z zachodzącą denaturacją białka enzymu i w efekcie ilość uwolnionego 4- nitrofenolu zbliża się do zera.