Metody określania liczebności mikroorganizmów

1. Metody bezpośrednie -> liczenie liczby mikroorganizmów pod mikroskopem

1. Liczenie mikroorganizmów w specjalnej komorze, np. Thomy -> objętość komory musi być znana. Liczenie odbywa się przy niewielkim powiększeniu. Na szkiełko podstawowe nanosimy roztwór z mikroorganizmami, który następnie przykrywamy miniaturową siateczką. Dla warstwy o grubości 0,02 mm i powierzchni kwadratu o boku równym 0,05 mm objętość komory wynosi 5*10^-8 cm³, a zatem liczba komórek tam znalezionych musi być pomnożona przez 2*10⁷ w celu obliczenia liczby komórek w 1 mm. Należy też pamiętać o ewentualnym uwzględnieniu rozcieńczenia.

Wady:

• liczy się zarówno komórki żywe jak i martwe

• nie można stosować tej metody do zawiesin o małej gęstości mikroorganizmów

• mikroorganizmy muszą być nieruchome!!

• Możemy policzyć jedynie duże komórki

1. Metoda filtracji membranowej -> używana jest przy niewielkiej liczbie komórek. Znana objętość wody jest przepuszczana przez filtr membranowy, który jest następnie suszony i barwiony. Potem należy policzyć liczbę mikroorganizmów pod mikroskopem

1. Metody pośrednie:

1. Odpowiedni wysiew i liczenie otrzymanych koloni - oznaczenie cfu. Stosuje się różne techniki wysiewu:

1. Posiew powierzchniowy -> na stałe podłoże wylewa się odmierzoną ilość odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny hodowli po czym rozprowadza się zawiesinę głaszczką po powierzchni

2. Metoda lanych płytek Kocha -> odmierzoną objętość odpowiednio rozcieńczonej zawiesiny hodowli miesza się z agarem odżywczym (o temp. 40-45°C), wylewa na płytkę Petriego i pozostawia do zastygnięcia

Należy pamiętać o uwzględnieniu ewentualnego rozcieńczenia w obliczeniach.

2. Metoda filtracji membranowej -> stosuje się ja przy niewielkiej liczbie mikroorganizmów. Przez filtr przepuszcza się zawiesinę mikroorganizmów. Następnie filtr wraz z mikroorganizmami kładziemy na podłożu - na filtrze rosną kolonie.

We wszystkich metodach pośrednich liczymy kolonie, które wyrosły po inkubacji pożywek w odpowiednich warunkach.

2. Inne metody badania wzrostu mikroorganizmów

1. Badanie mętności ->badamy w spektrofotometrze gęstość danej zawiesiny (jej absorbancje). Stopień zmętnienia (absorbancja) jest proporcjonalny do liczby mikroorganizmów w zawiesinie.

Tą metodą nie możemy policzyć bezpośrednio liczby mikroorganizmów. Aby to zrobić musimy sporządzić krzywą standardową, która obrazuje zależność między stopniem zmętnienia, a cfu.

2. Za pomocą elektronicznego licznika komórek

3. Cytometria przepływowa

Typy hodowli płynnych:

1. hodowle okresowe (zamknięte, stacjonarne) -> mikroorganizmy wsiane do podłoża wzrastają aż do wyczerpania się substancji pokarmowych

Wyróżniamy tu kilka faz wzrostu:

1. faza zastoju - stała liczba bakterii -> bakterie przystosowują się do nowego podłoża. Długość tej fazy zależy od rodzaju bakterii, inokulum (materiału wsianego, np. czy bakterie są młode czy stare), warunków hodowli

2. faza młodości -> komórki w tej fazie rosną i dopiero zaczynają się dzielić

3. faza wzrostu wykładniczego/logarytmicznego -> wszystkie komórki są w dobrej formie i dzielą się w równych odstępach czasu - wzrost jest wykładniczy - liczba komórek podwaja się.

4. faza stacjonarna -> na skutek zmniejszania się ilości składników pokarmowych wzrost i namnażanie bakterii zaczyna przebiegać wolniej

5. faza równowagi -> zaczyna brakować składników pokarmowych, podłoże jest zatrute metabolitami mikroorganizmów. W tej fazie liczba bakterii które powstają i umierają jest taka sama - liczebność bakterii utrzymuje się na stałym poziomie

6. faza zamierania -> brak składników pokarmowych, silne zatrucie metabolitami. Liczba mikroorganizmów zaczyna spadać

Czas podwojenia -> okres upływający pomiędzy dwoma podziałami komórki.

1. hodowla ciągła -> liczba komórek utrzymuje się na stałym poziomie. Aby to było możliwe musi być zapewniony napływ nowych składników pokarmowych i odżywczych, a także odpływ zużytego podłoża wraz z metabolitami

2. hodowla synchroniczna -> wszystkie komórki dzielą się równocześnie, dzięki czemu obserwujemy skokowy przyrost liczby komórek. Aby osiągnąć hodowlę synchroniczną musimy wybrać do niej komórki jednakowej wielkości (w tym samym wieku) lub usunąć jakiś czynnik który ogranicza ich podziały, np. głód czy mróz

Badanie wzrostu bakterii w hodowli okresowej na przykładzie Escherichia coli.

Badamy zależność tempa wzrostu bakterii Escherichia coli od różnych czynników.

W tym celu przygotowujemy różne warianty hodowli:

• w bulionie odżywczym - który jest podłożem pełnym dla E.coli

• statycznie, temp. Pokojowa

• statycznie, temp. 37°C

• wytrząsanie, temp 37°C - (wytrząsanie powoduje lepsze natlenienie)

• na podłożu Davisa - które jest podłożem minimalnym dla E.coli

• statycznie, temp. Pokojowa

• statycznie, temp. 37°C

• wytrząsanie, temp 37°C

Wytrząsanie zapewnia lepsze warunki natlenienia

Tak więc mamy 6 wariantów o różnych warunkach temperatury, żywienia i natlenienia.

Hodowle zakładamy z hodowli nocnej - hodowli którą zakładamy poprzedniego dnia w godzinach popołudniowych (14-15), aby następnego dnia rano bakterie były w fazie wzrostu logarytmicznego.

Hodowle nocną rozcieńczamy odpowiednim świeżym podłożem w stosunku 1:20.

Następnie mierzymy absorbancję hodowli. Czynność powtarzamy 3 razy co godzinę.

Warunki/czas	Bulion odżywczy			Podłoże Davisa
		Stat, t. pok.	Stat, 37°C	Wytrz, 37°C	Stat, t. pok.	Stat, 37°C	Wytrz, 37°C
0	0,088	0,088	0,088	0,088	0,088	0,088
1h	0,123	0,267	0,376	0,097	0,126	0,128
2h	0,190	0,333	0,793	0,117	0,200	0,288
3h	0,242	0,393	1,068	0,150	0,262	0,545

Wnioski:

• dla E.coli podłożem bardziej optymalnym jest bulion odżywczy

• bardziej optymalna temp dla E.coli to 37°C

• wytrząsanie jest bardziej optymalne niż jego brak

Zadania

Oznaczanie liczebności Escherichia coli w hodowli nocnej

Średnia liczba koloni na płytkach przy rozcieńczeniu -5 => ok. 190 koloni

W 1 ml = 190*10⁶*10=1,9*10⁹cfu/ml hodowli nocnej

Zadanie:

Przy przewidywalnej liczebności bakterii 2*10⁹/ml jakie należy dobrać rozcieńczenie aby na szalce wyrosło 200 koloni?

200*10*10^x=2*10⁹

1000*10^x=10⁹

10^x=10⁶

Odp. Należy użyć rozcieńczenia 10^-6

Przez filtr membranowy przepuszczono 10 litrów wody. Po wysianiu próbki otrzymano 20 koloni. Ile mikroorganizmów znajduje się w 1 ml wody?

Szacownie liczebności mikroorganizmów w komorze Thomy:

Na boku szkiełka znajduje się specyfikacja określająca parametry jednego kwadratu z komory Thomy, np.:

1/400 mm², głębokość=1/10 mm => objętość=1/4000mm³

Śr. Liczba drożdży w kwadracie - 14 komórek

14 komórek - 1/4000mm³

x komórek - 1mm³

x komórek - 1mm³

y komórek - 1cm³

y=14*4000*1000=14*4*10⁶=5,6*10⁷/ml

odp. W 1 ml znajduje się ok. 5,6*10⁷ komórek drożdży

---