Wykład V
Rentgenografia
Umożliwia badanie bardzo dużych cząsteczek i dużych kompleksów molekularnych. Pozwala wyznaczać strukturę z dokładnością atomową dla obiektów rzędu kilku milionów Daltonów.
Np. tą techniką rozwiązano strukturę całego rybosomy bakteryjnego - olbrzymiego kompleksu funkcjonalnego o masie cząsteczkowej 2700 kD.
Technika opiera się na rozproszeniu promieniowania elektromagnetycznego o długości fali 1Å, czyli odpowiadającej odległościom międzyatomowym w cząsteczce. Makroskopowym obiektem, na którym świeci się w takim promieniowaniu jest kryształ molekularny, np. cząsteczki białkowej czy kwasu nukleinowego. Kryształ wyhodowany w specjalnych warunkach, jest regularną strukturą o ładnych krawędziach, łagodnych bokach, symetryczną, o wymiarach rzędu 1 - kilkadziesiąt mm. Regularność makroskopowa znajduje swoje odzwierciedlenie w regularności mikroskopowej.
Regularność może wykazywać cała cząsteczka, kilka cząsteczek lub tylko fragment. Z taką regularną cząstką łączymy tzw. komórkę elementarną, tj. zbiór punktów (węzłów) w sieci wyznaczających pewien równoległościan. W nim można usytuować naszą cząsteczkę.
Kryształ wykazuje regularność (symetrię) translacyjną w trzech kierunkach. Jeżeli komórkę elementarną będzie się odkładać nieskończoną ilość razy w różnych kierunkach, opisując boki wyznaczone przez te komórki elementarne uzyskamy taką regularną strukturę przestrzenną przez kryształ molekularny. Z punktu widzenia makroskopowego taki kryształ jest nieskończony (wymiary komórki elementarnej to nm, a wymiary makroskopowe kryształu to części dziesiąte mm).
Oprócz własności symetrii translacyjnej sieć, która utworzyła się poprzez powtarzanie komórki elementarnej wykrystalizowaną cząsteczką w trzech kierunkach, tzw. sieć brawe, ma również pewną lokalną symetrię wynikającą z tego, że można tutaj na komórce elementarnej wykonywać pewne operacje symetrii, np. obroty o pewien kąt, odbicia w różnych płaszczyznach i zawsze dostaniemy to samo. Obiekt po wykonaniu operacji symetrii pokrywa się z obiektem wyjściowym.
Symetria translacyjna sieci - można ją przesuwać w określonych kierunkach i zawsze dostajemy to samo (pokrycie wszystkich atomów jednej cząsteczki z atomami drugiej, po przesunięciu). Występuje razem z symetrią lokalną.
Przez złożenie symetrii lokalnej z symetrią translacyjną sieci można uzyskać tzw. grupę przestrzenną charakteryzującą daną sieć krystalograficzną i daną cząsteczkę, która wykrystalizowała. Ilość takich możliwych grup jest skończona, choć każda zawiera nieskończenie wiele elementów. W grupach symetria lokalna komórki elementarnej zgadza się z symetrią kryształu jako całości - grupy przestrzenne symetrii kryształu. Tych grup jest 230, mają swoje specyficzne oznaczenia, które dają nam pełną informację o symetrii cząsteczki wykrystalizowanej.
Sieć brawe jest tworem sztucznym, matematycznym. W węzłach nie muszą siedzieć atomy. Niemniej taki zbiór punktów matematyczny dobrze oddaje symetrię, zarówno lokalną, jak i całego obiektu.
Ważna jest też informacja o tzw. wymiarach komórki elementarnej, tj. o długościach boków A, B, C, na których rozpięta jest ta komórka i o kątach α, β i γ, które te boki tworzą ze sobą.
Symetria i wymiary komórki elementarnej to pełna informacja o krysztale.
Oddziaływanie promieniowania elektromagnetycznego z kryształem.
Jak w spektroskopii zjawisko polega na tym, że kwanty promieniowania elektromagnetycznego oddziałują z układem cząsteczkowym. W spektroskopii promieniowanie było pochłaniane (choć w niektórych metodach rozpraszane). Tu również rozpraszane, ale przy innej długości fali, od 1Å, czyli 0,1nm (w innych metodach do 100 nm). Takie rozproszenie wiąże się z efektami typowymi dla ugięcia fali, pojawia się interferencja. Na poszczególnych powłokach atomów umieszczonych regularnie w komórce elementarnej; regularność bardzo ważna, żeby zachodziła dyfrakcja. W wyniku dyfrakcji wiązka padająca daje efekty interferencyjne. W zależności od tego w którym kierunku zbieramy wiązkę rozproszoną, mamy albo wzmocnienie albo zanik, zależnie od różnicy pasm wynikających z różnej drogi optycznej poszczególnych promienie padających. Jeżeli różnica jest dodana do odległości międzyatomowych atomów, które rozpraszają, dostajemy wzmocnienie albo osłabienie.
Warunek na wzmocnienie: warunek Braga
Jeżeli rozpatrzymy dwa atomy rozpraszające w odległości d i kąt rozproszenia wyniesie β, to 2d sinβ = nλ
N - liczba o wartości 1, 2, 3, itd.
W wyniku spełnienia takiego warunku w pewnym kierunku wyznaczonym przez kąt β pojawi się prążek interferencyjny, tj. wzmocnienie fali.
Symetria i wymiary kom elementarnej jednoznacznie mówią o tym, w którym kierunku pojawi się wzmocnienie interferencyjne.
Intensywność prążków uwarunkowana gęstością elektronową w komórce elementarnej, czyli jak to promieniowanie się rozprasza. Gęstość elektronowa uwarunkowana przez rodzaje atomów i ich położenie w kom elementarnej.
De facto wykorzystanie rentgenografii w określaniu struktur przestrzennych cząsteczek sprowadza się d tego, żeby analizując intensywności tych prążków dyfrakcyjnych wyznaczyć mapę gęstości elektronowej, które opisują rozkład ładunku ujemnego. Na jej podstawie możemy wpasowywać poszczególne atomy i wiązania.
Kluczowy problem rentgenografii: problem fazowy
Od położeń atomów i ich rodzajów (gęstość elektronów) do rozkładu prążków i ich intensywności przechodzimy w ten sposób, że mapa gęstości elektronowej pozwala nam wyznaczyć tzw. czynnik strukturalny. Jest to wielkość nie rzeczywista, ale zespolona
E = a + bi
i - liczba zespolona, pierwiastek z -1
można ją również zapisać w sposób, który mówi nam skąd pojawia się kąt fazowy:
intensywność pierwiastek z a2 + b2 cos phi + i sin phi
Mamy więc postać zwykłą i postać trygonometryczną liczby zespolonej.
Czynnik strukturalny E jest liczbą zespoloną, gdyż powstaje w wyniku operacji na małej gęstości elektronowe - transformacji Fuviera, a ona daje w wyniku liczby zespolone.
Jeśli mamy mapę gęstości elektronowej, mamy rozkład atomów i wiązań, to zawsze dostaniemy teoretyczny dyfraktogram, możemy policzyć rozkład intensywności prążków dyfrakcyjnych. Jeżeli chcemy zrobić odwrotną operację, od intensywności prążków przejść do mapy elektronowej, sprawa jest bardziej skomplikowana, bo intensywność jest równa amplitudzie, czy też modułowi liczby zespolonej, tj. pierwiastek z a2 + b2.
Z intensywności możemy najwyżej wyznaczyć wartość bezwzględną, moduł liczby zespolonej, nie możemy wyznaczyć drugiego czynnika, którym jest kąt phi i nazywa się fazą w tej liczbie zespolonej.
Żeby skonstruować mapę gęstości elektronowej na podstawie intensywności prążków dyfrakcyjnych trzeba niezależnie wyznaczyć fazę.
Jak sobie radzimy z tym problemem?
Nie ma problemu, gdy mamy kryształ, w którym wykrystalizowały cząsteczki o niewielkiej masie cząsteczkowej. Dla małych cząsteczek, w której liczba atomów jest niewielka korzysta się z funkcji Patersona, która daje nam mapę odległości międzyatomowych cząsteczki kryształu. Jeżeli mało jest atomów, możemy łatwo przez analizę tej funkcji wyznaczyć położenie. Gdy rośnie ilość atomów gwałtownie zwiększa się ilość odległości. Dla białek i kwasów nukl sama analiza funkcji dla jednego dyfraktogramu nie wystarcza. Metody dla tych cząsteczek:
Metoda podstawienia molekularnego (MR - molecular replacement)
Jeśli mamy cząsteczkę, której struktury juz znamy a jest ona podobna do naszej nieznanej cząsteczki, a jednocześnie kryształ charakteryzuje się tą samą grupą symetrii, to można wziąć znane fazy i zastosować je do naszej cząsteczki. Później udokładniamy te fazy i uzyskujemy mapę gęstości elektronów.
Metoda wielokrotnego podstawienia izomorficznego (MIR - multuple izomorfals replacements)
Musimy dysponować dwoma, a najlepiej trzema izomorficznymi kryształami tej samej cząsteczki, przy czym w jednym krysztale (komórce el) siedzi sama cząsteczka, a w innych obok samej cząsteczki w komórce elementarnej musi być związany jakiś ciężki atom, czy ciężki jon. Czyli musimy dysponować kryształem zwykłej cząsteczki i kryształem cząsteczki zmodyfikowanej, gdzie np. jeden z atomów został zastąpiony ciężkim atomem. W przypadku kwasów nukleinowych często stosuje się zastąpienie grupy metylowej w tyminie bromem lub jodem (5-bromo(jodo)tymina). W przypadku białek jest łatwiej, bo często z nimi związane są jony. W komórce elementarnej obok cząsteczki musi więc siedzieć jakiś ciężki jon, np. rtęć. Taki ciężki jon lub atom bardzo intensywnie rozprasza promieniowanie rentgenowskie, co modyfikuje intensywności prążków dyfrakcyjnych. Z różnicy intensywności można odczytać położenie ciężkiego atomu w komórce elementarnej, jego współrzędne x, y, z. Jeżeli mamy punkt odniesienia w postaci ciężkiego jonu lub atomu, możemy odczytać położenie wszystkich innych atomów odnosząc się do niego. W dwóch kryształach muszą być inne centra rozpraszające (atom lub jon ciężki związane w innym miejscu).
Metoda MAD (anomalna dyfrakcja przy wielu długościach fali)
Tylko dla białek. Także stosuje się silne centrum rozpraszające. Mamy jeden kryształ cząsteczki białkowej, w którym w jednej z Met siarka zamieniona jest przez selen (selenometionina). Jeśli Met nie ma trzeba ją do sekwencji wprowadzić. Następnie stosuje się promieniowanie akceleratorowe (nie zwykłe lampy rentgenowskie), które umożliwia uzyskanie wiązki o różnych długościach fali promieniowania rentgenowskiego. Stosuje się dyfrakcje przy różnych długościach fali i to pozwala na podstawie tzw. anomalnego rozproszenia (w którym uczestniczy selen). Za pomocą obrazu tego rozproszenia można niezależnie uzyskać fazę.
Procedura otrzymywania mapy gęstości elektronowej na podstawie intensywności prążków.
- krystalizacja cząsteczki; często wiąże się z modyfikacjami, np. wycinanie części białka
Jak już mamy kryształ w buforze, to umieszcza się w odpowiedniej rurce kwarcowej, montuje się głowicę rentgenografu i najczęściej litryfikuje, tzn. para ciekłego azotu przeprowadza w niską temp, ale tak żeby woda znajdująca się w buforze nie utworzyła kryształu, tylko żeby nastąpiło zamrożenie struktury. Niska temp ogranicza ruchy molekularne i poprawia dokładność dyfraktogramu. Zamiast lambdy można stosować promieniowanie akceleratorowe (synkrotonowe). Po dyfrakcji promieniowania rentgenowskiego uzyskuje się obraz interferencyjny w detektorze, w którym stosuje się płyty obrazowania, w których powstają w wyniku padania promieniowania rentgenowskiego barwne centra, a ich intensywności otrzymuje się światłem laserowym. Na ekranie monitora możemy mieć cały czas obraz dyfrakcyjny naszej cząsteczki, można próbować robić analizę strukturalną.
Kryształy są bardzo delikatne, białkowy bardzo łatwo się rozpada pod wpływem nacisku mechanicznego, solny nie. Promieniowanie rentgenowskie niszczy kryształ, psuje się więc obraz dyfrakcyjny, pojawiają się defekty, dlatego doświadczenie nie może trwać zbyt długo.
Gdy mamy odpowiedni dyfraktogram, określamy grupę przestrzenną, sczytujemy intensywności, rozwiązujemy problem fazowy i konstruujemy wstępną mapę gęstości elektronowej. Na podstawie tak skonstruowanej mapy konstruujemy teoretyczny dyfraktogram i porównujemy z dyfraktogramem doświadczalnym. I tak w kółko. Staramy się osiągnąć minimum rozbieżności. Minimum rozbieżności określamy jako czynnik R, który określa sumę odstępstw intensywności prążków teoretycznych od zbieranych doświadczalnie. Jeśli R nie przekracza 25%, mamy strukturę wyznaczoną z dobrą dokładnością. Dobre wyznaczenie struktury możliwe tylko jeśli dysponujemy dobrej jakości kryształem. Dobry czynnik R możemy uzyskać jeśli mamy dyfraktogram o odpowiedniej rozdzielczości, która uwarunkowana jest przez jakość przekształceń (wymaga dobrego kryształu).
Zdolność rozdzielcza dyfraktogramu określa się w Å. Definicja: minimalna odległość płaszczyzn sieciowych (płaszczyzn przechodzących przez poszczególne atomy), z których jeszcze można zebrać jeden ren (??). Jeśli będzie się zmieniać kąt serii płaszczyzn, na których następuje odbicie, to w końcu te odległości będą tak małe, że nie dostaniemy już prążka. Jeżeli dysponujemy dyfraktogramami o rozdzielczości 2Å, to możemy uzyskać dokładność położenia atomów dochodzącą do tysięcznych części Å. Obecnie są już dyfraktogramy o rozdzielczości 1A i poniżej. Przy rozdzielczości 4, 5Å możemy lokować grupy atomów, mapy są mało dokładne.
Do odczytania struktury atomowej musimy mieć świetny kryształ o dobrej rozdzielczości 2A lub poniżej, musimy zastosować odpowiednią metodę rozwiązania problemu fazowego, w ten sposób otrzymamy odpowiednią wartość n.
Na podstawie takiego modelowania Watson i Crick zaprojektowali strukturę kwasów nukleinowych.
Problem dynamiki. Istotny był przy NMR, gdzie dostawaliśmy kilka zbliżonych struktur, wynikających z ruchu atomów. W rentgenografii dostajemy jedną bardzo dokładną strukturę z dokładnymi położeniami atomów. Może się zdarzyć, że cząsteczka wykrystalizuje w dwóch różnych formach, ale nie będzie to dynamika, tylko dwie sztywne niezależne cząsteczki.
Można jednak próbować analizować dynamikę ruchów molekularnych patrząc na tzw. czynniki temperaturowe, które określają dokładność lokalizacji poszczególnych atomów.
Drugim zagadnieniem związanym z dynamiką jest badanie rzeczywistych przejść strukturalnych, czy drogi reakcji enzymatycznej. Enzymy katalizują reakcje chemiczne nawet w kryształach, jeśli dostarczy się do białka odpowiedni substrat.
Technika Lauego - oparta na dyfrakcji promieniowania nie monochromatycznego, ale promieniowania o szerszym zakresie długości fali. Umożliwia otrzymanie dyfraktogramu w bardzo krótkim czasie, rzędu milisekund. Możliwe jest więc zbieranie obrazu na każdym etapie zachodzenia reakcji, np. zapis drogi reakcji enzymatycznej. Dyfraktogramy Lauego są jednak bardzo skomplikowane, ich obróbka bardzo trudna.
Tak więc rentgenografia daje nie tylko statyczny obraz cząsteczki, ale umożliwia też wyznaczenie pewnych elementów dynamiki.
Pozostaje jednak pytanie czy struktura cząsteczki funkcjonującej w roztworze nie jest odmienna od tej, która tworzy kryształ. Przeważnie struktura krystaliczna dobrze oddaje strukturę w roztworze, bo kryształ molekularny zawiera bardzo dużo wody (tzw. wody nieustrukturowanej, która nie daje obrazu dyfrakcyjnego), co zapewnia badanym cząsteczkom otoczenie przypominające roztwór. Czasami jednak zdarza się, że struktury się do końca nie pokrywają.
Dlaczego modelowania nie prowadzi się w sposób bezpośredni, tylko przez dyfraktogram lub widmo? Dlaczego nie stosuje się technik mikroskopowych?
Techniki mikroskopowe są uwarunkowane długością fali promieniowania. Jeżeli obiekt jest mniejszy niż długość fali promieniowania nie można uzyskać jego dobrego obrazu, pojawiają się efekty związane z falowymi własnościami światła (aberracyjne, chromatyczne, itd.). Granicą mikroskopów optycznych jest 200 nm.
Mikroskopy elektronowe wykorzystują fakt, że elektrony mają własności falowe, a więc z każdym elektronem przyspieszamy siły w polu elektrycznym można związać falę o określonej długości, te fale są bardzo krótkie. Niestety stosowane układy „optyczne”, tj. soczewki magnetyczne mają małą skuteczność i mimo krótkiej długości fali (co teoretycznie umożliwiłoby zobaczenie bardzo małej cząsteczki) de facto najlepsze mikroskopy skaningowe w niskich temp (tzw. krio-EM) mają zdolność rozdzielczą rzędu 10 nm. Można więc tylko oglądać ogólne kształty cząsteczki.
Jeśli chodzi o mikroskopy najlepsze rezultaty można uzyskać w mikroskopii sił atomowych (AFM). Pozwala popatrzeć na strukturę kompleksów od drugiej strony - na ogólny kształt, strukturę IVrzędową, na podjednostki, jakie budują białko, bez szczegółów atomowych. Technika znacznie prostsza niż rentgenografia, czy NMR.
Opis techniki: pojedynczą cząsteczkę w macierzystym buforze zawieszamy na powierzchni. Potem tą powierzchnię skanujemy przy pomocy rylca, który jest bardzo ostro zakończony. Im mniejszy promień krzywizny na końcu rylca, tym droższy. Między igłą a podłożem pojawiają się siły van der Waalsa o sile pikoniutonów (10-12 N). Skanujemy stosując odpowiedni mod (może uderzać szybciutko, może gładko iść po powierzchni). Aparat utrzymuje stale jednakową wartość siły pomiędzy końcówką, a podłożem. Służy do tego odpowiedni mechanizm ze sprzężeniem zwrotnym, igła znajduje się na wsporniku, który jest coś jakby sprężyną. Jeżeli igłą się poruszy, wspornik ulegnie przesunięciu, zmieni się wartość siły i układ będzie dążył do tego, żeby stałą siłę utrzymać. Na wspornik świeci się promieniowaniem laserowym, jeżeli położenie igły się zmienia, to położenie wspornika jest kompensowane i w ten sposób rylec idąc po powierzchni obrysowuje wszystko co się na niej znajduje. Stara się utrzymać stałą odległość od powierzchni, czyli stałą wartość siły van der Waalsa.
Rozdzielczość sięga 5A. Globalny obraz cząsteczki. Można obserwować np. transformacje cząsteczki pod wpływem zmiany warunków roztworu.
Wyznaczanie dynamiki ruchów molekularnych.
Nie patrzymy na pojedynczą cząsteczkę, tylko badamy dynamikę zbioru cząsteczek. A w zbiorach każda cząsteczka porusza się trochę inaczej. Dlatego najczęściej stosowanymi modelami są modele dyfuzyjne, czyli bazujące na ruchach przypadkowo zmiennych z czasie. Parametry opisujące ruchy cząsteczek to czasy - szybkości przejścia od jednej konformacji w drugą i czasy przebywania w określonej strukturze.
Możemy też określać amplitudy zmian. Jeżeli cząsteczka zmienia konformacje, przemieszczają się pewne fragmenty i możemy podawać zakresy tych przemieszczeń. Zmiany podajemy w A lub stopniach (zmiany kątowe).
Do wyznaczania tych czasów i amplitud dobrze służy np. spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (czasy relaksacji, tj. czasy powrotu do struktury wyjściowej od momentu wzbudzenia rezonansem). Służy też fluorescencja - śledzenie zmian konformacyjnych po wzbudzeniu impulsem światła widzialnego lub nadfioletowego. Istnieje też technika komputerowa - tzw. dynamika molekularna MD, pozwalające śledzić zmiany położenia atomów w czasie. Nie jest to jednak technika doświadczalna. Jeśli popatrzymy na cząsteczkę jako na zbiór atomów, tj. punktów materialnych, z których każdy jest obdarzony ładunkiem, to w takiej cząsteczce na każdy atom będą działały siły od wszystkich otaczających atomów, także od atomów rozpuszczalnika. Mając potencjał w przybliżeniu pola siłowego, możemy te siły obliczać. Mamy więc równania ruchu, które możemy obliczać w komputerze w sposób numeryczny, tzn. zadajemy położenia początkowe, zadajemy prędkości, pozwalamy działać siłom i rozwiązujemy równanie Newtona, czyli znajdujemy zmianę położeń i prędkości w czasie. Kolejne równanie rozwiązujemy co krok czasowy, który jest rzędu 10-15 sekundy. Ilość obliczanych równań jest olbrzymia, bo mamy równania na 3 składowe dla każdego atomu w cząsteczce i atomów rozpuszczalnika, jest ich więc kilkanaście, kilkadziesiąt tysięcy. Najlepsze komputery pozwalają ciągnąć taką symulację nie dłużej niż nanosekundy. W tym czasie zbadamy dynamikę jedynie ruchów molekularnych, które są krótsze niż czas symulacji.
MD może być wykorzystywana jako technika pomocnicza do technik doświadczalnych. Układ będzie dążyło stanu równowagi, tj. do minimum energii swobodnej Gibbsa. W czasie symulacji nie musi do tego punktu dojść, może się zatrzymać w różnych minimach lokalnych. Ale możemy mu pomóc wejść w strukturę, która jest znana z doświadczeniem. Z NMR dostajemy parametry przestrzenne - odległości między atomami, kąty dwuścienne; nie dostajemy bezpośrednio położeń poszczególnych atomów. Mając te odległości doświadczalne możemy spróbować dołączyć do ich potencjału takie pseudopotencjały, które będą się starały ściągnąć strukturę cząsteczki w trakcie symulacji do takiej, która jest zgodna z doświadczeniem. Zakładamy tzw. więzy na odległości pomiędzy atomami, na kąty dwuścienne i cząsteczka musi tam trafić, bo potencjał będzie ją tam ściągał. W ten sposób MD może nam ściągnąć strukturę wyjściową do struktury rzeczywistej w roztworze zgodnej z doświadczeniem.