Ćwiczenia (5) 30-10-2013
Wykrywanie obecności substancji hamujących w mleku
Substancje hamujące- pozostałości w mleku leków, antybiotyków, środków myjących i dezynfekcyjnych oraz innych związków które hamują wzrost szczepów bakteryjnych używanych do ich wykrywania metodami mikrobiologicznymi.
Normy
-PN-A- 86033:2002 Mleko i przetwory mleczne, mleko- wykrywanie antybiotyków i sulfonamidów (metoda odwoławcza)
-PN-EN ISO 13969:2006 wytyczne dotyczące znormalizowananego opisu mikrobiologicznych metod wykrywania substancji hamujących
-PN-EN ISO 183330:2005- wytyczne dotyczące znormalizowanego opisu immunologicznych lub receptorowych metod wykrywania pozostałości substancji hamujących
Substancje hamujące w mleku:
-antybiotyki,
-środki myjące i dezynfekcyjne,
-środki które hamują wzrost szczepów bakteryjnych używanych do ich wykrywania metodami mikrobiologicznymi
Konsekwencje obecności substancji hamujących w mleku
-alergia, anemia hemolityczna, zatrucia pokarmowe
-wzrost lekooporności bakterii chorobotwórczych
-zafałszowanie obrazu jakości mleka poprzez hamowanie rozwoju i wzrostu bakterii
-uniemożliwienie lub utrudnienie procesów produkcji serów dojrzewających, twarogów mlecznych i napojów fermentowanych
Metody wykrywania substancji hamujących
-mikrobiologiczne(dyfuzyjne)
-enzymatyczne
-inne: test Elisa, chromatografia, testy radioimmunologiczne, elektroforeza, spektrofotometria
Szczep testowy Bacillus stearothermophilus var. Calidolactic C 953
-dyfuzja metoda płytkowa
-szybki test dyfuzyjny
-polutest M
-BR- test
-delvotest
-enterotest I i II
-mikro-la-test
Szczep testowy Streptococcus termophilus T101
-Valio T101
Zasada wykrywania substancji hamujących metodami mikrobiologicznymi w mleku polega na zahamowaniu wzrostu szczepu testowego
Szczepy testowe:
-Bacillus stearothermophilus var. Calidolactis C 953
-Geobacillus stearothermophilus (ATTC 10149)
-Streptococcus termophilus T101
Podłoże do oznaczania substancji hamujących metodami mikrobiologicznymi zawiera:
-składniki odżywcze(bulion, glukoza itp)
-agar
-wskaźnik barwny
-przetrwalniki bakterii szczepów testowych
Mleko do wykrywania sh musi być świeże o normalniej kwasowości ponieważ nadkwaszenie zmienia barwę wskaźników zawartych w podłożach.
Dyfuzyjna metoda płytkowa
-preinkubacja - 64C(żeby przetrwalniki szybciej wykiełkowały) przez 2h
Nanoszenie mleka na płytkę:
-technika studzienkowa- polega na tym ze w agarze wierci się studzienki
-technika krążkowa
-technika cylinderkowa
-inkubacja właściwa 2 lub 4h w 64C w zależności od tego czy była wykonana preinkubacja czy też nie.
Interpretacja wyników- obecność substancji hamujących uwidacznia się przezroczystą, sinoniebieską strefą zahamowania wzrostu bakterii testowych wokół studzienek, krążków lub cylinderków, podczas gdy podłoże poza strefami wykazuje zmętnienie spowodowane wzrostem bakterii i zmianie zabarwienia na żółte(wynik pozytywny); w przypadku wyniku wątpliwego należy powtórzyć oznaczenie; powtórne uzyskanie wyniku wątpliwego należy traktować jako występowanie substancji hamujących; wokół próby kontrolnej występuje normalny wzrost szczepu testowego oraz zmiana barwy podłoża na żółtą(wynik negatywny).
Minimalne wykrywalne stężenia substancji hamujących- metodą płytkową
-penicylina sól sodowa penicyliny G 0,003
-neomycyna 0,2
-tetracyklina 0,6
-chlorotetracyklina 0,7
-streptomycyna 1.0
-chloramfenikol 0,7
-oksytetracyklina 0,4
-erytromycyna 0,3
-syntarpen 0,1
Szybki test dyfuzyjny STD/ biotest Gdańsk
-z zastosowaniem szczepu testowego B. stearothermophilus var. Calidolactis C 953
-podłoże produkowane jest w postaci gotowego preparatu w proszku STD-E lub w postaci gotowego podłoża w probówkach z tworzywa sztucznego STD-Abiotest.
Wykonanie oznaczenie
- do probówek należy dodać 0,1ml badanego mleka, a następnie inkubować w termostacie lub łaźni wodnej z wymuszonym ruchem wody w temp 64C przez 2,5-3h. Próbkę kontrolną inkubować wraz z próbkami badanymi. Po okresie inkubacji ocenić barwę podłoża testowego próbek badanych przez porównanie z próbkami kontrolnymi.
Odczytywanie wyniku
-niezmienione zabarwienie podłoża(fioletowe) wskazuje na obecność substancji hamujących. Zabarwienie żółte podłoża wskazuje na brak substancji hamujących
-przy uzyskaniu wyniku wątpliwego należy przedłużyć inkubację do 3,5h. W przypadku utrzymywania się wątpliwego wyniku należy po dodatkowej inkubacji powtórzyć oznaczenie. Powtórne uzyskanie wyniku wątpliwego traktuje się jako występowanie substancji hamujących w badanej próbce.
Polutest M
-zmiana barwy podłoża z purpurowej(lub sinopuprpurowej) na zółtokremowa świadczy o nieobecności substancji hamujących As i Blue star.
-minimalne wykrywalne stężenie substancji hamujących: sól sodowa penicyliny G- 0,003-0,004j.m/ml, bacytracyna 0,2, pozostałe antybiotyki 0,1-1,0 ug
Br test 9test z redukcyjny z czernią brylantową)
-minalne wykrywalne stężenie substancji hamujących: penicylina 0,0030
-pozostałe s.h:16,0ug, barwa granatowoniebieska- obecność s.h, barwa żółta- brak
Delvotest
-występuje w dwóch odmianach- do wykrywania antybiotyków (P) oraz do wykrywania antybiotyków i sulfonamidów (SP)
-minimalne wykrywalne stężenia substancji hamujących: penicylina G- 0,003-0,005, pozostałe antybiotyki0,008-20,0, sulfonamidy 50-100ug/ml
Valio T101
-przeznaczony jest do wykrywania w mleku pozostałości antybiotyków i sulfonamidów
-drobnoustrojem testowym jest Streptoccocus termophilus T101
-zasada testu polega na zmianie koloru wskaźnika niebiesko na jasnożółty(żółtozielony) pod wpływem kwasu mlekowego produkowanego przez S. termophilus
Metody enzymatyczne
-test Penzym:
-Penzym test farmerski
-Penzym 100 wersja tabletkowa
Służy do wykrywania w mleku zawartości antybiotyków beta-laktamowych(penicyliny naturalne, półsyntetyczne i syntetyczne, cefalosporyny, cefamycyny, karbapenem, monobaktamy
Składniki testy PENZYM
-fiolka a: DD-karboksypeptydaza(penicylinaza)
-fiolka b: substrat (polipeptyd zawierający D-alaninę) i orto-dwuanizydyna(wskaźnik)
-fiolka c: peroksydaza dwunukleotyd flawinoadeninowy i oksydaza d-aminokwasowa
-kwas siarkowy roztw. 50%
Przebieg testu polega na zablokowaniu przez antybiotyk betalaktomowy aktywności enzymu bakteryjnego DD karboksypeptydazy. Jeżeli jest beta laktam to zachodzi hamowanie enzymu. Przy braku antybiotyku zachodzi reakcja= DD karboksypeptydaza powoduje
Wykrywanie pozostałości antybiotyków betalaktamowych polega na wywołaniu reakcji barwnej której przebieg w dużym skócie jest nastepujący:
-gry brak jest antybiotyku: DD karboksypeptydaza uwalnia z syntetycznego substratu D alaninę, Uwolniona D alania ulega utlenieniu przez oksydazę Daminokwasową do kwasu pirogronowego z jednoczesnym powstaniem odpowiedniej ilości nadtlenku wodoru. Nadtlenek wodoru utlenia następnie wskaźniki dwuanizydynę a po dodaniu kwasu siarkowego mleko zabarwia się na różowo.
-gdy w melku jest antybiotyk:
DD karbosypeptydaza ulega inaktywacji i nie dochodzi do powyższej reakcji i mleko nie zmienia barwy- pozostaje biało-żółta
-równolegle wykonać nalezy próbę kontrolną i ślepą na mleku wolnym od antybiotyków; w przypadku próby ślepej zamiast kabokspeptydazy używać wody destylowanej
Test Elisa
-stosowane są do poszczególnych grup antybiotyków min. beta-laktomowych
-stosowany jest w lab badawczych
Beta-s.t.a.r 25
I etap- inkubacja specyficznego receptora z mlekiem
Test zawiera specyficzny receptor beta-laktamowy związany z odrobiną złota. Wstępna inkubacja powoduje interakcję antybiotyku z receptorem
II etap- przeniesienie badane roztworu na podłoże immunochromatograficzne w formie paska. Odczyt wykonujemy na podstawie obecności i zabarwienia dwóch linii na podłożu
I linia- wiąże wszystkie receptory które nie zetknęły się z antybiotykiem
II linia- linia referencyjna
-Jeżeli nie pojawi się II linia- test jest nieważny- mleko kwaśne, skrzep itp
-Jeżeli I linia jest zabarwiona intensywniej niż II: Wynik ujemny- brak antybiotyków beta-laktamowych
-jeżeli I linia jest zabarwiona podobnie jak linia II wynik dodatni- obecność antybiotyków Beta laktamowych
-jeżeli brak I linii- duże stężenie antybiotyków Beta-laktamowych
Chromatografia
-stosowana w laboratoriach badawczych i odwoławczych
-wysoka czułość oznaczenia ng/kg
-bibułowa
-cienkowarstwowa
-cieczowa
-gazowa
Testy radioimmunologiczne Charma z wykorzystaniem znaczników izotopowych
-zasadą jest reakcja wiązania funkcjonalnych grup antybiotyków przez specjalne receptory lub dodawane dla mleka komórki bakteryjne. Używa się antybiotyków znakowanych 14C lub 3H, które konkurują z zawartymi w próbce. Kompleksy receptor-antybiotyk wydzielone są z próbki i poddawane pomiarowi promieniowania w scyntylatorze. Wynik porównuje się z próbą przeprowadzaną dla mleka wolnego od s.h. im więcej antybiotyku tym niższy poziom promieniowania.
Metoda szybka i dokładna ale droga i wymagające specjalistycznego sprzętu.
Elektroforeza i spektrofotometria
-opracowane ale stosowane w bardzo małym stopniu
1