GENETYKA WYKŁAD 4

DNA

- odkryte w końcu XIX w. - w grasicy zwierzęcej przez szwajcarskiego biochemika Miescher'a

- RNA - odkryte w komórkach drożdży

dowody na to, że DNA jest odpowiedzialny za dziedziczenie uzyskano metodami biologicznymi ( -> związane z transofrmacją, metodą przenoszenia materiału genetycznego; inne sposoby jego przenoszenia to transdukcja i koniugacja*)

* patrz skrypty z ćwiczen nr X i XI

koniugacja - u bakterii typy płciowe: Hfr, F⁺ oraz F^-

transdukcja - przenoszenie materiału genetycznego przy pomocy faga; przenoszone są b. małe cząsteczki

transformacja - materiał pobierany jest w postaci „nagiej” wprost ze środowiska przez ukompetentnione komórki biorcy; może odbywać się naturalnie lub w sposób sztuczny (transformacja indukowana)

można syntezować geny metodami fizykochemicznymi

w 1968 Khorana zrobił syntezę genu kodującego tRNA - dostał za to Nobla

właściwości DNA:

- maximum absorpcji przy 260 nm (promieniowanie UV - dlatego nim identyfikuje się DNA i dlatego UV może mutować DNA)

- tworzy kompleksy z bromkiem etydyny [Ethydium bromaid]

- podczas elektroforezy migruje w kierunku anody; duże DNA migruje wolniej

na podstawie długości czasu migracji fragmentów DNA można wyznaczyć ich ciężar

dowody na dziedziczenie DNA:

• biologiczne

- 1928 Griffith uzyskał transformację u Streptococcus pneumoniae (dwoinka zapalenia płuc)

doświadczenie Griffita:

komórki fazy S - mają otoczki (mają różne typy: 1,2,3)

komórki fazy R - szorstkie, bez otoczki

komórki gładkie bezotoczkowe

fazy S - wirulentne, powodują śmierć gospodarza

Griffith wszczepił myszom fazy R i S i gładkie bezotoczkowe

 S - myszy ginęły 

 R - myszy przeżywały

następnie fazy S zabito w temp. 50-65 ^oC; myszy przeżywały

podano myszom R + zabite S - myszy padały (efekt letalny) 

zabite S przekazywały bakteriom R jakąś cechę (DNA), w wyniku czego przechodziły one w fazę S

wnioski:

1. fazy R i S mogą wzajemnie w siebie przechodzić

2. fazy zabite S przekazały fazom R cechy wirulencji

3. cecha ta musi być związana z materiałem genetycznym przekazanym na drodze transformacji

• biochemiczne

- 1934 Avery: powtórzył transformację i wykazał metodami biochemicznymi DNA

9.9 objętości etanolu (służy do wytrącania DNA) zmieszano z DNA; tworzy się biała zawiesina (wytrącone DNA), którą wirowano i potem analizowano

∂ 7 marca 1953 - odkrycie helisy DNA - model Watsona - Cricka

1962 - nagroda Nobla

odkrycie ważne z chemicznego i biologicznego punktu widzenia

kwasy nukleinowe:

- DNA (+mitochondrialny i plastydowy)

- mRNA

- rRNA

- tRNA

RNA to także materiał dziedziczny - dla wirusów

nukleotydy - podstawowe jednostki DNA, tworzą długie nierozgałęzione łańcuchy (które mogą się składać nawet z miliardów nukleotydów)

~ połączone wiązaniami 3' 5' fosfodiestrowymi

zasady azotowe: puryny A G

pirymidyny C T U

~ puryna łączy się z pirymidyną: A=T; G≡C

obrazy rentgenografii krystalicznej dostarczyły dowodów na helikalną budowę DNA; zajmowała się tym Rosalind Franklin, która nie dostała za to Nobla - bo była kobietą i jej praca została wykorzystana przez Watosna i Cricka ( o czym rzadko się wspomina)

skok w helisie co 3,4 nm; 2 nm średnicy helisy

łańcuch jest asymetryczny z powodu antyrównoległego ułożenia nici nukleotydowych

∂ 1979 - prof. Ułaszewski rozmawiał z Jamesem Watsonem (!) 

semikonserwatywna replikacja DNA - jedna nić zawiera w sobie informację dla syntezy drugiej nici (jest dla niej matrycą)

po syntezie DNA/ mamy 1 starą nić i 1 nową w helisie DNA

lata 50. - Stahl i Messelsen wykorzystali do badań DNA izotop wodoru - tryt H³ i azotu - N¹⁵

wyznakowany DNA można zidentyfikować metodami autoradiograficznymi i metodą wirowania w gradiencie chlorcu cezu

dodano N¹⁵ do pożywki bakterii

po 1 podziale i 1 rundzie replikacyjnej - 1 nić ciężka i 1 lekka

po kolejnych coraz więcej łańcuchów z lekkimi nićmi ( bo bakterie przeniesiono na N¹⁴)

~synteza DNA w interfazie

jedna nić - Watsona (wiodąca)

druga nić - Cricka (opóźniona)

w czasie replikacji tworzą się widełki replikacyjne, lokalne rozplecenie - dzięki HELIKAZIE

GYRAZA - likwiduje ujemne skręty

struktura III-rzędowa DNA decyduje o powinowactwie polimerazy

białko represora ulega rozcieńczeniu - powstaja widełki; jest kilka modeli widełek - nie wiadomo, który prawdziwy

replikacja 5' --------> 3'

nić wiodąca ( 3' -> 5') - synteza ciągła

nić opóźniona 200-1000 fragmenty OKAZAKI (mogą się później łączyć dzięki LIGAZIE)

POLIMERAZA I, II, III

- zależna od DNA, odpowiada za replikację

- do replikacji potrzebne:

- trifosoorany 4 nukleotydów

- primer (kilkanaście nukleotydów)

- polimeraza

- Mg²⁺ jako kofaktor stymulujący polimerazę

pomyłka w replikacji zdarza się 1x na 10⁹ przyłączonych nukleotydów

~ pomyłka powoduje mutację punktową

są mechanizmy naprawcze korygujące błędy (które jeżeli zawiodą - pojawia się mutacja)

KOD GENETYCZNY

- relacja między sekwencją nukleotydów w DNA a sekwencją aa [aminokwasów, amino-acids] w białku

- poszczególne kodony (3 nukleotydy) kodują 1 aa

- ważnych aminokwasów jest 23

- kod dwójkowy dałby tylko 16 kombinacji (4²) - to za mało

kod trójkowy: 4³ - 64 kombinacje

~ 61 - kodujące aminokwasy

~ 3 kodony STOP - UAA, UAG, UGA

- pewne kodony są preferowane przez Eucaryota, a pewne przez Procaryota

- te same białka mogą występować w różnych organizmach, ale są kodowane przez jedne geny

- kilka hipotez powstania:

 4 mld lat temu pojawił się z kosmosu (teoria panspermii sterowanej Cricka)

cechy kodu genetycznego:

• uniwersalny - obowiązuje wszystkie organizmy

są wyjątki - AUG - STOP (kodon nonsensowny); w mitochondrium - tryptofan

różnice w cytozynie: ~ 5-metylocytozyna - rośliny

~ 5-hydroksymetylocytozyna - fagi

• trójkowy

1964 - Nierenberg dokonał syntezy wszystkich kodonów i pokazał jakie aa kodują

• bezprzecinkowy - kolejne nukleotydy, kolejne trójki kodują kolejne aminokwasy

ABC ABC ABC

delecja B  ACA BCA BC

addycja C  ABC ACB CAB C

• jednoznaczny - dany kodon koduje zawsze ten sam aa

• kolinerarny - kolejność kodonów decyduje o kolejności aa w białku ( o strukturze I-rzędowej)

• niezachodzący

hipoteza Gamowa - kod zachodzący czyli poszczególny nukleotyd wchodzi w skład kilku trójek (hipoteza okazała się nieprawdziwa)

odkrycie anemii sierpowatej wykazało, że pojedynczy nukleotyd zmienia tylko 1 aa, a nie kilka

• zdegenerowany - więcej niż 1 kodon koduje ten sam aa

sygnał początkowy: AUG , ATG - początek syntezy białka, oba kodony kodują metioninę

mutacja w:

3 nukleotydzie - zazwyczaj nie są letalne

2 nukleotydzie - są najgorsze, nie do naprawienia, śmierć zygotyczna

1 nukleotydzie - można naprawić

bardzo ważne jest poznanie współdziałania genów

typ preferencyjny = typ dziki

przeciwdziałanie efektom fenotypowym - to np. odpowiednia dieta itp.

OD

260 [nm]

4

---