GENETYKA WYKŁAD 4
DNA
- odkryte w końcu XIX w. - w grasicy zwierzęcej przez szwajcarskiego biochemika Miescher'a
- RNA - odkryte w komórkach drożdży
dowody na to, że DNA jest odpowiedzialny za dziedziczenie uzyskano metodami biologicznymi ( -> związane z transofrmacją, metodą przenoszenia materiału genetycznego; inne sposoby jego przenoszenia to transdukcja i koniugacja*)
* patrz skrypty z ćwiczen nr X i XI
koniugacja - u bakterii typy płciowe: Hfr, F+ oraz F-
transdukcja - przenoszenie materiału genetycznego przy pomocy faga; przenoszone są b. małe cząsteczki
transformacja - materiał pobierany jest w postaci „nagiej” wprost ze środowiska przez ukompetentnione komórki biorcy; może odbywać się naturalnie lub w sposób sztuczny (transformacja indukowana)
można syntezować geny metodami fizykochemicznymi
w 1968 Khorana zrobił syntezę genu kodującego tRNA - dostał za to Nobla
właściwości DNA:
- maximum absorpcji przy 260 nm (promieniowanie UV - dlatego nim identyfikuje się DNA i dlatego UV może mutować DNA)
- tworzy kompleksy z bromkiem etydyny [Ethydium bromaid]
- podczas elektroforezy migruje w kierunku anody; duże DNA migruje wolniej
na podstawie długości czasu migracji fragmentów DNA można wyznaczyć ich ciężar
dowody na dziedziczenie DNA:
biologiczne
- 1928 Griffith uzyskał transformację u Streptococcus pneumoniae (dwoinka zapalenia płuc)
doświadczenie Griffita:
komórki fazy S - mają otoczki (mają różne typy: 1,2,3)
komórki fazy R - szorstkie, bez otoczki
komórki gładkie bezotoczkowe
fazy S - wirulentne, powodują śmierć gospodarza
Griffith wszczepił myszom fazy R i S i gładkie bezotoczkowe
S - myszy ginęły
R - myszy przeżywały
następnie fazy S zabito w temp. 50-65 oC; myszy przeżywały
podano myszom R + zabite S - myszy padały (efekt letalny)
zabite S przekazywały bakteriom R jakąś cechę (DNA), w wyniku czego przechodziły one w fazę S
wnioski:
fazy R i S mogą wzajemnie w siebie przechodzić
fazy zabite S przekazały fazom R cechy wirulencji
cecha ta musi być związana z materiałem genetycznym przekazanym na drodze transformacji
biochemiczne
- 1934 Avery: powtórzył transformację i wykazał metodami biochemicznymi DNA
9.9 objętości etanolu (służy do wytrącania DNA) zmieszano z DNA; tworzy się biała zawiesina (wytrącone DNA), którą wirowano i potem analizowano
∂ 7 marca 1953 - odkrycie helisy DNA - model Watsona - Cricka
1962 - nagroda Nobla
odkrycie ważne z chemicznego i biologicznego punktu widzenia
kwasy nukleinowe:
- DNA (+mitochondrialny i plastydowy)
- mRNA
- rRNA
- tRNA
RNA to także materiał dziedziczny - dla wirusów
nukleotydy - podstawowe jednostki DNA, tworzą długie nierozgałęzione łańcuchy (które mogą się składać nawet z miliardów nukleotydów)
~ połączone wiązaniami 3' 5' fosfodiestrowymi
zasady azotowe: puryny A G
pirymidyny C T U
~ puryna łączy się z pirymidyną: A=T; G≡C
obrazy rentgenografii krystalicznej dostarczyły dowodów na helikalną budowę DNA; zajmowała się tym Rosalind Franklin, która nie dostała za to Nobla - bo była kobietą i jej praca została wykorzystana przez Watosna i Cricka ( o czym rzadko się wspomina)
skok w helisie co 3,4 nm; 2 nm średnicy helisy
łańcuch jest asymetryczny z powodu antyrównoległego ułożenia nici nukleotydowych
∂ 1979 - prof. Ułaszewski rozmawiał z Jamesem Watsonem (!)
semikonserwatywna replikacja DNA - jedna nić zawiera w sobie informację dla syntezy drugiej nici (jest dla niej matrycą)
po syntezie DNA/ mamy 1 starą nić i 1 nową w helisie DNA
lata 50. - Stahl i Messelsen wykorzystali do badań DNA izotop wodoru - tryt H3 i azotu - N15
wyznakowany DNA można zidentyfikować metodami autoradiograficznymi i metodą wirowania w gradiencie chlorcu cezu
dodano N15 do pożywki bakterii
po 1 podziale i 1 rundzie replikacyjnej - 1 nić ciężka i 1 lekka
po kolejnych coraz więcej łańcuchów z lekkimi nićmi ( bo bakterie przeniesiono na N14)
~synteza DNA w interfazie
jedna nić - Watsona (wiodąca)
druga nić - Cricka (opóźniona)
w czasie replikacji tworzą się widełki replikacyjne, lokalne rozplecenie - dzięki HELIKAZIE
GYRAZA - likwiduje ujemne skręty
struktura III-rzędowa DNA decyduje o powinowactwie polimerazy
białko represora ulega rozcieńczeniu - powstaja widełki; jest kilka modeli widełek - nie wiadomo, który prawdziwy
replikacja 5' --------> 3'
nić wiodąca ( 3' -> 5') - synteza ciągła
nić opóźniona 200-1000 fragmenty OKAZAKI (mogą się później łączyć dzięki LIGAZIE)
POLIMERAZA I, II, III
- zależna od DNA, odpowiada za replikację
- do replikacji potrzebne:
- trifosoorany 4 nukleotydów
- primer (kilkanaście nukleotydów)
- polimeraza
- Mg2+ jako kofaktor stymulujący polimerazę
pomyłka w replikacji zdarza się 1x na 109 przyłączonych nukleotydów
~ pomyłka powoduje mutację punktową
są mechanizmy naprawcze korygujące błędy (które jeżeli zawiodą - pojawia się mutacja)
KOD GENETYCZNY
- relacja między sekwencją nukleotydów w DNA a sekwencją aa [aminokwasów, amino-acids] w białku
- poszczególne kodony (3 nukleotydy) kodują 1 aa
- ważnych aminokwasów jest 23
- kod dwójkowy dałby tylko 16 kombinacji (42) - to za mało
kod trójkowy: 43 - 64 kombinacje
~ 61 - kodujące aminokwasy
~ 3 kodony STOP - UAA, UAG, UGA
- pewne kodony są preferowane przez Eucaryota, a pewne przez Procaryota
- te same białka mogą występować w różnych organizmach, ale są kodowane przez jedne geny
- kilka hipotez powstania:
4 mld lat temu pojawił się z kosmosu (teoria panspermii sterowanej Cricka)
cechy kodu genetycznego:
uniwersalny - obowiązuje wszystkie organizmy
są wyjątki - AUG - STOP (kodon nonsensowny); w mitochondrium - tryptofan
różnice w cytozynie: ~ 5-metylocytozyna - rośliny
~ 5-hydroksymetylocytozyna - fagi
trójkowy
1964 - Nierenberg dokonał syntezy wszystkich kodonów i pokazał jakie aa kodują
bezprzecinkowy - kolejne nukleotydy, kolejne trójki kodują kolejne aminokwasy
ABC ABC ABC
delecja B ACA BCA BC
addycja C ABC ACB CAB C
jednoznaczny - dany kodon koduje zawsze ten sam aa
kolinerarny - kolejność kodonów decyduje o kolejności aa w białku ( o strukturze I-rzędowej)
niezachodzący
hipoteza Gamowa - kod zachodzący czyli poszczególny nukleotyd wchodzi w skład kilku trójek (hipoteza okazała się nieprawdziwa)
odkrycie anemii sierpowatej wykazało, że pojedynczy nukleotyd zmienia tylko 1 aa, a nie kilka
zdegenerowany - więcej niż 1 kodon koduje ten sam aa
sygnał początkowy: AUG , ATG - początek syntezy białka, oba kodony kodują metioninę
mutacja w:
3 nukleotydzie - zazwyczaj nie są letalne
2 nukleotydzie - są najgorsze, nie do naprawienia, śmierć zygotyczna
1 nukleotydzie - można naprawić
bardzo ważne jest poznanie współdziałania genów
typ preferencyjny = typ dziki
przeciwdziałanie efektom fenotypowym - to np. odpowiednia dieta itp.
OD
260 [nm]
4