Laboratorium z biochemii

Ćwiczenie nr 9

Enzymatyczna hydroliza pektyn

Magdalena Dudek

Paulina Ziółczyk

Wydział: Biotechnologii i Nauk o Żywności

Kierunek: Biotechnologia:

Rok: III

gr. V

Cel ćwiczenia:
Poznanie wpływu temperatury, pH, zastosowania aktywatorów i inhibitorów na szybkość reakcji enzymatycznych.

Wstęp teoretyczny:

Szybkość danej przemiany katalizowanej przez enzym jest ściśle uzależniona od stężenia enzymu oraz substratu, a także od: stężenia jonów H⁺(pH), temperatura w jakiej reakcja zachodzi, obecność inhibitorów i aktywatorów oraz koenzymów, siła jonowa i stała dielektryczna środowiska.

Wpływ pH:

Kiedy pH oddala się od wartości optymalnej dla danego enzymu jego aktywność się obniża, ponieważ utrudnione zostaje łączenie się enzymu z substratem, może nawet dojść do inaktywacji enzymu w przypadku ekstremalnych wartości pH. Enzymy jako białka charakteryzują się określonym stanem jonowym zależnym od wartości pI i pH środowiska.

W pH optymalnym stan jonizacji enzymu jest taki, że najszybciej tworzy się kompleks enzym-substrat i substrat najszybciej przechodzi w produkt.

Dla większości enzymów optymalne jest pH 5,5 - 7,4. Znane są jednak enzymy, które działają najlepiej w środowisku kwaśnym (np. pepsyna w pH 1,5 - 2,7; fosfataza kwaśna pH 4 - 6) lub zasadowym ( trypsyna, chymotrypsyna - pH 7 - 9; fosfataza zasadowa pH 8-9 ). Dla jeszcze innych enzymów najkorzystniejsze jest środowisko bliskie obojętnego (dehydrogenaza mleczanowa pH 7,2; kinaza pirogronianowa pH 7,4).

Wpływ temperatury:

Zależność szybkości reakcji od temperatury możemy opisać równaniem Arrheniusa:

V=k[S] k=Ae^-Ea/RT

Wzrost temperatury zwiększa szybkość reakcji enzymatycznych, ponieważ wywołuje wzrost energii kinetycznej reagujących cząsteczek i generuje większą częstość zderzeń. Podwyższenie temperatury o 10º powoduje dwu- trzykrotny wzrost szybkości reakcji chemicznych. Ponieważ enzym jest substancją białkową, wzrost temperatury powyżej temperatury optymalnej dla jego działania powoduje stopniową denaturację i zanik zdolności katalitycznych enzymu. Dla większości enzymów zmiany denaturacyjne zachodzą intensywnie powyżej 40-50º, jednakże znane są również takie, które wykazują znaczną odporność na inaktywujące działanie podwyższonej temperatury- mówimy wtedy, że cechuje je wysoka termostabilność.
Krzywa zależności aktywności enzymatycznej od temperatury posiada charakterystyczne maksimum, przy którym szybkość katalizowanej reakcji jest największa (kształt dzwonowy).

Wpływ aktywatorów i inhibitorów:

Inhibitory to substancje hamujące działanie enzymów.

Aktywatory to związki niskocząsteczkowe, których obecność w miejscu katalizy enzymatycznej przyspiesza przebieg reakcji.

Do aktywatorów zaliczamy:

-jony metali ciężkich (zwłaszcza dwuwartościowych)

- substancje białkowe, które odmaskowują grupy czynne enzymów

- niskocząsteczkowe związki organiczne, znoszące działanie inhibitorów enzymów

Inhibitory mogą mieć charakter specyficzny lub niespecyficzny.

Wśród inhibitorów specyficznych wyróżniamy:

-inhibitory kompetycyjne (współzawodniczące)- są to substancje podobne do substratu na tyle, że mogą przyłączyć się do centrum aktywnego, ale na tyle różne od substratu, że nie mogą przekształcić substrat w produkt. Ten typ inhibicji ma charakter odwracalny i zależy od stosunków względnych inhibitora i substratów.

-Inhibitory niekompetycjne ( niewspółzawodniczące)- wiążą się z enzymem w innym miejscu niż w centrum aktywnym (w tzw. centrum allosterycznym). Swoją budową nie przypominają substratu. Wyróżniamy takie, które:

~Łączą się z wolnym enzymem- właściwe inhibitory niekompetycyjne;

~Przyłączają się do kompleksu enzym-substrat. Następuje zakleszczenie substratu w centrum aktywnym i nie może on zostać przeprowadzony w produkt. Jest to inhibicja nieodwracalna.

Przebieg enzymatycznej amylolizy:

Α-amylaza to enzym katalizujący reakcję hydrolizy skrobi, szeroko rozpowszechniony
w przyrodzie. Wytwarzają je liczne drobnoustroje oraz organizmy roślinne i zwierzęce. Rozkłada tylko wewnętrzne wiązania α-1,4-glikozydowe, degraduje skrobię do mieszaniny glukozy, maltozy i oligosacharydów redukujących.

1. Wpływ pH na aktywność α-amylazy

Wykonanie:

Do 6 probówek odmierzyłyśmy 1 cm³ roztworów buforowych o pH 3, 4, 5, 6, 7, 8. Następnie do każdej probówki dodałysmy po 2 cm³ roztworu koloidalnego skrobi. Do buforowanych roztworów skrobi dodałysmy w równych odstępach czasu po 1 cm³ roztworu α-amylazy, po czym mieszałyśmy zawartość probówki. Co 0,5 min próby każdego z hydrolizatów przenosiłyśmy na uprzednio przygotowane płytki z roztworem jodu w jodku potasu. Obserwowałyśmy zabarwienie powstające na płytkach. Pobieranie kontynuowałyśmy tę czynność do chwili, gdy jedna z prób w reakcji z jodem dała zabarwienie herbaciane. Wówczas w równych odstępach czasu dodawałyśmy do hydrolizatów po 3 krople roztworu jodu w jodku potasu.

Tabela nr.1. Obserwacje i wnioski z zadania.

pH	Zabarwienie hydrolizatu w reakcji z jodem w KJ	Stopień hydrolizy skrobi (rodzaj produktu)
3	granat	Skrobia nierozłożona
4	fioletowo-niebieskie	Pojawiły się amylodekstryny
5	Jasny fiolet przechodzący w przejrzysty	Achrodekstryny z erytrodekstrynami
6	Fiolet	Mieszanina amylo-i erytrodekstryn
7	Fiolet ciemny + granat	Skrobia nierozłożona+ niewielki dodatek amylodekstryn
8	granat	Skrobia nierozłożona

Wnioski:

Różne zabarwienie próbek świadczy o różnym stopniu hydrolizy skrobi. Na podstawie przeprowadzonego doświadczenia możemy określić, że pH optymalne dla działania
α-amylazy wynosi 5.

2. Wpływ temperatury:

Wykonanie:
Do 6 probówek odmierzyłyśmy 1 cm³ koloidalnego roztworu skrobi i po 0,5 cm³ buforu o pH optymalnym dla działania badanego preparatu równym 5. Kolejno inkubowałyśmy każdą
z probówek w czasie 5 min w następujących temperaturach: pokojowa, 40, 50, 60, 70, 80ºC (temperatury inne niż pokojowa to temperatura łaźni wodnej). Po 5 min inkubowania do każdej probówki dodałyśmy 0,5 ‍cm³ roztworu α-amylazy. Wymieszałyśmy i inkubowałyśmy dalej przez 3 min. Dokładnie po 3 min od momentu dodania α-amylazy 0,5 cm³ wprowadziłyśmy do uprzednio przygotowanej próbki zawierającej 0,5 cm³ roztworu DNS. Wymieszałyśmy, umieściłyśmy na 5 min we wrzącej łaźni wodnej, następnie schodziłyśmy
i dodałyśmy 4 cm³ wody destylowanej. Zawartość probówek wymieszałyśmy i zmierzyłyśmy absorbancję roztworu wobec próby odczynnikowej przy długości fali 540 nm. (W międzyczasie przygotowałyśmy próbkę odczynnikową zawierającą wodę destylowaną zamiast mieszaniny reakcyjnej oraz DNS).

Wyniki (obserwacje):

Tabela nr 2. Stężenie cukrów redukujących w przeliczeniu na maltozę zawartych
w mieszaninie reakcyjnej dla różnych temperatur hydrolizy.

Temperatura hydrolizy ºC	pokojowa	40	50	60	70	80
Stężenie cukrów redukujących mg maltozy/ cm^3	0,55	0,69	1,31	0,88	0,242	0,15

Wykres 1 (na podstawie tabeli nr 2)

Zależność stężenia cukrów redukcyjnych ( w mg maltozy/cm³) od temperatury.

Wnioski:

Optymalna Temperatura działania enzymu wynosi 50ºC. Stężenie cukrów redukujących zawartych w próbie jest miarą szybkości reakcji. Maksimum tej krzywej to temperatura optymalna działania enzymu. Wzrastająca część wykresu obrazuje wzrost stężenia cukrów redukujących, czyli wzrost szybkości reakcji spowodowany wzrostem temperatury, zaś część malejąca obrazuje spadek stężenia cukrów redukujących (szybkości reakcji) spowodowany denaturacją termiczną białka.

3. Badanie termostabilności α-amylazy

Wykonanie:

Do 6 probówek odmierzyłyśmy 1 cm³ roztworu α-amylazy i 1 cm³ buforu o pH optymalnym równym 5. Następnie każdą z probówek inkubowałyśmy w temperaturach: pokojowej, 40, 50, 60, 70 i 80ºC w ciągu 10 min. Po upływie 10 min roztwory schłodziłyśmy przy użyciu bieżącej wody(do temperatury pokojowej), następnie dodałyśmy po 2 cm³ koloidalnego roztworu skrobi i dokładnie wymieszałyśmy. Następnie inkubowałyśmy przez 3 min w temperaturze pokojowej. Po upływie tego czasu 0,5 cm³ mieszaniny reakcyjnej wprowadziłyśmy do probówek zawierających 0,5 cm³ roztworu DNS. Wymieszałyśmy i wstawiłysmy do wrzącej łaźni wodnej na 5 min, po czym schłodziłyśmy, dodałysmy 4 cm³ wody destylowanej i po wymieszaniu zmierzyłysmy ekstynkcję roztworu przy długości fali 540 nm w porównaniu do próby odczynnikowej. Na podstawie zmierzonych wartości ekstynkcji odczytano z krzywej wzorcowej stężenie cukrów redukujących w mieszaninie reakcyjnej. Wyniki zamieszczono w tabeli nr 3.

Tabela nr 3. Stężenie cukrów redukcyjnych w przeliczeniu na maltozę dla różnych temperatur preinkubacji.

Temperatura preinkubacji ºC	Pokojowa	40	50	60	70	80
Stężenie cukrów redukcyjnych mg maltozy/ cm^3	0,55	0,54	0,5	0,343	0,186	0,118

Wykres 2. Na podstawie tabeli nr. 3
Zależność stężenia cukrów redukcyjnych od temperatury preinkubacji.

Wnioski:

W zakresie temperatur od ok. 20(temp. Pokojowa) do ok. 50^oC enzym wykazał termostabilność, nie stracił swojej aktywności

4. Wpływ aktywatorów i inhibitorów na α-amylazę

Wykonanie:

Do 3 probówek odmierzyłyśmy po 3 cm³ koloidalnego roztworu skrobi. Do probówki 1 dodałyśmy 0,5 cm³ wody destylowanej, do drugiej 0,5 cm³ roztworu NaCl, do trzeciej 0,5 cm³ CuSO₄. Następnie do wszystkich dodałyśmy 1 cm³ roztworu α-amylazy śliny. Badałyśmy stopień hydrolizy skrobi pobierając z każdej z probówek próbkę hydrolizatu w celu wykonania reakcji z roztworem jodu w jodku potasu na wcześniej przygotowanych płytkach porcelanowych. Czynność tę powtarzałyśmy do momentu, kiedy próba jednego z hydrolizatów nie dała ujemnego wyniku. Wtedy do wszystkich probówek dodałyśmy
4 krople roztworu jodu w jodku potasu.

Obserwacje:

Roztwór w probówce z wodą destylowaną zabarwił się na fioletowo, roztwór w którym znajdowało się NaCl zabarwił się a kolor jasnofioletowy, natomiast z CuSO₄ granatowo.

Wnioski:

W próbce nr. 1 skrobia uległa hydrolizie, ponieważ fioletowy kolor tej próbki świadczy
o obecności mieszaniny amylodekstryn i erytrodekstryn. Zawartość probówki 2 także uległa hydrolizie, ale zaszła ona dalej niż w przypadku roztworu w probówce nr 1. Jasno fioletowe zabarwienie próbki świadczy o obecności achrodekstryn i erytrodekstryn. Enzym został aktywowany. Aktywatorem α-amylazy śliny są jony Cl^-. Próbka trzecia zabarwiła się na kolor granatowy, co świadczy o tym, że skrobia nie uległa hydrolizie. Enzym został zinaktywowany. Inhibitorem α-amylazy śliny są jony Cu²⁺.

---