GENETYKA WYKLAD 9
- mapowanie fizyczne i klasyczne (genetyczne) - daje pełny obraz genów
- sekwencjonowanie i fragmentowanie DNA - enzymy restrykcyjne
- diagnoza - „finger print”
- PCR - poza komórką
kombinacja technik => umożliwia diagnostykę np. chorób, ustalenie ojcostwa (zastosowanie inżynierii (mapy restrykcyjne, diagnozy restrykcyjne)
~ klonowanie, izolowanie genów
- izolacja, określenie sekwencji, wprowadzenie do komórki gospodarza, uzyskanie ekspresji określonych genów => to b. ważne, konieczne etapy w badaniach, inżynierii
wektory:
markery selekcyjne
miejsca replikacji (plazmidy bakteryjne R6K, EcoRI - z nich konstruowane wektory)
wprowadzenie wyizolowanych genów:
- transformacja - najczęstsza metoda
~ obecnie nienaturalnie (in vitro), do kompetentnych komórek gospodarza
- transdukcja
- koniugacja - małe zastosowanie
TRANSFORMACJA
- w komórkach bakteryjnych proces łatwo można indukować, jest inna ściana komórkowa, łatwo DNA wnika do komórki (głównie u E. coli)
- konieczne wywołanie kompetencji w komórkach bakteryjnych do pobierania DNA ze środowiska
- gorzej u Eucaryota - trudno uczynić komórkę kompetentną
usunięcie ściany, np. drożdży, żeby DNA mogło wniknąć, uzyskanie protoplastu lub sferoplastu zachowana część ściany)
trzeba użyć dużo sorbitolu (dobre warunki osmotyczne, komórka bez ściany nie będzie pękać)
dodanie CaCl2 - powoduje kompetencję (także u bakterii) - powoduje rozszerzenie porów
3-5 tyś. transformantów drożdżowych uzyskuje się z 1 μg DNA
trudności - odpowiednia temperatura agaru
- nieodpowiednia regeneracja ściany
- długa procedura
- metoda chlorku litu - usprawnienie procesu
kompetencja komórek drożdżowych
uzyskuje się mniej transformantów, ale duża wydajność reakcji i nie trzeba robić protoplastyzacji
rozluźnienie barier
kompetencja - zdolność do przyjęcia DNA
~ brane komórki z fazy logarytmicznej (nie stacjonarnej)
~
- ELEKTROPORATORY:
impuls elektryczny 2,7 kV/cm2 w czasie 1/15 ms => powoduje elektroporację, otwarcie kanałów i w efekcie pobranie DNA
bardzo duża wydajność procesu na 1 μg DNA (kilka mln)
sterowane komputerowo
u bakterii, drożdży, zwierząt, roślin
do organizmów wyższych stosuje się działo, kulki złote lub wolframowe (patrz dalej)
- sens transformacji tylko wtedy, gdy gen ulega ekspresji
należy przygotować odpowiednie promotory
część niekodująca
zbiera sygnały z zewnątrz (bodźce, hormony)
- klonowanie genów organizmów wyższych, u drożdży lub Procaryota
promotor musi być zawsze! z komórki gospodarza
różne promotory w zależności od genu, o wysokiej ekspresji
np. galaktozydazy GAL1 - typowe dla drożdży
fosfatazy PH0
enolazony EN01
należy dopilnować żeby była niezmieniona ramka odczytu
- ważna potranslacyjna obróbka w komórce gospodarza, bo t zapewnia odpowiednią konformację i aktywność
metody odczytywania genów:
PCR dobre tylko dla małych fragmentów (polimeraza się myli; do kilku tyś. nukeotydów)
- problem z genami mozaikowymi
- introny trzeba zlikwidować - dlatego izolację prowadzi się na matrycach mRNA
IZOLACJA NA MATRYCACH mRNA
- wyspecjalizowane komórki organizmów zwierzęcych produkują specjalne białko (np. w jajowodach ptaków)
- mRNA to czynnik ekspresji genów jakiegoś białka, w pewnych komórkach dużo 1 typu mRNA
~ Temis i Baltimore - Nobel za odkrycie odwrotnej transkryptazy
- mRNA DNA (zgodnie z dogmatem biologii molekularnej)
pseudogen (bez intronów) wprowadzany do wektora, potem zrekombinowany z DNA biorcy
metoda „SHOT GUN” - strzał na ślepo
- przypadkowa fragmentaryzacja DNA jądrowego na małe fragmenty, określonym enzymem (np. BamH1) wprowadza się do wektora, tu też działa enzym; tworzą się lepkie końce ( bo tniemy tym samym enzymem) i powstają rekombinanty
- cały genom w różnych częściach wektora (bank genów, biblioteka genowa); liczne kopie
~ przechowywane w postaci klonów bakteryjnych
~ duża liczba transformantów z wektorem i określonym fragmentem DNA - miliony komórek w banku genów, różne metody przechowywania i przekazywania; lub też w postaci DNA w temp. -70oC
metoda PRZECIWCIAŁ
- ekspresja genu, otrzymanie produktu (białko
- przeciwciała - stwierdzenie, które komórk produkują dane białko
identyfikacja produktów genu
metoda HYBRYDYZACJI
- mały fragment DNA znakowany sondą molekularną, identyfikowany, znakowany P32 (małym fragmentem łapiemy duży fragment)
- spacer po chromosomach - izolacja kolejnych fragmentów DNA zawierających dany gen
metoda komplementacji w komórkach gospodarza (defektywnej funkcji)
- defektywny mutant drożdży, np. uszkodzenie oddychania
- transformujemy mutanta strukturami fenotypu dzikiego
- mutacja nie może być dominująca i wielogenowa
- na plazmidzie będzie gen znoszący efekty mutacji - odpowiednik diploidu
- analiza transformanta, izolacja DNA plazmidowego
- sprawdzamy segregacje mitotyczną
- transformujemy E. coli (która ma plazmid wahadłowy)
- izolujemy z bakterii i mamy gen
SEKWENCJONOWANIE genu:
- procedury Maxama-Gilberta (analiza produktów chemicznej degradacji DNA)
- metody Sangera:
analiza produktów syntezy DNA
znakowanie izotopami starterów, na matrycy DNA
obecne czytnik laserowy i barwniki fluorescencyjne
- analiza in silico gdy mamy sekwencję
- ORF - potencjalny gen, nieznana jeszcze funkcja biologiczna
zwykle należy zniszczyć dany gen żeby sprawdzić, za co jest odpowiedzialny
metoda PCR
- laboratoria biotechnologiczne, analiza restrykcyjna
- amplifikacja DNA in vitro
- amplifikuje się niewielkie fragmenty (kilkaset - kilka tyś. nukleotydów)
- potrzebna znajomość sekwencji z lewej i prawej flanki fragmentu, który chcemy amplifikować (starter, primer)
- polimeraza Taq
- komputerowe zmiany temperatury, w odpowiednim czasie, ustalenie warunków odpowiednich dla procesu
I denaturacja DNA w 90oC, 1 min.
II wplecenie na 2 nici
przyłączenie starterów (użyte w nadmiarze) do końców obu nici
~ zablokowanie denaturacji
renaturacja i asocjacja, 40-60oC, 2 min
startery => początki replikacji DNA
III polimeryzacja, odtworzone 4 nici na dwóch matrycowych
72oC, 1,5 min
polimeraza Taq
- proces narasta wykładniczo: 2n (n-liczba cykli)
przy 34 cyklach - miliony cząsteczek DNA
- PCR = reakcja łańcuchowa polimerazy (polymerase chain reaction)
zastosowanie PCR:
- izolacja genu
- amplifikacja DNA śladowego, ze szczątków
identyfikacja roślin, zwierząt, odtwarzanie genomów
błyskawiczna diagnostyka chorób bakteryjnych, wirusowych, nowotworowych (wirusy HCV, HIV; grzyby, Chlamydomonas)
- metoda klasyczna: daje 10% pewności przy ustalaniu ojcostwa
metoda finger print: 99-100% pewności
metoda FINGER PRINT
- analiza restrykcyjna + hybrydyzacja + PCR + krew
- ustalanie ojcostwa
- stwierdzenie tożsamości rodziny carskiej zamordowanej przez Lenina
ważny problem dla genetyki
car Mikołaj II, żona, 4 córki, 1 syn, 3 słuących (lekarz nadworny), pies
wyizolowano DNAmit ze szkieletu (nie ulega rozkładowi, nie ulega modyfikacji bo nie ma systemów naprawczych - idealne do badań)
Filip jest krewnym, z hemofilią, książę angielski, potomek królowej Wiktorii
porównano jego DNA z DNA żony (była jego cioteczną babką)
3 córki i matka - jest pokrewieństwo ( z Filipem)
książę Aleksander => brat Mikołaja (porównanie chromosomów Y)
- każda matka daje początek nowemu członowi mitochondrialnemu (36 klonów), Ewa mitochondrialna
- kombinacje różnych technik - dają dobre wyniki
- modne konstruowanie drzew genealogicznych (ale kosztowne)
- duża rola amplifikacji w kryminalistyce
wykorzystywanie inżynierii genetycznej
- organizmy transgeniczne (myszy, tytoń, D. melanogaster)
4