OTRZYMYWANIE KAROTENÓW
Karotenoidy są barwnikami roślinnymi z grupy tetraterpenów. W komórkach są zlokalizowane w chloro- i chromoplastach. Barwa ich jest wynikiem występowania w cząsteczce sprzężonych układów wiązań podwójnych. Dzięki zdolności absorbowania światła widzialnego odgrywają rolę barwników pomocniczych w fotosyntezie, a także przypisuje się im znaczenie w ochronie centrów fotosyntezy przed fotooksydacją. Karotenoidy dzielimy na karoteny (węglowodory) i ksantofile (alkohole, ketony, epoksydy).
Celem ćwiczenia jest otrzymanie β-karotenu z soku marchwiowego.
A. 100 ml soku marchwiowego umieściliśmy w rozdzielaczu i dodaliśmy heksanu (w którym dobrze rozpuszczają się karotenoidy). Fazę organiczną zachowaliśmy dodając wody a następnie odparowaliśmy do sucha na wyparce obrotowej pod zmniejszonym ciśnieniem.
B. Otrzymywanie frakcji lipidów nie ulegających zmydlaniu.
Do kolby dodaliśmy 96% etanolu a następnie 60% wodnego roztworu KOH. Hydrolizę alkaliczną przeprowadzamy w celu rozłożenia acylolipidów. Roztwór pozostawiliśmy w ciemności do następnego dnia. Po tym czasie dodaliśmy wodę i eteru etylowego i przenieśliśmy zawartość do rozdzielacza. W fazie znajdowały się lipidy, które ulegają zmydlaniu, a w fazie eterowej lipidy nierozpuszczalne w wodzie. Fazę wodną ponownie ekstrahowaliśmy eterem etylowym aby odzyskać lipidy nie ulegające zmydlaniu. Następnie ekstrakt zobojętniliśmy i dodaliśmy bezwodnego siarczanu sodu w celu jego wysuszenia. Po odsączeniu siarczanu sodu sączku przemyliśmy go porcjami eteru etylowego a następnie połączone przesącze odparowaliśmy na wyparce obrotowej. Suchą pozostałość rozpuściliśmy w heksanie i pobraliśmy 50 μl do analitycznej chromatografii cienkowarstwowej.
C. Chromatografia kolumnowa.
W chromatografii kolumnowej (podziałowej) rozdzielenie mieszaniny opiera się na różnej rozpuszczalności jej związków w dwóch nie mieszających się rozpuszczalnikach. Jeden z rozpuszczalników, unieruchomiony na nośniku, stanowi fazę nieruchomą, natomiast drugi przemieszcza się względem pierwszego i stanowi fazę ruchomą. Rozdzielane substancje dzielą się między fazę ruchomą i nieruchomą zgodnie z ich rozpuszczalnością w tych fazach. Substancje, które lepiej rozpuszczają się w fazie nieruchomej migrują wolniej i to właśnie prowadzi do rozdziału.
Na kolumnę nanieśliśmy frakcję lipidów nie ulegających zmydlaniu. Kolumnę eluowaliśmy heksanem aż do momentu całkowitego wymycia wędrującego w tym układzie żółtego prążka. Otrzymaną frakcję zatężyliśmy do sucha, po czym rozpuściliśmy w heksanie i pobraliśmy próbkę 50 μl do analitycznej chromatografii cienkowarstwowej.
D. Analityczna chromatografia cienkowarstwowa.
Na plastikową płytkę pokrytą żelem krzemionkowym nanieśliśmy próby z kolejnych etapów oczyszczania oraz wzorzec β-karotenu. Płytkę rozwijaliśmy w układzie heksan: chloroform (7:3; v/v).
Po rozwinięciu wyznaczyliśmy wartość Rf dla β-karotenu, która wyniosła 0,75.
β-karoten pojawia się wysoko na płytce, ponieważ jest związkiem mało polarnym pozbawionym grup tlenowych.
E. Wyznaczanie widma absorpcyjnego.
Otrzymany w pkt C preparat rozcieńczyliśmy 5 razy heksanem (aby wartość absorbancji przy długości fali 450 nm wynosiła 0,5- 0,6) i zmierzyliśmy spektrofotometrycznie. Na wykresie widać 3 szczyty absorpcji (jeden jest słabo zarysowany).
Na podstawie uzyskanych wyników obliczamy ilość otrzymanego karotenu.
A1% dla β-karotenu przy 449 nm wynosi 2592.
0,01 - 2592
X - 1.231
X= 4,75 μg na 100 ml
Małgorzata Proboszcz
Joanna Wójtowicz