Plasmid Mini

zestaw do izolacji ultraczystego plazmidowego DNA

Protokół

numery katalogowe 020-50, 020-250

01

Zestaw przeznaczony jest do izolacji plazmidowego DNA z 1.5 - 3 ml hodowli bakteryjnej

Wst´p

Zestaw opiera si∏ na zdolnoÊci wiàzania si∏ DNA do złó× krzemionkowych w wysokich

st

ę×eniach soli chaotropowych.W pierwszym etapie bakterie poddawane sà lizie

alkalicznej, a nast∏pnie lizat zoboj∏tniany jest buforem GL3. Bufor ten powoduje

precypitację chromosomalnego DNA i białek, pozostawiajàc jednoczeÊnie plazmidowe

DNA w roztworze. Po odwirowaniu próbki, supernatant zawierajàcy plazmidowe

DNA nanoszony jest na minikolumn∏ ze specjalnym zło×em krzemionkowym. DNA

przechodzàc przez zło×e osiada na nim, podczs gdy zanieczyszczenia przechodzà nie

wià×àc si∏. Po wypłukaniu z kolumny resztek zanieczyszczeƒ, oczyszczone plazmidowe

DNA wymywane jest z niej buforem TE lub wodà i nadaje si∏ do bezpoÊredniego

wykorzystania bez koniecznoÊci precypitacji. DNA uzyskane przy u×yciu tego zestawu

doskonale nadaje si∏ do wszelkich metod stosowanych w biologii molekularnej, w tym do

automatycznego sekwencjonowania.

Uwagi

1. PojemnoÊć minikolumny do oczyszczania DNA wynosi 20 μg

2. SDS znajdujàcy si∏ w roztworze L2 precypituje w niskich temperaturach, dlatego

gdy roztwór nie jest klarowny nale×y go ogrzać w temperaturze 40°C do uzyskania

całkowitej klarownoÊci.

Protokó∏ izolacji

1. Osad z 1.5 - 3 ml nocnej hodowli bakterii dokładnie zawiesić przez pipetowanie lub

worteksowanie w 200 μl roztworu do zawieszania L1.

2. Dodać 200 μl alkalicznego roztworu lizujàcego L2 i po wymieszaniu przez kilkukrotne

odwracanie probówki pozostawić 3 min. w temperturze pokojowej.

Uwaga!

Po dodaniu roztworu L2 nale×y ostro×nie mieszać zawartoÊć probówki aby nie spowodować

fragmentacji chromosomalnego DNA. Zwykle wystarczy 5 - 6-cio krotne odwrócenie probówki. Po 3

minutach inkubacji lizat powinien być całkowicie klarowny. Je×eli nie jest nale×y odwrócić lizat kilka

razy i przedłu×yć czas inkubacji o dalsze 3 minuty.

3. Dodać 400 μl roztworu zoboj∏tniajàcego GL3 i wymieszać przez kilkukrotne

odwracanie probówki.

4. Wirować 10 minut przy 10 - 15 tys. RPM.
5. Ostro×nie wlać supernatant do minikolumny do oczyszczania plazmidowego DNA.
6. Wirować 1 minut∏ przy 10 - 15 tys. RPM.
7. Wyciàgnàć minikolumn∏ z probówki, wylać przesàcz i ponownie wło×yć jà do

probówki.

A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, 81-451 Gdynia, Poland
tel [phone], fax [phone], www.aabiot.com, [e-mail]

Protokół

02

8. Dodać do kolumny 500 μl pierwszego roztworu płuczàcego W.
9. Wirować 1 minut∏ przy 10-15 tys. RPM.
10. Wyciàgnàć minikolumn∏ z probówki, wylać przesàcz i ponownie wło×yć kolumn∏

do probówki.

11. Dodać do kolumny 600 μl drugiego roztworu płuczàcego A1.
12. Wirować 2 minuty przy 10-15 tys. RPM.
13. Osuszonà minikolumn∏ umieÊcić w nowej probówce 1.5 ml i do zło×a znajdujàcego

si∏ na dnie kolumny dodać 60 μl roztworu TE lub wody.

14. Próbk∏ inkubować 3 minuty w temperaturze pokojowej.
15. Wirować 1 minut∏ przy 10-12 tys. RPM.
16. Kolumn∏ usunàć a oczyszczone plazmidowe DNA znajdujàce si∏ w probówce

przetrzymywać w lodówce do czasu dalszych analiz.

A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, 81-451 Gdynia, Poland
tel [phone], fax [phone], www.aabiot.com, [e-mail]