1

Przedmiot:

Podstawy genetyki klinicznej

II Rok, Wydział Lekarski I
Katedra i Zakład Genetyki Medycznej UM w Poznaniu

Diagnostyka molekularna w medycynie

Osoba prowadząca: Dr n.biol. Anna Wawrocka

Diagnostyka molekularna chorób genetycznych

 Zmiany

materiału genetycznego są submikroskopowe, dostępne do badania jedynie metodami biologii

molekularnej.



Są to głównie choroby jednogenowe, ale również wieloczynnikowe i nowotworowe.



Molekularne badania diagnostyczne pozwalają na szybką weryfikację rozpoznania klinicznego i stanowią

nowoczesną metodę diagnostyki wielu chorób uwarunkowanych genetycznie.

Izolacja DNA

- pełna krew obwodowa (limfocyty)
- komórki płynu owodniowego (AFC)
- komórki kosmówki (CVS)
- hodowle fibroblastów
- komórki epitelialne
- cebulki włosów
- plamy krwi, nasienia
- fragmenty tkanek
- szpik kostny

Metody izolacji DNA:

1.

Izolacja DNA z zastosowaniem fenolu i chloroformu celem odbiałczenia preparatów

2.

Izolacja DNA przebiegająca przez wysolenie białek z lizatów komórek

3. Izolacja DNA poprzez

związanie z nośnikiem, odmycie zanieczyszczeń i uwolnienie DNA

Izolacja DNA z krwi obwodowej

– metodą wysalania białek

Etapy:
1.

Liza komórek bezjądrzastych

2. Liza leukocytów
3. Odbiałczanie
4. Wytrącanie DNA alkoholem

Hybrydyzacja (renaturacja)

–

Tworzenie podwójnej helisy między komplementarnymi niciami DNA lub RNA pochodzącymi z różnych źródeł.
Oddziaływanie badanego fragmentu DNA i sondy molekularnej prowadzi do utworzenia hybrydu (dupleksu) o
dwuniciowej strukturze.
Metody hybrydyzacji molekularnej:
-Southern Blotting,
-DNA fingerprinting,
-Northern blotting,
-In situ hybridization (FISH).

Sondą molekularną mogą być:
-syntetyczne oligomery
-

syntetyczne bądź naturalne geny lub ich fragmenty

-cDNA
-

fragmenty chromosomów

-

całe genomy bakteryjne

Sonda molekularna musi być zdenaturowana (jednoniciowa). Łączenie sondy molekularnej z docelowym fragmentem
kwasu nukleinowego zachodzi zgodnie z komplementarnością zasad.
Sonda jest wyznakowana radioaktywnie lub nieradioaktywnie np. fluorescencyjnie.

2

Hybrydyzacja typu Southern (ang. Southern blot hybridization)

–

Stosowana najczęściej, dotyczy hybrydyzacji DNA-DNA. Ma na celu wyszukanie sekwencji DNA spośród mieszaniny
fragmentów otrzymanych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi.
Stosując hybrydyzację typu Southern można wykryć:
-

rearanżacje genowe np. delecje albo insercje, większe od 50-100 pz (Dystrofia mięśniowa Duchenne’a)

-

mutacje punktowe, które tworzą nowe lub zmieniają dotychczasowe miejsce restrykcyjne dla enzymu, stosowanego

do trawienia DNA

Hybrydyzacja typu Northern Blot (ang. Northern blot hybridization)

– dotyczy hybrydyzacji RNA pacjenta z sondą

molekularną. Stosowana w celu badania ekspresji genów.

DNA Fingerprinting
W metodzie tej wykorzystuje się obecność w genomie polimorficznych sekwencji powtórzonych VNTR (variable
number of tandem repeats)

– zmienna liczba tandemowych powtórzeń. W wyniku hybrydyzacji VNTR z sondami

molekularnymi rozpoznającymi jednocześnie kilkanaście loci otrzymuje się dla każdego osobnika charakterystyczny
obraz fragmentów DNA tzw. fingerprint, odcisk genetyczny
Zastosowanie:
-ustalanie ojcostwa
-badania medyczno-

sądowe

PCR-

(ang.polymerase chain reaction) reakcja łańcuchowa polimerazy



Metoda PCR przyspieszyła uzyskiwanie wyników w pracach nad poznaniem struktury i funkcji genów.



Kary Mullis zastosował termostabilną polimerazę w reakcji łańcuchowej polimerazy, w 1987r.

 Nagroda Nobla z chemii w 1993r.
 Reakcja ta

odzwierciedla naturalny proces replikacji i umożliwia w warunkach in vitro szybkie powielenie

wybranych odcinków DNA lub RNA (przepisanego na cDNA przy użyciu reakcji odwrotnej transkrypcji).



Badana sekwencja DNA jest powielana przy użyciu pary oligonukleotydowych starterów, z których każdy jest
komplementarny do jednego k

ońca sekwencji docelowej DNA. Startery te są wydłużane w kierunku

przeciwnym, za pomocą termostabilnej polimerazy DNA



W cyklu który obejmuje trzy podstawowe etapy:

- denaturacja dwuniciowej matrycy

– 90-95°C,

-

wiązanie starterów do jednoniciowej matrycy 50-65°C,

- synteza nici komplementarnej 68-

72°C



Wizualizacja produktów PCR następuje poprzez rozdział elektroforetyczny. Cząsteczki DNA umieszczone w
żelu migrują w polu elektrycznym od ujemnie do dodatnio naładowanej elektrody, a ich szybkość zależy od
wielkości cząsteczki – im mniejsze tym szybciej będą się przesuwały w żelu. Wybarwione bromkiem etydyny
(mutagen interkalujący DNA) są widoczne po naświetleniu światłem UV.

PCR-RFLP (ang. restriction fragments length polymorphism)
Analiza

polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych. Polega ona na amplifikacji fragmentu DNA, w obrębie

którego występuje marker RFLP (fragment DNA zawierający miejsce restrykcyjne), a następnie jego trawieniu
odpowiednim enzymem restrykcyjnym.
Zastosowanie:
-

identyfikacja mutacji punktowych w obrębie miejsca rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny

Przykład: fenyloketonuria, anemia sierpowata, hemofilia

Multipleks PCR



jednorazowo można amplifikować
ok.10 markerów



można badać DNA zmieszany
i zdegradowany

Zastosowanie:

duże mutacje genowe: delecje, duplikacje, insercje

Hybrydyzacja ASO (ang. allele specific oligonucleotide)



polega na hybrydyzacji z sondą specyficzną
dla produktu PCR



sonda rozpoznaje allel dziki (prawidłowy) lub zmutowany

Zastosowanie:
wykrywanie mutacji punktowych,

które nie zmieniają miejsc restrykcyjnych

Przykład: głuchota wrodzona, mukowiscydoza

3

MSP-PCR - PCR specyficzny dla metylacji (ang.methylation specific PCR)

 Do wykrywania metylacji CpG w genomowym DNA
 Dwusiarczyn

sodu przekształca niemetylowaną cytozynę na uracyl



W celu uwidocznienia efektu metylacji, DNA modyfikuje się kwaśnym siarczynem sodowym Porównanie
próbki DNA poddanej działaniu dwusiarczynu i próbki normalnej ujawnia metylację cytozyny



PCR prowadzi się z dwoma zestawami starterów, specyficznymi dla kopii metylowanej i niemetylowanej.

Przykłady: Zespół Pradera - Williego (PWS), Zespół Angelmana (AS)
U podstaw patogentycznych PWS znajduje się regulacja ekspresji genów nazywana

rodzicielskim piętnem

genomowy

m. PWS spowodowany jest brakiem aktywności genów w regionie chromosomu 15 pochodzącym od ojca,

które ulegają piętnowaniu (są nieaktywne) na chromosomie 15 pochodzącym od matki. Zmiany w DNA w tym samym
cytogenetycznie regionie, ale pochodzące od matki odpowiedzialne są za zespół Angelmana.

Wynik badania molekularnego dla pacjentów z zespołem PWS i AS:
Kontrola-

obecność kopii matczynej i ojcowskiej

PWS -

obecny tylko fragment pochodzący z kopii matczynej

AS -

obecny tylko fragment pochodzący z kopii ojcowskiej

Sekwencjonowanie DNA, główne metody

 Metoda enzymatyczna

– polimeraza DNA syntetyzuje komplementarną kopię matrycy DNA

 Metoda chemiczna

– znakowany fragment DNA ulega reakcji ze związkami specyficznymi dla

poszczególnych zasad

Sekwencjonowanie

DNA, metodą enzymatyczną



Metoda enzymatyczna została opracowana przez Sangera i wsp. W 1977r.



Opiera się na zdolności polimerazy DNA do wbudowywania 2’3’-dideoksynukleozydotrifosforanów (ddNTP).
Wbudowanie ddNTP

(terminatora) powoduje zatrzymanie elongacji w miejscu A, C, G lub T. W każdej reakcji

stosowany jest tylko jeden nukleotyd terminujący.

QF-PCR (ang. Quantitive fluorescence polymerase chain reaction)

 QF-

PCR znalazła zastosowanie w diagnostyce prenatalnej (wybranych aberracji chromosomowych). Jest to

ocena ilości kopii chromosomów 13, 18, 21, X i Y.



Opiera się na wykorzystaniu jako markerów sekwencji STR (ang. short tandem repeats)



Rutynowo źródłem DNA są amniocyty występujące w płynie owodniowym, pobieranym na drodze
amniopunkcji od około 13 tygodnia ciąży



Startery do amplifikacji poszczególnych STR są znakowane fluorescencyjnie, odczyt odbywa się za pomocą
sekwenatora kapilarnego

PCR w czasie rzeczywistym

– (ang. Real Time PCR)



Metoda ilościowa oparta na amplifikacji DNA in vitro- opiera się na pomiarze liczby kopii DNA, przez pomiar
fluorescencji

Zastosowania aplikacji real-time PCR:



Ilościowe określanie ekspresji genów



Testowanie stabilności genetycznej



Wydajność terapii lekowych/monitorowanie leków



Ilościowe określanie DNA wirusowego



Detekcja patogenów



Uszkodzenia DNA (niestabilność mikrosatelitarna)



Określanie czasu ekspozycji na promieniowanie



Obrazowanie in vivo procesów komórkowych

 Studia nad DNA mitochondrialnym
 Detekcja metylacji
 Detekcja inaktywacji chromosomu X


Genotypowanie, analiza krzywej topnienia kwasów nukleinowych



Wykrywanie trisomii, poszczególnych kopii jednogenowych

 Wykrywanie mikrodelecji

Mikromacierze (ang. DNA microarray)- rodzaje



Ze względu na rodzaj wykrywanych sekwencji -



mikromacierze do badania ekspresji genów



najczęściej stosowane - sondy w obrębie sekwencji mRNA

 mikromacierze eksonowe (sondy to sekwencje

eksonów)

 mikromacierze pokrywajace genom (ang. tiling array)-

do badania ekspresji obszarów pozagenowych

4

 mikromacierze do badania splicingu (ang. splicing array)-

badanie ekspresji różnych form

splicingowych tego samego genu



mikromacierze do badania sekwencji genów (genotypowania)

 mikromacierze SNP -

odróżnianie jednonukleotydowych polimorfizmów DNA

Mikromacierze typu SNP



Zastosowanie mikromacierzy DNA typu SNP umożliwia analizę w pojedynczym eksperymencie nawet kilkuset
mutacji i polimorfizmów odpowiedzialnych za rozwój chorób genetycznych.



Mikromacierze DNA wykorzystywane są do poznawania mechanizmów chorobotwórczych oraz oceny ryzyka
rozwoju chorób mających podłoże genetyczne.

Mikromacierze ekspresyjne



Przykłady zastosowań



Znajdowanie genów reagujących zmianą ekspresji na zmiany:



w środowisku (np. podanie leku)



w genotypie (np. obecność transgenu)



Znajdowanie genów, których ekspresja różni się



między tkankami

 podczas rozwoju
 w tkance chorej i zdrowej


między gatunkami.