1 

 

Przedmiot:

 

Podstawy genetyki klinicznej

 

II Rok, Wydział Lekarski I 
Katedra i Zakład Genetyki Medycznej UM w Poznaniu 
 
 

Diagnostyka molekularna w medycynie 

 

Osoba prowadząca: Dr n.biol. Anna Wawrocka 

 

Diagnostyka molekularna chorób genetycznych 

  Zmiany 

materiału  genetycznego  są  submikroskopowe,  dostępne  do  badania  jedynie  metodami  biologii 

molekularnej. 

   

Są to głównie choroby jednogenowe, ale również wieloczynnikowe i nowotworowe. 

   

Molekularne  badania  diagnostyczne  pozwalają  na  szybką  weryfikację  rozpoznania  klinicznego  i  stanowią 

nowoczesną metodę diagnostyki wielu chorób uwarunkowanych genetycznie.  

 
Izolacja DNA 

-  pełna krew obwodowa (limfocyty) 
-   komórki płynu owodniowego (AFC) 
-   komórki kosmówki (CVS) 
-   hodowle fibroblastów 
-   komórki epitelialne 
-   cebulki włosów 
-   plamy krwi, nasienia 
-   fragmenty tkanek 
-   szpik kostny 
 

Metody izolacji DNA: 

1. 

Izolacja DNA z zastosowaniem fenolu i chloroformu celem odbiałczenia preparatów 

2. 

Izolacja DNA przebiegająca przez wysolenie białek z lizatów komórek 

3.  Izolacja DNA poprzez 

związanie z nośnikiem, odmycie zanieczyszczeń i uwolnienie DNA 

 
Izolacja DNA z krwi obwodowej 

– metodą wysalania białek 

Etapy: 
1. 

Liza komórek bezjądrzastych 

2. Liza leukocytów 
3. Odbiałczanie 
4. Wytrącanie DNA alkoholem 
 
Hybrydyzacja (renaturacja) 

–  

Tworzenie  podwójnej  helisy  między  komplementarnymi  niciami  DNA  lub  RNA  pochodzącymi  z  różnych  źródeł. 
Oddziaływanie  badanego  fragmentu  DNA  i  sondy  molekularnej  prowadzi  do  utworzenia  hybrydu  (dupleksu)  o 
dwuniciowej strukturze. 
Metody hybrydyzacji molekularnej: 
-Southern Blotting, 
-DNA fingerprinting, 
-Northern blotting, 
-In situ hybridization (FISH). 
 
Sondą molekularną mogą być: 
-syntetyczne oligomery 
-

syntetyczne bądź naturalne geny lub ich fragmenty 

-cDNA 
-

fragmenty chromosomów 

-

całe genomy bakteryjne 

     
Sonda molekularna musi być zdenaturowana (jednoniciowa). Łączenie sondy molekularnej z docelowym fragmentem 
kwasu nukleinowego zachodzi zgodnie z komplementarnością zasad. 
Sonda jest wyznakowana radioaktywnie lub nieradioaktywnie np. fluorescencyjnie.

 

 

 
 
 

2 

 

Hybrydyzacja typu Southern (ang. Southern blot hybridization) 

–  

Stosowana najczęściej, dotyczy hybrydyzacji DNA-DNA. Ma na celu wyszukanie sekwencji DNA spośród mieszaniny 
fragmentów otrzymanych po trawieniu enzymami restrykcyjnymi. 
Stosując hybrydyzację typu Southern można wykryć: 
- 

rearanżacje genowe np. delecje albo insercje, większe od 50-100 pz (Dystrofia mięśniowa Duchenne’a) 

-

mutacje punktowe, które tworzą nowe lub zmieniają dotychczasowe miejsce restrykcyjne dla enzymu, stosowanego 

do trawienia DNA 
 
Hybrydyzacja typu Northern Blot (ang. Northern blot hybridization) 

– dotyczy hybrydyzacji RNA pacjenta z sondą 

molekularną.  Stosowana w celu badania ekspresji genów. 

 

 
DNA Fingerprinting 
W  metodzie  tej  wykorzystuje  się  obecność  w  genomie  polimorficznych  sekwencji  powtórzonych  VNTR  (variable 
number  of  tandem  repeats) 

–  zmienna  liczba  tandemowych  powtórzeń.  W  wyniku  hybrydyzacji  VNTR  z  sondami 

molekularnymi  rozpoznającymi  jednocześnie  kilkanaście  loci  otrzymuje  się  dla  każdego  osobnika  charakterystyczny 
obraz fragmentów DNA tzw. fingerprint, odcisk genetyczny 
Zastosowanie: 
-ustalanie ojcostwa 
-badania medyczno-

sądowe 

 
PCR- 

(ang.polymerase chain reaction) reakcja łańcuchowa polimerazy 

 

Metoda PCR przyspieszyła uzyskiwanie wyników w pracach nad poznaniem struktury i funkcji genów. 

 

Kary Mullis zastosował termostabilną polimerazę w reakcji łańcuchowej polimerazy, w 1987r.  

  Nagroda Nobla z chemii w 1993r. 
  Reakcja  ta 

odzwierciedla  naturalny  proces  replikacji  i  umożliwia  w  warunkach  in  vitro  szybkie  powielenie 

wybranych odcinków DNA lub RNA (przepisanego na cDNA przy użyciu reakcji odwrotnej transkrypcji). 

 

Badana sekwencja DNA jest powielana przy użyciu pary oligonukleotydowych starterów, z których każdy jest 
komplementarny  do  jednego  k

ońca  sekwencji  docelowej  DNA.  Startery  te  są  wydłużane  w  kierunku 

przeciwnym, za pomocą termostabilnej polimerazy DNA  

 

W cyklu który obejmuje trzy podstawowe etapy:  

       - denaturacja dwuniciowej matrycy 

– 90-95°C,  

       - 

wiązanie starterów do jednoniciowej matrycy 50-65°C,  

- synteza nici komplementarnej 68-

72°C 

 

Wizualizacja produktów PCR następuje poprzez rozdział elektroforetyczny. Cząsteczki DNA umieszczone w 
żelu migrują w  polu elektrycznym od ujemnie do dodatnio naładowanej elektrody, a  ich szybkość zależy  od 
wielkości cząsteczki – im mniejsze tym szybciej będą się przesuwały w żelu. Wybarwione bromkiem etydyny 
(mutagen interkalujący DNA) są widoczne po naświetleniu światłem UV. 

 

PCR-RFLP (ang. restriction fragments length polymorphism)  
Analiza 

polimorfizmu  długości  fragmentów  restrykcyjnych.  Polega  ona  na  amplifikacji  fragmentu  DNA,  w  obrębie 

którego  występuje  marker  RFLP  (fragment  DNA  zawierający  miejsce  restrykcyjne),  a  następnie  jego  trawieniu 
odpowiednim enzymem restrykcyjnym. 
Zastosowanie: 
- 

identyfikacja mutacji punktowych w obrębie miejsca rozpoznawanego przez enzym restrykcyjny 

Przykład: fenyloketonuria, anemia sierpowata, hemofilia 
 
Multipleks PCR 

 

jednorazowo można amplifikować  
ok.10 markerów 

 

można badać DNA zmieszany  
i zdegradowany 

 
Zastosowanie: 

duże mutacje genowe: delecje, duplikacje, insercje 

 
Hybrydyzacja ASO (ang. allele specific oligonucleotide) 

 

polega na hybrydyzacji z sondą specyficzną  
dla  produktu PCR  

 

sonda rozpoznaje allel dziki (prawidłowy) lub zmutowany 

 
Zastosowanie: 
wykrywanie mutacji punktowych, 

które nie zmieniają miejsc restrykcyjnych 

Przykład: głuchota wrodzona, mukowiscydoza  
 
 

3 

 

MSP-PCR - PCR specyficzny dla metylacji (ang.methylation specific PCR) 

  Do wykrywania metylacji CpG w genomowym DNA 
  Dwusiarczyn 

sodu przekształca niemetylowaną cytozynę na uracyl 

 

W celu uwidocznienia efektu metylacji, DNA modyfikuje się kwaśnym siarczynem sodowym Porównanie 
próbki DNA poddanej działaniu dwusiarczynu i próbki normalnej ujawnia metylację cytozyny 

 

PCR prowadzi się z dwoma zestawami starterów, specyficznymi dla kopii metylowanej i niemetylowanej. 

 

Przykłady: Zespół Pradera - Williego (PWS), Zespół Angelmana (AS) 
U  podstaw  patogentycznych  PWS  znajduje  się  regulacja  ekspresji  genów  nazywana

 

 

rodzicielskim  piętnem 

genomowy

m. PWS spowodowany jest brakiem aktywności genów w regionie chromosomu 15 pochodzącym od ojca, 

które ulegają piętnowaniu (są nieaktywne) na chromosomie 15 pochodzącym od matki. Zmiany w DNA w tym samym 
cytogenetycznie regionie, ale pochodzące od matki odpowiedzialne są za zespół Angelmana.  
 
Wynik badania molekularnego dla pacjentów z zespołem PWS i AS: 
Kontrola- 

obecność kopii matczynej i ojcowskiej 

PWS - 

obecny tylko fragment pochodzący z kopii matczynej 

AS - 

obecny tylko fragment pochodzący z kopii ojcowskiej 

 
Sekwencjonowanie DNA, główne metody 

  Metoda enzymatyczna 

– polimeraza DNA syntetyzuje komplementarną kopię matrycy DNA 

  Metoda chemiczna 

– znakowany fragment DNA ulega reakcji ze związkami specyficznymi dla 

poszczególnych zasad 

 

Sekwencjonowanie 

DNA, metodą enzymatyczną 

 

Metoda enzymatyczna została opracowana przez Sangera i wsp. W 1977r. 

 

Opiera się na zdolności polimerazy DNA do wbudowywania 2’3’-dideoksynukleozydotrifosforanów (ddNTP). 
Wbudowanie ddNTP 

(terminatora) powoduje zatrzymanie elongacji w miejscu A, C, G lub T. W każdej reakcji 

stosowany jest tylko jeden nukleotyd terminujący. 

 
QF-PCR (ang. Quantitive fluorescence polymerase chain reaction) 

  QF-

PCR znalazła zastosowanie w diagnostyce prenatalnej (wybranych aberracji chromosomowych). Jest to 

ocena ilości kopii chromosomów 13, 18, 21, X i Y. 

 

Opiera się na wykorzystaniu jako markerów sekwencji STR (ang. short tandem repeats) 

 

Rutynowo źródłem DNA są amniocyty występujące w płynie owodniowym, pobieranym na drodze 
amniopunkcji od około 13 tygodnia ciąży 

 

Startery do amplifikacji poszczególnych STR są znakowane fluorescencyjnie, odczyt odbywa się za pomocą 
sekwenatora kapilarnego 

 
PCR w czasie rzeczywistym 

– (ang. Real Time PCR)  

 

Metoda ilościowa oparta na amplifikacji DNA in vitro- opiera się na pomiarze liczby kopii DNA, przez pomiar 
fluorescencji 

 
Zastosowania aplikacji real-time PCR:  

 

Ilościowe określanie ekspresji genów  

 

Testowanie stabilności genetycznej  

 

Wydajność terapii lekowych/monitorowanie leków  

 

Ilościowe określanie DNA wirusowego  

 

Detekcja patogenów  

 

Uszkodzenia DNA (niestabilność mikrosatelitarna)  

 

Określanie czasu ekspozycji na promieniowanie  

 

Obrazowanie in vivo procesów komórkowych  

  Studia nad DNA mitochondrialnym  
  Detekcja metylacji  
  Detekcja inaktywacji chromosomu X  
 

Genotypowanie, analiza krzywej topnienia kwasów nukleinowych  

 

Wykrywanie trisomii, poszczególnych kopii jednogenowych  

  Wykrywanie mikrodelecji  

 
Mikromacierze (ang. DNA microarray)- rodzaje 

 

Ze względu na rodzaj wykrywanych sekwencji - 

 

mikromacierze do badania ekspresji genów  

 

najczęściej stosowane - sondy w obrębie sekwencji mRNA  

  mikromacierze eksonowe (sondy to sekwencje 

eksonów)  

  mikromacierze pokrywajace genom (ang. tiling array)-

do badania ekspresji obszarów pozagenowych  

4 

 

  mikromacierze do badania splicingu (ang. splicing array)- 

badanie ekspresji różnych form 

splicingowych tego samego genu 

 

mikromacierze do badania sekwencji genów (genotypowania)  

  mikromacierze SNP - 

odróżnianie jednonukleotydowych polimorfizmów DNA 

 
Mikromacierze typu SNP 

 

Zastosowanie mikromacierzy DNA typu SNP umożliwia analizę w pojedynczym eksperymencie nawet kilkuset 
mutacji i polimorfizmów odpowiedzialnych za rozwój chorób genetycznych.  

 

Mikromacierze DNA wykorzystywane są do poznawania mechanizmów chorobotwórczych oraz oceny ryzyka 
rozwoju chorób mających podłoże genetyczne.  

 
Mikromacierze ekspresyjne 
 

 

Przykłady zastosowań  

 

Znajdowanie genów reagujących zmianą ekspresji na zmiany:  

 

w środowisku (np. podanie leku)  

 

w genotypie (np. obecność transgenu) 

 

Znajdowanie genów, których ekspresja różni się  

 

między tkankami  

  podczas rozwoju  
  w tkance chorej i zdrowej  
 

między gatunkami.