Biohydrometalurgia - laboratorium
A. Pawłowska 2011
- 1 -
Ćwiczenie nr 2, 3, 4.
Kinetyka wzrostu bakterii Acidithiobacillus ferrooxidans.
Wstęp teoretyczny
Na początku lat pięćdziesiątych dwudziestego wieku z kwaśnych wód kopalnianych wyodrębniono bakterie
Thiobacillus ferrooxidans, obecnie nazywane Acidithiobacillus ferrooxidans. Są to gram-ujemne pałeczkowate
komórki o wymiarach 0,5x1,0 µm, które czerpią energię z procesu utleniania żelaza (II) do żelaza (III), ale także
z utleniania siarki, siarkowodoru, siarczków i tiosiarczanów. Bakterie te pozyskują węgiel z CO
2
, azot zaś ze
związków amonowych. Bakterie Acidithiobacillus ferrooxidans są mikroorganizmami mezofilnymi, rozwijają
się w temperaturze około 30ºC, optymalne pH roztworu hodowlanego wynosi 2,0-2,5.
Utlenianie jonów żelaza (II) może być reakcją enzymatyczną. Enzymatyczny mechanizm utleniania żelaza (II)
przez Acidithiobacillus ferrooxidans wymusza bezpośredni kontakt jonów Fe
2+
z komórką mikroorganizmu. Dla
wyjaśnienia tego zjawiska przyjęto hipotezę chemio osmotyczną. Zakłada ona, że elektrony zostają przekazane
od jonów Fe
2+
do Fe (II) oxydoreduktazy cytochromowej następnie do cytochromu c. Kolejnym nośnikiem
elektronów jest cząsteczka białka ruscytycyjanina, która może przenosić elektrony z oksydoreduktazy
cytochromowej i cytochromu c do oksydazy cytochromowej. Mechanizm ten umożliwia transport elektronów
przez błonę cytoplazmatyczną ściany komórkowej. Ze zredukowanego cytochromu c elektrony są przekazywane
do oksydazy cytochromowej aa3, która reaguje z O
2
i jonami H
+
, co prowadzi do utworzenia cząsteczki wody.
Schematycznie drogę elektronów w procesie enzymatycznego utleniania żelaza (II) przedstawia rysunek poniżej.
Proces adsorpcji jonów żelaza lub manganu przebiega po zewnętrznej stronie błony komórkowej. Anionowe
polimery wytwarzane przez wiele bakterii mogą adsorbować jony żelaza (II), a w środowisku obojętnym także
powstałe hydroksykationy Fe (III): Fe(OH)
2+
i Fe(OH)
2
+
.
Wykazano empirycznie, że proces bioutleniania jonów Fe
2+
jest reakcją pierwszego rzędu. Szybkość takiej
reakcji jest równa:
]
[
]
[
2
2
+
+
=
−
Fe
k
dt
Fe
d
Gdzie k jest stałą szybkości procesu bioutleniania.
Komórki Acidithiobacillus ferrooxidans
Biohydrometalurgia - laboratorium
A. Pawłowska 2011
- 2 -
Rozwiązaniem równania różniczkowego jest funkcja: ln[Fe
2+
]
t
/[Fe
2+
]
0
= kt, gdzie [Fe
2+
]
t
jest stężeniem jonów
Fe
2+
po upływie czasu t, [Fe
2+
]
0
jest stężeniem początkowym żelaza. Wykres zależności ln[Fe
2+
]
t
/[Fe
2+
]
0
od czasu
trwania procesu bioutleniania t jest linią prostą. Z jej nachylenia można odczytać wartość k. Wielkość ta zależy
od początkowego stężenia jonów Fe
2+
. Szybkość procesu bioutleniania wzrasta wraz ze wzrostem stężenia jonów
Fe
2+
, maleje zaś ze wzrostem stężenia jonów Fe
3+
.
Mikroorganizmy, które są w stanie wiązać jony żelaza we wnętrzu komórki, nazywamy organizmami
magnetotaktycznymi. Należą do nich: Magnetospirillum magnetotacticum, Magnetospirillum gryphiswaldense
Magnetobacterium bavaricum. W komórkach tych bakterii dochodzi do biosyntezy nanocząstek magnetytu
(Fe
3
O
4
). Kształt tych nanocząstek przypomina regularne sześciany. Są one ułożone wzdłuż komórki co sprawia,
ż
e komórki bakterii reagują na działanie ziemskiego pola magnetycznego.
W mechanizmie transportu żelaza przez błonę cytoplazmatyczną do wnętrza komórki, oprócz syderoforów biorą
udział białka pery plazmatyczne i receptorowe, zlokalizowane po obu stronach błony cytoplazmatycznej. Proces
transportu zaczyna się od utworzenia kompleksu żelaza z syderoforem wydzielonym prze komórkę, Następnie
kompleks żelazo-syderofor łączy się z białkiem receptorowym. Żelazo oddziela się od syderoforu i przechodzi
przez błonę cytoplazmatyczną. Wewnątrz komórki następuje redukcja żelaza (III) do żelaza (II).
Nieenzymatyczne utlenianie jonów żelaza
Wiele mikroorganizmów może utleniać żelazo (II) w sposób nieenzymatyczny w wyniku zmiany potencjału
redoks lub pH środowiska. Wszystkie mikroorganizmy, których działanie powoduje wzrost pH środowiska przez
zużywanie soli kwasów organicznych lub tworzenie soli amonowych z białek, sprzyja procesowi utleniania
ż
elaza (II). Przykładem są następujące reakcje:
R - CH(NH
2
)COOH + H
2
O + 1/2O
2
= R – C(O) – COOH + NH
4
+
+ OH
-
aminokwas
ketokwas
C
3
H
5
O
3
-
+ 3O
2
= 3CO
2
+ 2H
2
O + OH
-
mleczan
Działanie mikroorganizmów światłolubnych, takich jak cyjanobakterie (sinice) i algi może sprzyjać procesowi
utleniania żelaza (II) przez dostarczenie dodatkowej ilości tlenu powstającego w procesie fotosyntezy lub przez
zwiększenie pH środowiska. Obserwowany wzrost wartości pH można wyjaśnić następującymi reakcjami:
2HCO
3
-
= CO
3
2-
+ CO2 + H
2
O
CO
3
2-
+ H
2
O = HCO
3
-
+ OH
-
Celem ćwiczenia jest zbadanie kinetyki wzrostu oraz ocena aktywności utleniającej bakterii Acidithiobacillus
ferrooxidans.
Odczynniki i roztwory
1.
Składniki pożywek (Tabela 1, 2, 3);
2.
Inokulum Acidithiobacillus ferrooxidans;
3.
5 M H
2
SO
4
;
TYDZIEŃ I
Wykonanie
Doświadczenie należy rozpocząć od wykonania 0,5 L podłoża 9 K, według Tabeli 1.
Doprowadzić pH roztworu II do wartości 1,9 stosując 5M H
2
SO
4
. Użyć pH-metru. Zmieszać rozwory, ponownie
sprawdzić pH i w razie potrzeby doprowadzić do pH 1,9. Całość dokładnie wymieszać bagietką. Następnie
pobrać 100 mL pożywki i przenieść do trzech kolb o pojemności 250 mL. Dodać inokulum w ilości 10% v/v.
Całość dobrze wymieszać. Ze wszystkich kolb pobrać próby do analiz na zawartość jonów żelaza (1 mL) oraz
oznaczenia ilości białka (1 mL). Należy również zmierzyć pH i Eh roztworów. Następnie przygotować korki
z waty i zamknąć nimi kolby. Tak przygotowane hodowle umieścić w inkubatorze z wytrząsaniem (120 rpm,
35ºC) na okres 4 dni.
Biohydrometalurgia - laboratorium
A. Pawłowska 2011
- 3 -
Tabela 1. Skład podłoża hodowlanego 9K Silvermana-Lundgrena
Analizy
Każdego dnia hodowli należy wykonać:
- analizę jonów żelaza (II) i (III);
- oznaczenie białka;
- pomiar pH i Eh.
Instrukcje do wykonania analiz na stronie 5.
TYDZIEŃ II
Wykonanie
Sporządzić pożywkę płynną 2K. Jej skład przedstawiono w Tabeli 2:
Tabela 2. Skład podłoża hodowlanego 2K Silvermana-Lundgrena
Doprowadzić pH roztworu II do wartości 1,9 z użyciem 5M H
2
SO
4
. Użyć pH-metru. Zmieszać rozwory,
ponownie sprawdzić pH i doprowadzić do pH 1,9. Całość dokładnie wymieszać bagietką. Następnie pobrać
100 mL pożywki i przenieść do trzech kolb o pojemności 250 mL. Dodać inokulum w ilości 10% v/v. Całość
dobrze wymieszać. Ze wszystkich kolb pobrać próby do oznaczenia ilości białka (1 mL). Należy również
zmierzyć pH i Eh roztworów. Następnie przygotować korki z waty i zamknąć nimi kolby. Tak przygotowane
hodowle umieścić inkubatorze z wytrząsaniem (120 rpm, 35ºC) na okres 4 dni.
Analizy
Każdego dnia hodowli, podobnie jak w poprzednim tygodniu, należy wykonać:
- analizę jonów żelaza (II) i (III);
- oznaczenie zawartości białka;
- pomiar pH i Eh.
Instrukcje do wykonania analiz na stronie 5.
SKŁAD CHEMICZNY
ROZTWÓR I
ROZTWÓR II
H
2
O
700 ml
300ml
(NH
4
)
2
SO
4
3,0 g
-
KCl
0,1 g
-
K
2
HPO
4
0,5 g
-
MgSO
4
⋅
7H
2
O
0,5 g
-
Ca(NO
3
)
2
0,01 g
-
FeSO
4
⋅
7H
2
O
-
44,8 g
SKŁAD CHEMICZNY
ROZTWÓR I
ROZTWÓR II
H
2
O
700 mL
300 mL
KH
2
PO
4
0,5 g
-
MgSO
4
.
7H
2
O
0,5 g
-
FeSO
4
.
7 H
2
O
-
9,95 g
Biohydrometalurgia - laboratorium
A. Pawłowska 2011
- 4 -
TYDZIEŃ III
Wykonanie
W tym doświadczeniu, hodowlę bakterii Acidithiobacillus ferrooxidans należy prowadzić na pożywce 0K. Jej
skład przedstawiono w Tabeli 3:
Tabela 3. Skład podłoża hodowlanego 0K Silvermana-Lundgrena
Doświadczenie należy rozpocząć od wykonania 0,5 L podłoża 0 K, według tabeli powyżej. Doprowadzić pH
roztworu do wartości 1,9 z użyciem 5M H
2
SO
4
. Pożywkę wymieszać, pobrać po 100 mL i przenieść do trzech
kolb o pojemności 250 mL. Dodać inokulum w ilości 10% v/v. Całość dobrze wymieszać. Ze wszystkich kolb
pobrać próby do oznaczenia ilości białka (1 mL). Należy również zmierzyć pH i Eh roztworów. Następnie
przygotować korki z waty i zamknąć nimi kolby. Tak przygotowane hodowle umieścić inkubatorze z
wytrząsaniem (120 rpm, 35ºC) na okres 4 dni.
Analizy
Każdego dnia hodowli należy wykonać:
- analizę jonów żelaza (II) i (III);
- analizę na białko;
- pomiar pH i Eh.
Instrukcje do wykonania analiz na stronie 5.
SKŁAD CHEMICZNY
ROZTWÓR I
H
2
O
1000 ml
K
2
HPO
4
0,1 g
MgSO
4
⋅
7H
2
O
0,1 g
Biohydrometalurgia - laboratorium
A. Pawłowska 2011
- 5 -
Oznaczanie zawartości białka w próbkach.
Odczynniki i roztwory
1)
Roztwór roboczy Folina i Ciocalteua;
2)
Odczynnik Lowry’ego.
Do 1 mL próbki dodać 1 ml odczynnika Lowry’ego, wymieszać (vortex) i inkubować przez 20 minut
w temperaturze pokojowej. Po upływie 20 minut dodać 0,5 ml fenolowego odczynnika Folina-Ciocalteua.
Dobrze wymieszać. Próby pozostawić w temperaturze pokojowej przez okres 30 minut. Po tym czasie należy
przenieść roztwory do kuwet i odczytać absorbancję przy 750 nm względem próby kontrolnej, jako odnośnika.
Należy pamiętać o jednoczesnym przygotowaniu próby kontrolnej, w której zamiast roztworu białka stosuje
się wodę dejonizowaną (1 mL) oraz te same odczynniki i procedurę, co w pozostałych próbach.
Na podstawie krzywej wzorcowej, przygotowanej na poprzednich zajęciach, odczytać zawartość białka
w poszczególnych próbkach.
Oznaczanie jonów Fe
2+
i Fe
3+
metodą miareczkową
Odczynniki i roztwory
1)
Mianowany roztwór EDTA o stężeniu 0,025M;
2)
Kwas sulfosalicylowy - wskaźnik do miareczkowania;
Wykonanie analizy
Do kolbki Erlenmeyera o pojemności 100 mL, pobrać 1 mL wodnego roztworu zawierającego jony Fe
2+
i Fe
3+
. Następnie dodać 30 ml wskaźnika i ogrzać do temperatury 80
°
C (widoczne pęcherzyki gazu).
W obecności jonów Fe
3+
barwa roztworu staje się bordowa. Próbkę miareczkować na gorąco roztworem EDTA
do zmiany barwy z bordowej na słomkową. Stężenie jonów Fe
3+
obliczyć z równania:
Następnie do zmiareczkowanego roztworu dodać szczyptę nadsiarczanu amonu jako utleniacza. Ilość
nadsiarczanu amonu powinna być tak dobrana, aby po zakończonym miareczkowaniu i wprowadzeniu śladowej
ilości utleniacza, barwa roztworu nie uległa zmianie. Jeżeli w roztworze obecne są jony Fe
2+
roztwór ponownie
zmieni barwę na bordową (następuje utlenianie jonów Fe
2+
do Fe
3+
). W takim wypadku roztwór należy
ponownie miareczkować 0,025M EDTA, a stężenie jonów Fe
2+
obliczyć ze wzoru:
396
,
1
]
[
]
/
[
2
⋅
=
+
ml
V
l
g
C
EDTA
Fe
396
,
1
]
[
]
/
[
3
⋅
=
+
ml
V
l
g
C
EDTA
Fe