UNIWERSYTET PRZYRODNICZY

Wydział Medycyny Weterynaryjnej

KATEDRA BIOCHEMII I FIZJOLOGII ZWIERZĄT

Zakład Biochemii

20-033 Lublin, ul. Akademicka 12

tel. [phone]

09-02-17 www.biochfiz.up.lublin.pl Wersja 2.17.02.09

- 1 z 3 -

Skład aminokwasowy białek

Zadania 1-5 wykona

ć

, stosuj

ą

c roztwór białka jaja kurzego,

ż

elatyny i peptonu (produkt cz

ęś

ciowego trawienia białka przez pepsyn

ę

,

zawieraj

ą

cy polipeptydy o masie 600-3000 Da).

Zapisa

ć

wszystkie wyniki w tabeli poni

ż

ej, oznaczaj

ą

c wynik

dodatni (+) i ujemny (-).

Białko

Próba

jaja kurzego

ż

elatyna

pepton

Biuretowa

Ksantoproteinowa

Millona

Adamkiewicza – Hopkinsa

Cysteinowa

Zadanie 1. Próba biuretowa

Celem zadania jest wykazanie obecno

ś

ci białka w roztworze na

podstawie reakcji barwnej powstaj

ą

cej na skutek poł

ą

czenia jonów miedzi

z wi

ą

zaniem peptydowym.

Wykonanie. Do 1 cm

3

1% roztworu białka doda

ć

4 cm

3

odczynnika

miedziowego.

O obecno

ś

ci białka

ś

wiadczy pojawiaj

ą

ce si

ę

fioletowe lub ró

ż

owe

zabarwienie.


Zadanie 2. Próba ksantoproteinowa

Celem zadania jest wykazanie obecno

ś

ci aminokwasów aromatycznych w

badanym roztworze na podstawie reakcji barwnej, której produktami s

ą

nitrowe pochodne pier

ś

cieni benzenowych zawartych w aminokwasach

aromatycznych.

Wykonanie. Do 1 cm

3

1% roztworu białka doda

ć

ok. 1 cm

3

st

ęż

. HNO

3

i

ogrzewa

ć

mieszanin

ę

przez 30 sekund. Osad str

ą

caj

ą

cego si

ę

białka barwi

si

ę

na

ż

ółto.

UNIWERSYTET PRZYRODNICZY

Wydział Medycyny Weterynaryjnej

KATEDRA BIOCHEMII I FIZJOLOGII ZWIERZĄT

Zakład Biochemii

20-033 Lublin, ul. Akademicka 12

tel. [phone]

09-02-17 www.biochfiz.up.lublin.pl Wersja 2.17.02.09

- 2 z 3 -

Zadanie 3. Próba Millona

Celem

zadania

jest

wykazanie

obecno

ś

ci

tyrozyny

w

badanym

roztworze na podstawie reakcji barwnej, której produktami s

ą

rt

ę

ciowe

pochodne nitrowanej tyrozyny.

Wykonanie. Do 1 cm

3

1% roztworu białka doda

ć

kilka kropel

odczynnika

Millona

i

otrzyman

ą

mieszanin

ę

ostro

ż

nie

ogrza

ć

nad

palnikiem. Białka z kwasem azotowym tworz

ą

nierozpuszczalny osad, który

w czasie ogrzewania czerwienieje. Je

ś

li nie powstaje czerwona barwa,

doda

ć

jeszcze kilka kropel odczynnika i ponownie podgrza

ć

.

Uwaga! Przy nadmiarze odczynnika barwa znika podczas ogrzewania.

Zadanie 4. Próba Adamkiewicza – Hopkinsa

Celem zadania jest wykazanie obecno

ś

ci tryptofanu w badanym

roztworze

na

podstawie

barwy

produktów

kondensacji

pier

ś

cienia

indolowego tryptofanu z kwasem glioksalowym.

Wykonanie. Do 1 cm

3

1% roztworu białka doda

ć

1 cm

3

st

ęż

onego

CH

3

COOH. Roztwór zmiesza

ć

i delikatnie podwarstwi

ć

1 cm

3

st

ęż

onego

H

2

SO

4

, wlewanego po

ś

ciance probówki. Na pograniczu obu warstw powstaje

fiołkowy kr

ąż

ek.

Zadanie 5. Próba cysteinowa

Celem

zadania

jest

wykazanie

obecno

ś

ci

cysteiny

w

badanym

roztworze na podstawie powstaj

ą

cego siarkowodoru i siarczku ołowiu.

Wykonanie. Do 1 cm

3

1% roztworu białka doda

ć

1 cm

3

20% NaOH i par

ę

kropli 2 mol/dm

3

octanu ołowiu (II), podgrza

ć

. Płyn ciemnieje.

Mieszanin

ę

ozi

ę

bi

ć

i doda

ć

do niej ostro

ż

nie kroplami st

ęż

ony HCl.

Wydziela si

ę

siarkowodór.

Z metioniny w warunkach reakcji nie powstaje siarkowodór i wynik

próby jest ujemny.

UNIWERSYTET PRZYRODNICZY

Wydział Medycyny Weterynaryjnej

KATEDRA BIOCHEMII I FIZJOLOGII ZWIERZĄT

Zakład Biochemii

20-033 Lublin, ul. Akademicka 12

tel. [phone]

09-02-17 www.biochfiz.up.lublin.pl Wersja 2.17.02.09

- 3 z 3 -

Zadanie 6. Ilo

ś

ciowe oznaczanie białka metod

ą

biuretow

ą

Przygotowanie krzywej wzorcowej. Przygotowa

ć

ró

ż

ne rozcie

ń

czenia

wzorcowego roztworu białka zgodnie z danymi w tabeli.

Nr

probówki

Kazeina

(1 mg/cm

3

)

Woda

Destylowana

St

ęż

enie

Absorbancja

1

1,0 cm

3

-

1%

2

0,8 cm

3

0,2 cm

3

0,8%

3

0,6 cm

3

0,4 cm

3

0,6%

4

0,4 cm

3

0,6 cm

3

0,4%

5

0,2 cm

3

0,8 cm

3

0,2%

Do ka

ż

dej probówki doda

ć

po 4 cm

3

odczynnika miedziowego i

pozostawi

ć

w temperaturze pokojowej na 20-25 min. Potem mierzy

ć

absorbancj

ę

wobec próby odczynnikowej (1 cm

3

wody destylowanej i 4 cm

3

odczynnika miedziowego) przy długo

ś

ci fali 545 min.

Wykre

ś

li

ć

krzyw

ą

zale

ż

no

ś

ci

st

ęż

enia

kazeiny

od

warto

ś

ci

absorbancji.

Uwaga! Prosz

ę

przynie

ść

krzyw

ą

kalibracyjn

ą

na nast

ę

pne zaj

ę

cia!!!