UNIWERSYTET PRZYRODNICZY
Wydział Medycyny Weterynaryjnej
KATEDRA BIOCHEMII I FIZJOLOGII ZWIERZĄT
Zakład Biochemii
20-033 Lublin, ul. Akademicka 12
tel. 081 445 69 73
09-02-17 www.biochfiz.up.lublin.pl Wersja 2.17.02.09
- 1 z 3 -
Skład aminokwasowy białek
Zadania 1-5 wykona
ć
, stosuj
ą
c roztwór białka jaja kurzego,
Ŝ
elatyny i peptonu (produkt cz
ęś
ciowego trawienia białka przez pepsyn
ę
,
zawieraj
ą
cy polipeptydy o masie 600-3000 Da).
Zapisa
ć
wszystkie wyniki w tabeli poni
Ŝ
ej, oznaczaj
ą
c wynik
dodatni (+) i ujemny (-).
Białko
Próba
jaja kurzego
Ŝ
elatyna
pepton
Biuretowa
Ksantoproteinowa
Millona
Adamkiewicza – Hopkinsa
Cysteinowa
Zadanie 1. Próba biuretowa
Celem zadania jest wykazanie obecno
ś
ci białka w roztworze na
podstawie reakcji barwnej powstaj
ą
cej na skutek poł
ą
czenia jonów miedzi
z wi
ą
zaniem peptydowym.
Wykonanie. Do 1 cm
3
1% roztworu białka doda
ć
4 cm
3
odczynnika
miedziowego.
O obecno
ś
ci białka
ś
wiadczy pojawiaj
ą
ce si
ę
fioletowe lub ró
Ŝ
owe
zabarwienie.
Zadanie 2. Próba ksantoproteinowa
Celem zadania jest wykazanie obecno
ś
ci aminokwasów aromatycznych w
badanym roztworze na podstawie reakcji barwnej, której produktami s
ą
nitrowe pochodne pier
ś
cieni benzenowych zawartych w aminokwasach
aromatycznych.
Wykonanie. Do 1 cm
3
1% roztworu białka doda
ć
ok. 1 cm
3
st
ęŜ
. HNO
3
i
ogrzewa
ć
mieszanin
ę
przez 30 sekund. Osad str
ą
caj
ą
cego si
ę
białka barwi
si
ę
na
Ŝ
ółto.
UNIWERSYTET PRZYRODNICZY
Wydział Medycyny Weterynaryjnej
KATEDRA BIOCHEMII I FIZJOLOGII ZWIERZĄT
Zakład Biochemii
20-033 Lublin, ul. Akademicka 12
tel. 081 445 69 73
09-02-17 www.biochfiz.up.lublin.pl Wersja 2.17.02.09
- 2 z 3 -
Zadanie 3. Próba Millona
Celem
zadania
jest
wykazanie
obecno
ś
ci
tyrozyny
w
badanym
roztworze na podstawie reakcji barwnej, której produktami s
ą
rt
ę
ciowe
pochodne nitrowanej tyrozyny.
Wykonanie. Do 1 cm
3
1% roztworu białka doda
ć
kilka kropel
odczynnika
Millona
i
otrzyman
ą
mieszanin
ę
ostro
Ŝ
nie
ogrza
ć
nad
palnikiem. Białka z kwasem azotowym tworz
ą
nierozpuszczalny osad, który
w czasie ogrzewania czerwienieje. Je
ś
li nie powstaje czerwona barwa,
doda
ć
jeszcze kilka kropel odczynnika i ponownie podgrza
ć
.
Uwaga! Przy nadmiarze odczynnika barwa znika podczas ogrzewania.
Zadanie 4. Próba Adamkiewicza – Hopkinsa
Celem zadania jest wykazanie obecno
ś
ci tryptofanu w badanym
roztworze
na
podstawie
barwy
produktów
kondensacji
pier
ś
cienia
indolowego tryptofanu z kwasem glioksalowym.
Wykonanie. Do 1 cm
3
1% roztworu białka doda
ć
1 cm
3
st
ęŜ
onego
CH
3
COOH. Roztwór zmiesza
ć
i delikatnie podwarstwi
ć
1 cm
3
st
ęŜ
onego
H
2
SO
4
, wlewanego po
ś
ciance probówki. Na pograniczu obu warstw powstaje
fiołkowy kr
ąŜ
ek.
Zadanie 5. Próba cysteinowa
Celem
zadania
jest
wykazanie
obecno
ś
ci
cysteiny
w
badanym
roztworze na podstawie powstaj
ą
cego siarkowodoru i siarczku ołowiu.
Wykonanie. Do 1 cm
3
1% roztworu białka doda
ć
1 cm
3
20% NaOH i par
ę
kropli 2 mol/dm
3
octanu ołowiu (II), podgrza
ć
. Płyn ciemnieje.
Mieszanin
ę
ozi
ę
bi
ć
i doda
ć
do niej ostro
Ŝ
nie kroplami st
ęŜ
ony HCl.
Wydziela si
ę
siarkowodór.
Z metioniny w warunkach reakcji nie powstaje siarkowodór i wynik
próby jest ujemny.
UNIWERSYTET PRZYRODNICZY
Wydział Medycyny Weterynaryjnej
KATEDRA BIOCHEMII I FIZJOLOGII ZWIERZĄT
Zakład Biochemii
20-033 Lublin, ul. Akademicka 12
tel. 081 445 69 73
09-02-17 www.biochfiz.up.lublin.pl Wersja 2.17.02.09
- 3 z 3 -
Zadanie 6. Ilo
ś
ciowe oznaczanie białka metod
ą
biuretow
ą
Przygotowanie krzywej wzorcowej. Przygotowa
ć
ró
Ŝ
ne rozcie
ń
czenia
wzorcowego roztworu białka zgodnie z danymi w tabeli.
Nr
probówki
Kazeina
(1 mg/cm
3
)
Woda
Destylowana
St
ęŜ
enie
Absorbancja
1
1,0 cm
3
-
1%
2
0,8 cm
3
0,2 cm
3
0,8%
3
0,6 cm
3
0,4 cm
3
0,6%
4
0,4 cm
3
0,6 cm
3
0,4%
5
0,2 cm
3
0,8 cm
3
0,2%
Do ka
Ŝ
dej probówki doda
ć
po 4 cm
3
odczynnika miedziowego i
pozostawi
ć
w temperaturze pokojowej na 20-25 min. Potem mierzy
ć
absorbancj
ę
wobec próby odczynnikowej (1 cm
3
wody destylowanej i 4 cm
3
odczynnika miedziowego) przy długo
ś
ci fali 545 min.
Wykre
ś
li
ć
krzyw
ą
zale
Ŝ
no
ś
ci
st
ęŜ
enia
kazeiny
od
warto
ś
ci
absorbancji.
Uwaga! Prosz
ę
przynie
ść
krzyw
ą
kalibracyjn
ą
na nast
ę
pne zaj
ę
cia!!!