M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 2

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

1

B

UDOWA I DZIAŁANIE MIKROSKOPU

Do obserwacji bardzo małych obiektów, np. komórek, tkanek zwierzęcych i

roślinnych, wykorzystywane są przyrządy optyczne - mikroskopy. Technika mikroskopowa

znalazła szerokie zastosowanie we wszystkich gałęziach nauki (geologia, metalurgia,

chemia), a szczególnie w naukach biologicznych i medycznych. Dzięki zastosowaniu

mikroskopów można określić morfologię komórek, ich strukturę wewnętrzną, a także

obserwować procesy fizjologiczne (np. sposób rozmnażania, zdolność ruchu). W

mikroskopie powstający obraz jest odwrócony, powiększony i pozorny.

W zależności od sposobu uzyskiwania powiększenia wyróżniamy mikroskopy:

- świetlne (optyczne),

- elektronowe.

W mikroskopach optycznych powiększenia uzyskuje się dzięki układowi soczewek

optycznych, w zależności od rodzaju i ustawienia oświetlenia i soczewek wyróżniamy

mikroskopy:

- z jasnym polem widzenia (zwykłe),

- z ciemnym polem widzenia,

- do obserwacji w ultrafiolecie,

- kontrastowo-fazowe,

- konfokalne,

- fluorescencyjne.

M

IKROSKOP OPTYCZNY

Mikroskop świetlny składa się z dwóch

układów:



optycznego - utworzony z dwóch

zbierających zestawów soczewek, tj.

obiektywu i okularu, oraz aparatu

oświetlającego i oświetlenia;



mechanicznego - który zawiera

podstawę,

statyw,

tubus

z

urządzeniem rewolwerowym, stolik

przedmiotowy

z

urządzeniem

krzyżowym,

mechanizm ruchu

(śrubę

makrometryczną

i

mikrometryczną) do regulowania

ostrości obrazu.

Zakres przesuwu śruby makrometrycznej dla typowych mikroskopów wynosi 56 mm – jeden

pełny obrót to 18 mm. Śruba mikrometryczna ma zakres 2 mm, skok 0,1 mm.

Pokrętła śrub są bardzo precyzyjnymi urządzeniami (wrażliwymi) – nie należy ich

przesuwać do oporu i wszelkie manipulacje wykonywać oburącz.

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 2

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

2

Oświetlenie, dawniej lusterko, obecnie zwykle sztuczne światło. Oświetlacze mają przysłonę

i matówkę (rozprasza światło, zapewnia równomierne oświetlenie oglądanego przedmiotu).

Oświetlenie należy dostosować do powiększenia – przy małych powiększeniach stosujemy

słabe natężenie oświetlenia, przy dużych – silne. Przy mikroskopowaniu z użyciem immersji

należy ustawić aparat oświetlający w górnym położeniu.

Aparat oświetlający (aparat Abbego) kieruje promienie świetlne od źródła światła poprzez

preparat do obiektywu. W skład aparatu Abbego wchodzą:

- kondensor (zespół 2-3 soczewek) silnie skupiający światło na preparacie,

- przysłona irysowa (diafragma) regulująca ilość światła wpadającego do

kondensora.

Obiektywy są zbudowane z kilku lub kilkunastu

soczewek skupiających, sklejonych balsamem

kanadyjskim, co minimalizuje wady optyczne

pojedynczych soczewek (aberracje sferyczne,

chromatyczne).

Najbliżej

preparatu

jest

soczewka czołowa.

Obiektywy:



achromatyczne,



fluorytowe,



apochromatyczne – największy stopień

korekcji wad.

Obiektywy mogą być suche (powietrzne) i

zanurzeniowe (immersyjne). Obiektywy suche

powiększają do 60 razy, immersyjne 90 do 150

razy.

Okulary są zbudowane z zespołu soczewek płasko-wypukłych i powiększają na zasadzie

lupy. Soczewka bliżej oka to soczewka oczna, ta bliżej obserwowanego przedmiotu to

soczewka polowa. Okulary powiększają 2-30 razy (podane na oprawce soczewki ocznej).

Z

ASADA DZIAŁANIA MIKROSKOPU

1) promienie światła zostają skierowane ze źródła światła na preparat przez aparat

Abbego; wiązka światła najpierw przez otwór przesłony irysowej przechodzi na

soczewki kondensora , które skupiają je,

2) przez otwór w stoliku światło pada na preparat, na którym część promieni ulega

ugięciu, a część przechodzi niezmieniona do ośrodka znajdującego się między

preparatem a soczewką czołową obiektywu,

3) następuje pierwsze powiększenie przedmiotu, dzięki czemu dostajemy obraz

powiększony, odwrócony i rzeczywisty,

4) z obiektywu obraz trafia do okularu, który działa jak lupa, w wyniku czego dostajemy

obraz prosty, powiększony i pozorny.

Powiększenie mikroskopu jest iloczynem powiększenia obiektywu i okularu, jeśli mamy

nasadkę dwuokularową to dodatkowo należy wynik przemnożyć przez powiększenie nasadki.

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 2

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

3

Schemat powstawania obrazu przedmiotu w mikroskopie

AB – przedmiot,

F1 – ognisko obiektywu

F2 – ognisko okularu

A’B’ – obraz wytworzony przez obiektyw,

A”B”– obraz widziany w okularze

Ważną wielkością charakteryzującą mikroskop i decydującą o jakości obrazu jest jego

zdolność rozdzielcza – najmniejsza odległość między dwoma punktami, które mikroskop

pozwala jeszcze rozróżnić. Przy słabej zdolności rozdzielczej dwa punkty preparatu leżące

blisko siebie widoczne są dla obserwatora jako jeden, a wraz z jej polepszeniem oddalenie

obrazu tych punktów od siebie rośnie.

Zdolność rozdzielcza mikroskopu wzrasta wraz ze wzrostem kąta, pod jakim światło wpada

do obiektywu i zależy od współczynnika załamania środowiska znajdującego się między

obiektywem a obserwowanym przedmiotem.

Zdolność rozdzielczą mikroskopu (D) opisuje wzór:

AN

D

2





gdzie: λ - długość fali światła oświetlającego preparat (dla światła widzialnego przyjmuje się

λ = 0,55



m),

AN - apertura numeryczna obiektywu.

Apertura numeryczna jest wielkością charakteryzującą obiektyw i jest zaznaczona na jego

oprawie. Jest to zdolność układu optycznego do przyjmowania światła, wyraża się wzorem:



sin





n

AN

gdzie: n - współczynnik załamania światła w środowisku między preparatem a obiektywem,

przy czym n = 1,0002 dla powietrza, n = 1,505 dla olejku cedrowego,

α - kąt aperturowy zawarty między skrajnym promieniem wchodzącym do obiektywu,

a osią optyczną jego soczewek.

Obiektywy o silnym powiększeniu mają wartość apertury numerycznej większą niż słabiej

powiększające.

Zdolność rozdzielczą mikroskopu można powiększyć stosując do oświetlenia preparatu

promieniowanie o długości fali krótszej od światła białego (ludzkie oko dostrzega w dolnym

zakresie barwy światło o długości fali ok. 340 nm) lub przez zwiększenie apertury

numerycznej. Zwiększenie apertury numerycznej obiektywu można osiągnąć przez

wypełnienie przestrzeni między preparatem a obiektywem cieczą o współczynniku

załamania światła większym od współczynnika załamania światła w powietrzu, np.

olejkiem immersyjnym (cedrowym, rycynowym). Apertura numeryczna obiektywów suchych

wynosi poniżej 1,0, a immersyjnych 1,2-1,6.

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 2

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

4

Bieg promieni świetlnych w systemie

immersyjnym i suchym, p – szkiełko

przedmiotowe,

n

–

szkiełko

nakrywkowe, a – powietrze, b-

immersja

Zdolność rozdzielcza mikroskopu optycznego zwykłego wynosi 0,2 m.

Odległość robocza – odległość między soczewką czołową obiektywu a preparatem w

momencie prawidłowego ustawienia ostrości obrazu w miarę zwiększania powiększenia

odległość robocza maleje.

Przestrzeń robocza – przestrzeń między soczewką czołową obiektywu a preparatem w

chwili najlepszego widzenia.

T

ECHNIKA KORZYSTANIA Z MIKROSKOPU ŚWIETLNEGO

1) Ustawić mikroskop 15-20 cm od krawędzi stołu.

2) Sprawdzić czystość mikroskopu, optyczne części (obiektyw, okular, lusterko) przetrzeć

miękką, suchą ściereczką.

3) Włączyć źródło światła, otworzyć przysłonę kondensorową znajdującą się pod stolikiem.

4) Przekręcając śrubą makrometryczną podnieść tubus tak, aby obiektywy znalazły się 3 – 5

cm nad stolikiem.

5) Włączyć w oś optyczną mikroskopu obiektyw o najmniejszym powiększeniu.

6) Przygotowany preparat umieścić na stoliku i docisnąć zaciskami.

7) Patrząc z boku zbliżyć maksymalnie stolik z preparatem do soczewki czołowej obiektywu.

Następnie bardzo wolno, patrząc w okular, przy użyciu śruby makrometrycznej, oddalać

stolik od obiektywu aż do ujrzenia konturu badanego obiektu. Ostrość obrazu nastawić za

pomocą śruby mikrometrycznej.

8) Kolejno włączać w oś optyczną mikroskopu obiektywy o coraz większej sile

powiększającej. Każdorazowo oddalać stolik od obiektywu, a następnie patrząc z boku

przestawić rewolwerem obiektyw i postępować jak od punktu 6.

9) W przypadku mikroskopowania przy użyciu obiektywów immersyjnych należy najpierw

znaleźć obraz obiektywem suchym, a następnie podnieść obiektyw do góry i na preparat

nanieść kroplę olejku immersyjnego. Patrząc z boku opuścić obiektyw aż do zanurzenia się

soczewki czołowej w olejku. Skorygować światło (podnieść kondensor). Znaleźć ostry

obraz manipulując śrubami makro- i mikrometryczną.

10)

Po zakończeniu mikroskopowania obiektyw przemyć alkoholem.

11)

Zostawić mikroskop z obiektywem o najmniejszym powiększeniu w osi optycznej,

wyłączyć i przykryć.

M

IKROBIOLOGIA ŻYWNOŚCI

Ćwiczenie 2

WTŻ II rok

___________________________________________________________________________

http://www.ar.krakow.pl/tz/ktfimt/

5

Dodatkowe informacje:



mikroskop optyczny działający na spolaryzowane światło UV osiąga maksymalne

powiększenie 3500x. Mikroskopy działające na zwykłe światło widzialne

maksymalnie 1600x.



mikroskop elektronowy pozwala osiągnąć powiększenie ok. 250 000 razy. Zastąpienie

wiązki elektronów wiązką jonów (mikroskop jonowy) pozwala uzyskać powiększenia

do 5 mln razy, w szczególności dla mikroskopu protonowego (jony wodoru).

Posługiwanie się mikroskopem immersyjnym

1. Umieścić kroplę olejku cedrowego na szkiełku przedmiotowym z preparatem.

2. Kondensor podnieść maksymalnie do góry.

3. Patrząc z boku mikroskopu za pomocą rewolweru wprowadzić obiektyw immersyjny

(pow. 100x) w oś optyczną mikroskopu.

4. Śrubą makrometryczną opuścić obiektyw aż do zanurzenia w olejku (patrząc z boku

mikroskopu).

5. Wyregulować światło.

6. Przy pomocy śruby makrometrycznej odszukać obraz preparatu, śrubą

mikrometryczną wyregulować ostrość.