Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 7

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

1

Ćwiczenie 7

Temat: OZNACZENIE AKTYWNOŚCI INHIBITORA TRYPSYNY

W NASIONACH ROŚLIN STRĄCZKOWYCH (SOJA, GROCH).

Część teoretyczna

Białka nasion soi to przede wszystkim albuminy, globuliny i gluteliny. Albuminy pełnią

głównie funkcje metaboliczne, zaś globuliny funkcje zapasowe.

Około 80% ogólnej ilości białek zawartych w nasionach soi można wyekstrahować przy pH

6,8, z czego większość strąca się przy zakwaszeniu do pH 4,5. Około 80% białek soi ma masę
cząsteczkową większą niż 100 kDa. Mają one dużą zdolność tworzenia międzycząsteczkowych
mostków disulfidowych oraz wiązań jonowych. Ich rozpuszczalność i lepkość ich roztworów zależy
istotnie od stężenia soli i odczynu środowiska. Sole wapnia zmniejszają rozpuszczalność białek, co
wykorzystuje się w tradycyjnym przetwórstwie w krajach Dalekiego Wschodu w celu strącania
skrzepu z mleka sojowego (produkty typu twarogu -tofu). We frakcji globulinowej największy udział
ilościowy mają dwa składniki występujące we wszystkich nasionach strączkowych - wicylina o stałej
sedymentacji 7S oraz legumina 11S zwana glicyniną. Zawierają one odpowiednio 5 i 0,8%
sacharydów.

Do białek soi zaliczamy także enzymy: lipooksygenazy (katalizujące utlenianie wolnych

kwasów linolowego i linolenowego oraz kwasów związanych w triacyloglicerolach), ureazę
(hydrolizuje mocznik do amoniaku) i -amylazę.

Inhibitory proteinaz to białka mające zdolność tworzenia z różnymi proteinazami

nieaktywnych kompleksów o bardzo małej stałej dysocjacji. Najwięcej pośród nich jest inhibitorów
proteinaz serynowych. Na podstawie podobieństwa w sekwencji aminokwasów tych białek oraz
mechanizmu wiązania enzymów można je podzielić na co najmniej 16 rodzin. Nieco mniej liczną
grupą są inhibitory proteinaz cysteinowych, aspartylowych i metaloproteinaz. Około 6%
rozpuszczalnych białek soi stanowią inhibitory proteinaz. Wykryto je w nasionach około 30
gatunków roślin strączkowych. W nasionach soi zidentyfikowano kilkanaście różnych inhibitorów,
wśród nich dwa stanowiące wyodrębnione rodziny Bowman-Birk i Kunitz.

Inhibitor Bowman-Birk o masie cząsteczkowej 7,9 kDa jest mono-, di- lub trimerem w

zależności od jego stężenia w roztworze. Zawiera 71 reszt aminokwasowych. Ma sztywną strukturę
trzeciorzędową, gdyż zawiera 7 (lub 6) wiązań disulfidowych i dzięki temu jest odporny na
denaturację cieplną i proteolizę. Ma on dwa niezależne centra aktywne: przeciwtrypsynowe Lys

16

-

Ser

17

i przeciwchymotrypsynowe Leu

43

-Ser

44

. Całkowite zredukowanie wiązań disulfidowych w

cząsteczce inhibitora niszczy aktywność białka.

Inhibitor Kunitz o masie cząsteczkowej 21 kDa jest białkiem zbudowanym z jednego łańcucha

polipeptydowego, złożonego ze 181 reszt aminokwasowych, w obrębie którego występują 2 mostki
disulfidowe. Inhibitor zawiera centrum aktywne przeciwtrypsynowe pomiędzy resztami Arg

63

i Ile

64

.

Aktywacja inhibitora następuje pod wpływem trypsyny. Enzym ten hydrolizuje wiązanie peptydowe
pomiędzy resztami Arg

63

i Ile

64

, a uwolniona w ten sposób grupa karboksylowa argininy blokuje

centrum aktywne trypsyny przez estrowe związanie się z grupą hydroksylową reszty serynowej
enzymu.

Przykłady termostabilności inhibitorów proteaz:
po 5 minutach ogrzewania groszku w temp. 80

o

C aktywność inhibitorów proteaz pozostaje bez

zmian, po 5 minutach ogrzewania w 100

o

C – aktywność spada o 50%, po 60 minutach ogrzewania

fasoli w 100

o

C nadal pozostaje 20% aktywności.

Trypsyna (EC 3.4.4.4) jest trzustkową proteazą serynową, hydrolizuje wiązanie peptydowe,

w których uczestniczy grupa karboksylowa Arg, bądź Lys, wykazuje także reaktywność (mniejszą)

Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 7

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

2

względem amidów i estrów zawierających te aminokwasy. Jest produkowana w postaci nieczynnego
trypsynogenu, który pod wpływem enterokinazy lub aktywnej trypsyny ulega aktywacji przez
odszczepienie maskującego N-końcowego heksapeptydu. Inhibitorami trypsyny są fosforany
organiczne m.in. diizopropylofluorofosforan, naturalne inhibitory trzustkowe oraz inhibitory
występujące w roślinach strączkowych. Aktywność enzymu rośnie w obecności jonów
Ca

2+

.Optymalne pH działania trypsyny mieści się w zakresie 7-9.

Część praktyczna

Metoda pozwala na oznaczenie ogólnej i resztkowej aktywności inhibitorów trypsyny

w żywności i produktach spożywczych w warunkach określonych przez metodę. Stosowana dla śrut
i mąk sojowych, koncentratów i izolatów białka sojowego oraz mieszanek kukurydziano-sojowych.

Zasada oznaczenia:

Uwolnienie p- nitroaniliny z syntetycznego substratu trypsyny (BAPNA) powoduje wzrost

absorbancji mierzonej przy 410 nm.


Odczynniki:

1. Tris bufor, pH 8,2, 0,05 M. Tuż przed użyciem doprowadzić do temp. 37

o

C.

2. Roztwór BAPNA (benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide hydrochloride). Trzymać w temperaturze

37

o

C.

3. Roztwór trypsyny.
4. 30% roztwór kwasu octowego.
5. 0,01 N roztwór NaOH.

Przygotowanie próbki:

1. Unikać wystawiania próbki na temperatury wyższe od 40

o

C, niezależnie od czasu.

2. Rozdrobnić próbkę możliwie starannie, unikając jej ogrzewania, najlepiej 100 mesh lub mniej.
3. Próbki o zawartości tłuszczu powyżej 2% powinny zostać odtłuszczone przy użyciu heksanu

bądź eteru naftowego; zarówno ekstrakcja, jak i odparowanie rozpuszczalnika zachodzą w
temperaturze pokojowej.

Postępowanie:

1. PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU

1 g mączki zalać 50 ml 0,01 N NaOH i wytrząsać przez 1 godzinę. Następnie odwirować przez

20 minut przy 4 000 obr/min. Zlać supernatant do kolbki (ewentualnie przesączyć).

Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 7

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

3

2. DOBRANIE ROZCIEŃCZENIA

Sporządzić rozcieńczenie ekstraktu tak, aby 1 ml zawiesiny po ekstrakcji hamował aktywność

trypsyny w zakresie 40- 60%. W tym celu należy sporządzić kilka rozcieńczeń otrzymanego
ekstraktu. Do probówki pobrać 1 ml rozcieńczonego ekstraktu, dodać 1 ml wody, 2 ml roztworu
trypsyny. Równocześnie sporządzić standardowy roztwór trypsyny, czyli do probówki pobrać 2 ml
roztworu trypsyny i 2 ml wody. Wszystkie probówki umieścić w łaźni wodnej w 37

o

C na 10 minut.

Następnie dodać do każdej w odstępach 30 sekundowych 5 ml roztworu BAPNA, dokładnie
wymieszać i inkubować. Dokładnie po upływie 10 minut przerwać reakcję dodając 1 ml 30% kwasu
octowego. Po ochłodzeniu odczytać absorbancję próbek przy długości fali 410 nm wobec wody.

Należy sporządzić próby ślepe do każdej próbki badanej i standardowego roztworu trypsyny.

Próby te różnią się od właściwych kolejnością dodawania odczynników. Prób ślepych nie inkubuje
się w 37

o

C.

Ślepa dla próbki badanej: do probówki wprowadzić 1 ml rozcieńczonego ekstraktu + 1 ml wody, 5 ml
roztworu BAPNA, 1 ml kwasu octowego i na końcu 2 ml roztworu trypsyny.
Ślepa dla roztworu trypsyny: 2 ml wody, 5 ml roztworu BAPNA, 1 ml kwasu octowego i na końcu 2
ml roztworu trypsyny. Zawartość probówek zamieszać i odczytać absorbancję względem wody.

Obliczenia:
Od absorbancji standardowego roztworu trypsyny należy odjąć absorbancję ślepej – A trypsyny
Od absorbancji próbki należy odjąć absorbancję ślepej – A próbki
A trypsyny • 100 = X TU
A próbki • 100 = Y TU
Procent hamowania aktywności trypsyny obliczyć z proporcji:
X TU - 100%
Y TU- x %
Hamowanie = 100- x

Jeśli hamowanie aktywności trypsyny mieści się w zakresie 40- 60% to można przejść do

oznaczenia właściwego.

3. OZNACZENIE WŁAŚCIWE

Do 3 probówek pobrać 0,8 1,0 1,2 ml odpowiednio rozcieńczonego ekstraktu i dopełnić wodą

destylowaną do 2,0 ml. Do każdej probówki dodać po 2,0 ml roztworu trypsyny, zamieszać na
vortexie i wstawić do łaźni wodnej 37

o

C na 5 minut. Do każdej próbówki dodać po 5 ml roztworu

BAPNA w odstępach 30 sekundowych (zamieszać na vortexie).

Dokładnie po 10 minutach inkubacji w 37

o

C przerwać reakcję przez dodanie 1 ml 30% kwasu

octowego. Zmierzyć absorbancję przy 410 nm względem wody.

Przygotować próby ślepe dla każdej objętości rozcieńczonego ekstraktu. Odczytać ich

absorbancję względem wody.

Wyniki wyliczyć w jednostkach aktywności inhibitorów trypsyny (TIU)

Obliczenia:
Obliczenia należy przeprowadzić na różnicach absorbancji prób właściwych i ich ślepych.
Δ A • 100 = TU
Dla każdej objętości rozcieńczonego ekstraktu należ obliczyć TIU / ml
TIU/ ml = (TU trypsyny – TU próbki ) / X
X= ml rozcieńczonej zawiesiny w próbie

Wyliczyć średnią dla wszystkich powtórzeń i przeliczyć na 1 g mączki

Uwaga:

Jedna jednostka trypsynowa (TU) jest zdefiniowana jako wzrost o 0,01 jednostki absorbancji

przy =410 nm na 10 ml mieszaniny reagującej w warunkach metody.