Biochemia Żywności
BIOTECHNOLOGIA
Ćwiczenie 7
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
1
Ćwiczenie 7
Temat: OZNACZENIE AKTYWNOŚCI INHIBITORA TRYPSYNY
W NASIONACH ROŚLIN STRĄCZKOWYCH (SOJA, GROCH).
Część teoretyczna
Białka nasion soi to przede wszystkim albuminy, globuliny i gluteliny. Albuminy pełnią
głównie funkcje metaboliczne, zaś globuliny funkcje zapasowe.
Około 80% ogólnej ilości białek zawartych w nasionach soi można wyekstrahować przy pH
6,8, z czego większość strąca się przy zakwaszeniu do pH 4,5. Około 80% białek soi ma masę
cząsteczkową większą niż 100 kDa. Mają one dużą zdolność tworzenia międzycząsteczkowych
mostków disulfidowych oraz wiązań jonowych. Ich rozpuszczalność i lepkość ich roztworów zależy
istotnie od stężenia soli i odczynu środowiska. Sole wapnia zmniejszają rozpuszczalność białek, co
wykorzystuje się w tradycyjnym przetwórstwie w krajach Dalekiego Wschodu w celu strącania
skrzepu z mleka sojowego (produkty typu twarogu -tofu). We frakcji globulinowej największy udział
ilościowy mają dwa składniki występujące we wszystkich nasionach strączkowych - wicylina o stałej
sedymentacji 7S oraz legumina 11S zwana glicyniną. Zawierają one odpowiednio 5 i 0,8%
sacharydów.
Do białek soi zaliczamy także enzymy: lipooksygenazy (katalizujące utlenianie wolnych
kwasów linolowego i linolenowego oraz kwasów związanych w triacyloglicerolach), ureazę
(hydrolizuje mocznik do amoniaku) i -amylazę.
Inhibitory proteinaz to białka mające zdolność tworzenia z różnymi proteinazami
nieaktywnych kompleksów o bardzo małej stałej dysocjacji. Najwięcej pośród nich jest inhibitorów
proteinaz serynowych. Na podstawie podobieństwa w sekwencji aminokwasów tych białek oraz
mechanizmu wiązania enzymów można je podzielić na co najmniej 16 rodzin. Nieco mniej liczną
grupą są inhibitory proteinaz cysteinowych, aspartylowych i metaloproteinaz. Około 6%
rozpuszczalnych białek soi stanowią inhibitory proteinaz. Wykryto je w nasionach około 30
gatunków roślin strączkowych. W nasionach soi zidentyfikowano kilkanaście różnych inhibitorów,
wśród nich dwa stanowiące wyodrębnione rodziny Bowman-Birk i Kunitz.
Inhibitor Bowman-Birk o masie cząsteczkowej 7,9 kDa jest mono-, di- lub trimerem w
zależności od jego stężenia w roztworze. Zawiera 71 reszt aminokwasowych. Ma sztywną strukturę
trzeciorzędową, gdyż zawiera 7 (lub 6) wiązań disulfidowych i dzięki temu jest odporny na
denaturację cieplną i proteolizę. Ma on dwa niezależne centra aktywne: przeciwtrypsynowe Lys
16
-
Ser
17
i przeciwchymotrypsynowe Leu
43
-Ser
44
. Całkowite zredukowanie wiązań disulfidowych w
cząsteczce inhibitora niszczy aktywność białka.
Inhibitor Kunitz o masie cząsteczkowej 21 kDa jest białkiem zbudowanym z jednego łańcucha
polipeptydowego, złożonego ze 181 reszt aminokwasowych, w obrębie którego występują 2 mostki
disulfidowe. Inhibitor zawiera centrum aktywne przeciwtrypsynowe pomiędzy resztami Arg
63
i Ile
64
.
Aktywacja inhibitora następuje pod wpływem trypsyny. Enzym ten hydrolizuje wiązanie peptydowe
pomiędzy resztami Arg
63
i Ile
64
, a uwolniona w ten sposób grupa karboksylowa argininy blokuje
centrum aktywne trypsyny przez estrowe związanie się z grupą hydroksylową reszty serynowej
enzymu.
Przykłady termostabilności inhibitorów proteaz:
po 5 minutach ogrzewania groszku w temp. 80
o
C aktywność inhibitorów proteaz pozostaje bez
zmian, po 5 minutach ogrzewania w 100
o
C – aktywność spada o 50%, po 60 minutach ogrzewania
fasoli w 100
o
C nadal pozostaje 20% aktywności.
Trypsyna (EC 3.4.4.4) jest trzustkową proteazą serynową, hydrolizuje wiązanie peptydowe,
w których uczestniczy grupa karboksylowa Arg, bądź Lys, wykazuje także reaktywność (mniejszą)
Biochemia Żywności
BIOTECHNOLOGIA
Ćwiczenie 7
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
2
względem amidów i estrów zawierających te aminokwasy. Jest produkowana w postaci nieczynnego
trypsynogenu, który pod wpływem enterokinazy lub aktywnej trypsyny ulega aktywacji przez
odszczepienie maskującego N-końcowego heksapeptydu. Inhibitorami trypsyny są fosforany
organiczne m.in. diizopropylofluorofosforan, naturalne inhibitory trzustkowe oraz inhibitory
występujące w roślinach strączkowych. Aktywność enzymu rośnie w obecności jonów
Ca
2+
.Optymalne pH działania trypsyny mieści się w zakresie 7-9.
Część praktyczna
Metoda pozwala na oznaczenie ogólnej i resztkowej aktywności inhibitorów trypsyny
w żywności i produktach spożywczych w warunkach określonych przez metodę. Stosowana dla śrut
i mąk sojowych, koncentratów i izolatów białka sojowego oraz mieszanek kukurydziano-sojowych.
Zasada oznaczenia:
Uwolnienie p- nitroaniliny z syntetycznego substratu trypsyny (BAPNA) powoduje wzrost
absorbancji mierzonej przy 410 nm.
Odczynniki:
1. Tris bufor, pH 8,2, 0,05 M. Tuż przed użyciem doprowadzić do temp. 37
o
C.
2. Roztwór BAPNA (benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide hydrochloride). Trzymać w temperaturze
37
o
C.
3. Roztwór trypsyny.
4. 30% roztwór kwasu octowego.
5. 0,01 N roztwór NaOH.
Przygotowanie próbki:
1. Unikać wystawiania próbki na temperatury wyższe od 40
o
C, niezależnie od czasu.
2. Rozdrobnić próbkę możliwie starannie, unikając jej ogrzewania, najlepiej 100 mesh lub mniej.
3. Próbki o zawartości tłuszczu powyżej 2% powinny zostać odtłuszczone przy użyciu heksanu
bądź eteru naftowego; zarówno ekstrakcja, jak i odparowanie rozpuszczalnika zachodzą w
temperaturze pokojowej.
Postępowanie:
1. PRZYGOTOWANIE EKSTRAKTU
1 g mączki zalać 50 ml 0,01 N NaOH i wytrząsać przez 1 godzinę. Następnie odwirować przez
20 minut przy 4 000 obr/min. Zlać supernatant do kolbki (ewentualnie przesączyć).
Biochemia Żywności
BIOTECHNOLOGIA
Ćwiczenie 7
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
3
2. DOBRANIE ROZCIEŃCZENIA
Sporządzić rozcieńczenie ekstraktu tak, aby 1 ml zawiesiny po ekstrakcji hamował aktywność
trypsyny w zakresie 40- 60%. W tym celu należy sporządzić kilka rozcieńczeń otrzymanego
ekstraktu. Do probówki pobrać 1 ml rozcieńczonego ekstraktu, dodać 1 ml wody, 2 ml roztworu
trypsyny. Równocześnie sporządzić standardowy roztwór trypsyny, czyli do probówki pobrać 2 ml
roztworu trypsyny i 2 ml wody. Wszystkie probówki umieścić w łaźni wodnej w 37
o
C na 10 minut.
Następnie dodać do każdej w odstępach 30 sekundowych 5 ml roztworu BAPNA, dokładnie
wymieszać i inkubować. Dokładnie po upływie 10 minut przerwać reakcję dodając 1 ml 30% kwasu
octowego. Po ochłodzeniu odczytać absorbancję próbek przy długości fali 410 nm wobec wody.
Należy sporządzić próby ślepe do każdej próbki badanej i standardowego roztworu trypsyny.
Próby te różnią się od właściwych kolejnością dodawania odczynników. Prób ślepych nie inkubuje
się w 37
o
C.
Ślepa dla próbki badanej: do probówki wprowadzić 1 ml rozcieńczonego ekstraktu + 1 ml wody, 5 ml
roztworu BAPNA, 1 ml kwasu octowego i na końcu 2 ml roztworu trypsyny.
Ślepa dla roztworu trypsyny: 2 ml wody, 5 ml roztworu BAPNA, 1 ml kwasu octowego i na końcu 2
ml roztworu trypsyny. Zawartość probówek zamieszać i odczytać absorbancję względem wody.
Obliczenia:
Od absorbancji standardowego roztworu trypsyny należy odjąć absorbancję ślepej – A trypsyny
Od absorbancji próbki należy odjąć absorbancję ślepej – A próbki
A trypsyny • 100 = X TU
A próbki • 100 = Y TU
Procent hamowania aktywności trypsyny obliczyć z proporcji:
X TU - 100%
Y TU- x %
Hamowanie = 100- x
Jeśli hamowanie aktywności trypsyny mieści się w zakresie 40- 60% to można przejść do
oznaczenia właściwego.
3. OZNACZENIE WŁAŚCIWE
Do 3 probówek pobrać 0,8 1,0 1,2 ml odpowiednio rozcieńczonego ekstraktu i dopełnić wodą
destylowaną do 2,0 ml. Do każdej probówki dodać po 2,0 ml roztworu trypsyny, zamieszać na
vortexie i wstawić do łaźni wodnej 37
o
C na 5 minut. Do każdej próbówki dodać po 5 ml roztworu
BAPNA w odstępach 30 sekundowych (zamieszać na vortexie).
Dokładnie po 10 minutach inkubacji w 37
o
C przerwać reakcję przez dodanie 1 ml 30% kwasu
octowego. Zmierzyć absorbancję przy 410 nm względem wody.
Przygotować próby ślepe dla każdej objętości rozcieńczonego ekstraktu. Odczytać ich
absorbancję względem wody.
Wyniki wyliczyć w jednostkach aktywności inhibitorów trypsyny (TIU)
Obliczenia:
Obliczenia należy przeprowadzić na różnicach absorbancji prób właściwych i ich ślepych.
Δ A • 100 = TU
Dla każdej objętości rozcieńczonego ekstraktu należ obliczyć TIU / ml
TIU/ ml = (TU trypsyny – TU próbki ) / X
X= ml rozcieńczonej zawiesiny w próbie
Wyliczyć średnią dla wszystkich powtórzeń i przeliczyć na 1 g mączki
Uwaga:
Jedna jednostka trypsynowa (TU) jest zdefiniowana jako wzrost o 0,01 jednostki absorbancji
przy =410 nm na 10 ml mieszaniny reagującej w warunkach metody.