Ilościowe oznaczenie glikogenu oraz badanie niektórych jego 

właściwości 

Cel ćwiczenia

Celem   ćwiczenia   jest   zapoznanie   się   z   podstawową   wiedzą   dotyczącą   budowy, 

funkcji   i   właściwości   glikogenu   jak   również   poznanie   zasad   najczęściej   stosowanych 
metod ilościowego oznaczania zawartości tego polisacharydu. 

Wprowadzenie

Budowa   glikogenu.  Jest   to   silnie   rozgałęziony   polisacharyd   zwierzęcy, 

homopolimer   zbudowany   z  reszt   α-D-glukozy   połączonych   ze   sobą   wiązaniami   α-1,4-
glikozydowymi, a w miejscach rozgałęzień α-1,6-glikozydowymi. Glikogen ma budowę 
zbliżoną   do   składnika   skrobi   –   amylopektyny,   ale   rozgałęzienia   w   jego   cząsteczce   są 
liczniejsze i krótsze. Jedno rozgałęzienie przypada zwykle na 10-12 reszt glukozy. 
Taka budowa cząsteczki glikogenu sprawia, że rozpuszcza się on lepiej w wodzie niż 
amylopektyna.  Wielkość cząsteczek glikogenu, jak też liczba i stopień rozgałęzień tego 
wielocukru zależą od źródła, z którego został wyizolowany. Masa cząsteczkowa glikogenu 
jest   różna   i   waha   się   w   granicach   od   kilkuset   tysięcy   do   kilku   milionów   Da   (masa 
cząsteczkowa glikogenu w mięśniach ok. 1 000 000, a w wątrobie ok. 5 000 000 Da). 
Występowanie i funkcje glikogenu

. 

Jest to zapasowy polisacharyd odkładany w wątrobie 

i   w   mniejszych   ilościach   w   mięśniach.   Zawartość   glikogenu   jest   zależna   od   stanu 
fizjologicznego organizmu, w wątrobie wynosi od 2 do 10%, a w mięśniach od 0,5 do 
1,5%   tkanki.   Ze   względu   na   dużą   masę   mięśni   w   porównaniu   z   masą   wątroby   w 
organizmie przeważa jednak forma mięśniowa tego polisacharydu. Organizm ludzki może 
zmagazynować   nawet   do   450   g   glikogenu,   z   czego   jedynie   ok.   30   %   znajduje   się   w 
wątrobie. W komórce glikogen wraz z większością enzymów niezbędnych do jego syntezy 
i degradacji jest zlokalizowany w postaci ziarnistości w cytoplazmie. 
Glikogen   w   wątrobie   służy   przede   wszystkim   do   utrzymania   odpowiedniego   poziomu 
glukozy   we   krwi   w   przerwach   pomiędzy   posiłkami.

 

Glikogen   w   mięśniach   stanowi 

natomiast   rezerwę   glukozy   wykorzystywanej   do   syntezy   ATP   podczas   intensywnych 
skurczów mięśni i nie bierze udziału w regulacji stężenia cukru we krwi. 
Aktywność enzymów uczestniczących w syntezie i rozkładzie glikogenu podlega złożonej 
regulacji przez hormony i inne czynniki. 
Właściwości fizykochemiczne glikogenu. Podobnie jak pozostałe polisacharydy glikogen 
należy   do   grupy   nie   zjonizowanych   związków   polarnych.   Jako   koloid   hydrofilowy 
rozpuszcza   się   w   wodzie   na   zimno   dając   opalizujący  roztwór.   Możliwe   jest   to   dzięki 
występowaniu w jego cząsteczce licznych grup hydroksylowych, mogących łatwo tworzyć 
wiązania wodorowe z cząsteczkami wody. W obecności soli nieorganicznych o znacznych 
stężeniach   oraz  pod wpływem  cieczy  organicznych   mieszających  się  z  wodą glikogen 
łatwo ulega wytrąceniu z roztworu. Dodanie do roztworu glikogenu soli obojętnej dobrze 
zdysocjowanej, np. siarczanu amonowego lub chlorku sodowego, powoduje rozerwanie 
wiązań   wodorowych   między   grupami   –OH   polisacharydu   a   cząsteczkami   wody 
(dehydratacja),   a   samorzutnie   tworzące   się   wewnątrz-   i   międzycząsteczkowe   wiązania 
doprowadzają do agregacji cząsteczek glikogenu i wytrącenia asocjatów z roztworu. Pod 
wpływem   rozpuszczalników   organicznych,   takich   jak   aceton   czy   alkohol,   następuje 
znaczne   zmniejszenie   stałej   dielektrycznej   roztworu   (woda   –   80,   etanol   –   24),   co   w 
konsekwencji   również   prowadzi   do   zmniejszenia   stopnia   uwodnienia   grup 

1

hydroksylowych  glikogenu  i powoduje jego wytrącenie  z roztworu. Glikogen z jodem 
tworzy   kompleks   o   barwie   czerwonobrunatnej.   Pozwala   to   na   odróżnienie   niektórych 
polisacharydów   (glikogen,   skrobia)   od   innych,   gdyż   kompleksy   takie   mogą   być 
wytwarzane tylko przez cząsteczki o odpowiednio dużych wymiarach i uporządkowanej 
strukturze. Boczne łańcuchy rozgałęzionej cząsteczki glikogenu tworzą układy spiralne, w 
których   środku   występują   wolne   przestrzenie   umożliwiające   pomieszczenie   cząsteczek 
jodu.   Charakterystyczna   absorpcja   jodu   występuje   jedynie   w   przypadku   łańcuchów 
zawierających, co najmniej 6 reszt polisacharydowych (jeden skręt spirali). Barwny efekt 
jest tym silniejszy, im większe są cząsteczki polisacharydu, a więc im większa jest liczba 
cząsteczek   jodu   związanego   w   kompleksie.   Glikogen,   jako   polisacharyd   nie   wykazuje 
właściwości   redukujących.   Stosunkowo   łatwo   ulega   on   hydrolizie   kwasowej   oraz 
enzymatycznej   z   udziałem   amylaz.   Podczas   zajęć   laboratoryjnych   hydroliza   wiązań 
glikozydowych   będzie   przeprowadzona   w   wysokiej   temperaturze   w   obecności   kwasu 
solnego.   Obecność   uwolnionych   w   wyniku   hydrolizy   cukrów   redukujących   stanowi 
podstawę najczęściej stosowanych metod oznaczeń ilościowych tego polisacharydu.

Rys. 1. Hydroliza kwasowa glikogenu 

Zasada metody Somogyi i Nelsona (punkt a wykonania ćwiczenia). 

G

lukoza   redukuje   w   środowisku   alkalicznym   obecne   w   odczynniku   miedziowym 

(Somogyi) jony Cu

2+

 do Cu

+

. Ilość powstałego w reakcji tlenku miedzi (I) oznacza się przy 

użyciu   odczynnika   arsenomolibdenowego   (Nelsona),   który   ulega   redukcji   do   błękitu 
molibdenowego. Natężenie powstałej niebieskiej barwy produktu jest proporcjonalne do 
ilości wytworzonego Cu

2

O a tym samym do ilości powstałej podczas hydrolizy glikogenu 

glukozy.
Zasada metody Benedicta (punkt b wykonania ćwiczenia). W środowisku alkalicznym 
jony miedzi (II) ulegają pod wpływem glukozy redukcji do Cu(I), z roztworu wypada 
żółty, pomarańczowy lub ceglastoczerwony osad tlenku miedzi(I). Z barwy i ilości osadu 
można w przybliżeniu ocenić stężenie sacharydu w badanym roztworze.

Odczynniki
1. Roztwór glikogenu o stężeniu ok. 2 mg/1 ml.
2. Roztwór glikogenu o stężeniu 5 mg/ml.

2

3. Jod w jodku potasowym (10 g KI + 2,5 g I

2

 w 1 l).

4. 2 M kwas solny.
5. 1 M wodorotlenek sodowy.
6. 2 M wodorotlenek sodowy.
7. Odczynnik Benedicta: 173 g cytrynianu sodowego i 100 g węglanu sodowego rozpuścić 
w 800 ml ciepłej wody, uzupełnić wodą destylowaną do 850 ml. Przygotować 
jednocześnie roztwór siarczynu miedziowego (17, 3 g w 100 ml wody destylowanej). 
Zmieszać oba roztwory, całość uzupełnić wodą do 1000 ml. 
8. Roztwór glukoamylazy o stężeniu dobranym do warunków ćwiczenia
9. Odczynnik Somogyi (miedziowy): rozpuścić 24 g bezwodnego węglanu sodu i 12 g 
winianu sodowo-potasowego w 240 ml wody destylowanej. Dodać 4 g siarczanu miedzi 
rozpuszczonego w 40 ml, po czym dodać 16 g kwaśnego węglanu sodu. Przygotować 
równoległe roztwór siarczanu sodowego: rozpuścić 18 g bezwodnego siarczanu sodu w 
500 ml wody, gotować, schłodzić. Zmieszać oba roztwory i uzupełnić wodą destylowaną 
do 1000 ml. 
10. Odczynnik Nelsona (arsenomolibdenowy): 25 g czterowodnego molibdenianu 
amonowego rozpuścić w 450 ml wody destylowanej i ostrożnie dodać 21 ml stężonego 
H

2

SO

4

. Oddzielnie rozpuścić 3 g kwaśnego arsenianu sodowego siedmiowodnego 

(Na

2

HAsO

4

 7H

2

O) w 25 ml wody destylowanej i przelać oba roztwory do kolby miarowej 

na 500 ml. Uzupełnić do kreski wodą destylowaną.

Wykonanie

a) Oznaczanie stężenia glikogenu metodą Somogyi i Nelsona

Otrzymany   w   kolbie   miarowej   na   10  ml   roztwór   glikogenu  (1)  dopełnić   wodą 

destylowaną do kreski i wymieszać. Pobrać z kolby 2 ml roztworu do probówki, dodać 5 
ml 2 M kwasu solnego (4), wymieszać i prowadzić hydrolizę glikogenu we wrzącej łaźni 
wodnej  przez  30 minut.  Następnie  próbę ochłodzić  zimną  wodą, zobojętnić  hydrolizat 
przez dodanie 5 ml 2 M wodorotlenku sodowego (6) i wymieszać. Do 2 probówek pobrać 
po 1  ml   uzyskanego   hydrolizatu.   Przygotować   także  próbę  kontrolną,   w  której  należy 
zmieszać 0,5 ml 2 M kwasu solnego (4) i 0,5 ml 2 M wodorotlenku sodowego (6). Do 
wszystkich trzech probówek odmierzyć  po 1 ml odczynnika Somogyi  (9), zamieszać i 
wstawić do wrzącej łaźni wodnej dokładnie na 10 minut. Próby ochłodzić zimną wodą i 
odmierzyć   do   nich   po   1   ml   odczynnika   Nelsona  (10),   dokładnie   wymieszać   aż   do 
rozpuszczenia  osadu tlenku  miedzi  (I) i ustania wydzielania  pęcherzyków  gazu (CO

2

). 

Próby rozcieńczyć  dodając po 7 ml  wody destylowanej, wymieszać  i po 10 minutach 
zmierzyć w fotometrze absorbancję przy długości fali 520 nm wobec próby kontrolnej. 
Odczyty   z   aparatu   uśrednić   a   następnie   odczytać   z   wcześniej   przygotowanej   krzywej 
wzorcowej odpowiadające im stężenie glukozy. 

b) Badanie niektórych właściwości glikogenu
1.  Stopniowa  hydroliza  kwasowa  glikogenu.   Przygotować   8   probówek,   do   4   z   nich 
odmierzyć po 1 ml 1 M wodorotlenku sodowego (5), a do 4 pozostałych po 1 ml wody. 
Równolegle przygotować próbę do hydrolizy glikogenu: do probówki odmierzyć 10 ml 
roztworu glikogenu (2) i 5 ml 2 M kwasu solnego, wymieszać i pobrać natychmiast po 1 
ml tej mieszaniny do pierwszych probówek serii z 1 M wodorotlenkiem sodu oraz z wodą 
(próby   pobrane   w   czasie   zerowym).   Pozostałą   część   próby  do   hydrolizy   umieścić   we 
wrzącej łaźni wodnej i po 5, 10 i 15 minutach pobierać po 1 ml mieszaniny do kolejnych 

3

probówek serii z wodorotlenkiem sodowym i z wodą. Roztwory w probówkach z wodą po 
pobraniu próby natychmiast potraktować 2 kroplami roztworu jodu w jodku potasu (3). 
Następnie do probówek zawierających wodorotlenek sodowy i hydrolizat glikogenu dodać 
po 1 ml odczynnika Benedicta (7), po wymieszaniu wstawić na dwie minuty do wrzącej 
łaźni wodnej. 
2. Hydroliza enzymatyczna glikogenu. Do probówki odmierzyć 2 ml glikogenu (2) i 1 ml 
glukoamylazy   (8),   wymieszać   i   wstawić   do   łaźni   wodnej   o   temp.   40°C   na   10   minut. 
Reakcję przerwać przez zakwaszenie 0,2 ml 2 M kwasu solnego (4), wymieszać. 
Przygotować dwie probówki, do jednej z nich pobrać 1 ml tej mieszaniny, do drugiej 1 ml 
glikogenu (2), do obu dodać po 1 ml odczynnika Benedicta (7), wymieszać i ogrzewać we 
wrzącej łaźni wodnej przez 2 minuty. 

Opracowanie wyników

W celu obliczenia czystości otrzymanego roztworu glikogenu należy na podstawie 

średniej wartości absorbancji prób pełnych dokonać odczytu stężenia glukozy z krzywej 
wzorcowej i uwzględnić podany podczas zajęć sposób rozcieńczenia preparatu glikogenu. 
W obliczeniach należy także uwzględnić współczynnik 0,9 (162g/180g)  pozwalający na 
przeliczenie stężenia glukozy na stężenie glikogenu. 
Przykładowe   obliczenia  na  podstawie  przedstawionego   poniżej  schematu   rozcieńczenia 
zadania kontrolnego:

2 g glikogenu technicznego (zawierającego zanieczyszczenia niecukrowe) rozpuszczono 
w 1000 ml wody destylowanej; z tak przygotowanego roztworu studenci otrzymali w 
formie zadania kontrolnego różne jego objętości (objętość podaje prowadzący ćwiczenia 
po   przyjęciu   wyników   absorbancji,   w   przedstawionym   przykładzie  3ml)   w   kolbce 
miarowej na 10ml, uzupełnionej do kreski wodą destylowaną. 

Do hydrolizy pobrano 2 ml z kolby na 10 ml, po neutralizacji pH otrzymano mieszaninę o 
objętości 12 ml, z której pobrano 1 ml do oznaczenia zawartości glukozy.  
Przyjmijmy, ze średnia wartość absorbancji dla prób pełnych wyniosła 0,240 a odczytana 
wartość z krzywej wzorcowej 90 μg glukozy, co po uwzględnieniu współczynnika 0,9 daje 
nam 81 μg glikogenu.
Z analizy schematu rozcieńczenia otrzymanej próby wynika, skoro ze w 1 ml roztworu 
pobranego do oznaczenia jest 81 μg glikogenu to w 12 ml 972 μg, tyle samo glikogenu 
jest w 2 ml pobranego z kolby na 10 ml roztworu. W kolbie miarowej (10 ml) jest 4,86 mg 
glikogenu i tyle samo w 3 ml wydanego zadania kontrolnego, zatem w 1000 ml: 
      3 ml –4,86 mg 
1000 ml –x mg , x = 1620 mg=1,62 g, co odpowiada zawartości glikogenu w 1000 ml 
przygotowanego roztworu glikogenu technicznego. Ze schematu rozcieńczeń wynika, że w 
1000 ml rozpuszczono 2 g glikogenu technicznego, więc: 
2,0 g – 100%
1,62 g – x%
Czystość glikogenu (%) w jego preparacie handlowym wynosi 81%. 

4

B. 1.  Należy dokonać  obserwacji  powstałego  tlenku   miedzi   (I) w  próbach,  w   których 

przeprowadzono reakcję z odczynnikiem Benedicta. W próbach z wodą obserwować 
stopniowy zanik barwy kompleksu glikogenu z jodem. 

2. Dokonać obserwacji prób po reakcji z odczynnikiem Benedicta. Wyjaśnić potencjalne 

różnice pomiędzy barwą tych prób. 

 Pytania
1. Do jakiej grupy związków należy glikogen? Omów występowanie i funkcje glikogenu. 
2. Napisz fragment cząsteczki glikogenu. Wskaż i nazwij występujące tam wiązania.
3. W jaki sposób można dokonać hydrolizy glikogenu? 
4.   W   jaki   sposób   można   ilościowo   oznaczyć   glikogen?   Podaj   zasadę   stosowanej   na 
ćwiczeniach metody.
5. Omów sposoby wytrącania glikogenu z roztworu.
6.   Czy   jod   w   kompleksie   z   glikogenem   zmienia   swoją   wartościowość?   Uzasadnij 
odpowiedź.
7. Uzasadnij stopniową zmianę barwy roztworu glikogenu z odczynnikiem Benedicta i z 
jodem w miarę reakcji: a) z kwasem solnym, b) z enzymem.

Literatura: 

M. Somogyi.  Notes on sugar determination. The Journal of Biological Chemistry, 
Baltimore, 195: 19-23 (1952)
N. Nelson. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination of 
glucose. The Journal of Biological Chemistry, Baltimore, 153: 375-381 (1944) 
Krishnaveni, S., Theymoli Balasubramanian and Sadasivam, S. Sugar distribution in sweet 
stalk Sorghum. Food Chemistry 15: 229-232 (1984).

5

6