3. Chromatografia cieczowa – sączenie molekularne białek 

 
 

Chromatografia cieczowa na Ŝelu Sephadex, określana teó jako sączenie molekularne, jest technik 
umoŜliwiającą  analityczny  bdï  preparatywny  rozdział  substancji  róŜniących  się  mas 
cząsteczkową. 
 
Sephadex  jest  handlową  nazw  z»oóa  stanowiącego  poprzecznie  usieciowane  »a½cuchy  dekstranu. 
ś

el ten ma postać granulek o średnicy 10-300 µm, które w zaleŜności od usieciowienia, róŜnią się 

zdolnością  wchłaniania  wody.  Cecha  ta  decyduje  o  właściwościach  rozdzielczych  Ŝelu. 
Produkowane  są  złoŜa,  w  których  stopień  usieciowienia  określa  cyfra  znajdująca  się  przy  duŜej 
literze "G" (od G-10 do G-200), przy czym im większa cyfra tym niŜsze usieciowienie. 
 
Mechanizm sączenia na Ŝelu w największym uproszczeniu przedstawia się następujco. Cząsteczki 
większe  niŜ  pory  napęczniałych  ziaren  Ŝelu  nie  mogą  penetrować  do  ich  wnętrza,  a  więc 
przepływają  wyłącznie  wraz  z  fazą  ruchomą  i  są  eluowane  jako  pierwsze.  Mniejsze  cząsteczki 
wnikające w róŜnym stopniu do wnętrza granulek Ŝelu, w zaleŜności od swego kształtu i rozmiaru, 
eluowane są w kolejności zmniejszania się ich masy cząsteczkowej 
 
Charakteryzując  w  doświadczeniu  stosowaną  kolumnę  chromatograficzną  oraz  zachowanie  się 
rozdzielanych substancji, stosuje się następujące pojęcia: 
 

 

objętość całkowita złoŜa  V

tot

 

 

objętość  pusta  kolumny  V

o

,  tzn.  objętość  eluentu  znajdującego  się  pomiędzy                                 

ziarnami Ŝelu 

 

objętość rozpuszczalnika związanego z Ŝelem  V

i

 

 

objętość matrycy Ŝelu  V

g

 

 

objętość elucyjna V

e

, charakterystyczna dla danej substancji 

 
Pomiędzy tak zdefiniowanymi wielkościami zachodzi następujca zaleŜność: 

 

        V

tot

 = V

o

 + V

i

 + V

g

 

 

 

Rozpatrując sączenie molekularne na Ŝelu jako szczególny przypadek chromatografii podziałowej, 
zastosować  moŜna  zaleŜność  pomiędzy  objętości  elucyjną  substancji  V

e

  a  współczynnikiem 

podziału  K  tej  substancji  między  fazę  stacjonarną  i  ruchomą  (charakterystycznym  dla  tej 
substancji): 

 

                   V

e

 = V

o

 + KV

g 

 

gdzie: K współczynnik podziału, V

o

  faza ruchoma, V

g

 

−

 faza stacjonarna. 

 
W  chromatografii  na  Ŝelu  w  zaleŜności  od  zdefiniowania  fazy  stacjonarnej  stosuje  się  dwa  róŜne 
współczynniki podziału. 
 
JeŜeli  jako  fazę  stacjonarną  traktuje  się  rozpuszczalnik  związany  z  Ŝelem  (V

i

),  otrzymujemy 

zaleŜność: 

 

                                    V

e

 - V

o

                        

                           K

D

 = --------- 

                                       V

i

 

 

Jeśli jako fazę stacjonarną przyjmujemy ca»ą fazę Ŝelu (tzn. V

i

 + V

g

), otrzymujemy zaleŜność: 

 
                                      V

e

 - V

o

 

                           K

AV

 = ----------- 

                                      V

tot

 -V

o

 

               

 

 

Wartoу  K

AV

  jest  łatwiejsza  do  wyznaczenia,  stąd  teŜ  częściej  jest  stosowana  w  praktyce.  Jej 

wartości w zaleŜności od wielkości cząsteczek leŜą w granicach 0-1. 
 
W praktyce sączenie molekularne stosuje się do: 


 

rozdziału substancji róŜniących się masą cząsteczkową 



 

odsalania  substancji,  których  masy  cząsteczkowe  są  znacznie  większe  od  masy                 
cząsteczkowej soli obecnej w próbce 



 

wyznaczania mas cząsteczkowych związków. 

 
Odczynniki i sprzęt laboratoryjny: 

1.

 

Kolumna chromatograficzna o wymiarach 2

×

30 cm 

2.

 

Cylinder miarowy na 50 m

L

 

3.

 

Pipety miarowe 

4.

 

Probówki szklane zwykłe 

5.

 

Strzykawka na 1 m

L

 z ig» 

6.

 

Zlewki na 500 m

L

 

7.

 

Erlenmajerka na 500 m

L

 

8.

 

Spektrofotometr UV-Vis 

9.

 

Sephadex G-75, 90 m

L

 zawiesiny w 0,9% NaCl 

10.

 

Eluent: 0,9% roztwór NaCl, 500 m

L

 

11.

 

Próbka do rozdziału: 0,5 m

L

 0,9% roztworu NaCl zawierającego 2% sacharozy oraz: 1 mg Blue 

Dextranu (M. cz. oko»o 2000000), 5 mg albuminy z osocza bydlęcego (BSA) (M. cz. 68000), 5 
mg inhibitora trypsyny wyodrębnionego z nasion soi (STI) (M. cz. oko»o 20000) i 10 mg CoCl

2

 

(M. cz. 130) 

12.

 

Wata szklana 

13.

 

Kuwety kwarcowe 

 
Wykonanie doświadczenia: 
 
1. Przygotowanie kolumny 
 
Kolumn“ chromatograficzną umieścić pionowo w statywie, zamknąć jej wylot zaciskaczem i wlać 
do  niej  około  10  m

L

  roztworu  NaCl.  Następnie  przy  pomocy  bagietki  umieścić  na  dnie  kolumny 

tamponik  z  waty  szklanej  uwaŜając,  aby  nie  powstały  pęcherzyki  powietrza.  OstroŜnie  wlać  (po 
bagietce)  do  kolumny  zamieszaną  uprzednio  zawiesinę  Ŝelu  (przed  jej  zamieszaniem  zawiesina  w 
zlewce powinna byƒ przygotowana tak, aby 2/3 jej objętości stanowił Ŝel, a 1/3 roztwór NaCl). 

 

Odczekać,  aŜ  na  dnie  kolumny  uformuje  się  warstwa  Ŝelu  3-5  cm,  po  czym  ostroŜnie  otworzyć 
zacisk kolumny. Roztwór powinien wypływać z szybkości 1 kropli/sek. Wysokość uformowanego 
Ŝ

elu  powinna  wynosiƒ  20  cm.  Następnie  na  szczycie  kolumny  ostroŜnie  umieścić  krąŜek  z  bibuły 

filtracyjnej  i  zamknąć  wylot  kolumny,  pozostawiwszy  nad  powierzchnią  co  najmniej  2  cm 
roztworu. 
 
Uwaga: uformowana kolumna musi być zawsze przykryta warstwą roztworu. 
 
 

2. RównowaŜenie kolumny 

 

Kolumnę  z  uformowanym  Ŝelem  Sephadex  G-75  połączyć  ze  zbiornikiem  zawierającym  300  m

L

 

eluentu,  otworzyć  zacisk  u  dołu  kolumny  i  przepuścić  przez  nią  ok.  80  m

L

  roztworu.  Szybkość 

przepływu  powinna  wynosiƒ  ok.  1  m

L

/min.  Szybkość  tę  reguluje  się  poprzez  zmianę  po»oŜenia 

zbiornika w stosunku do kolumny. 

 

3. Rozdział na kolumnie 

 

Po przemyciu kolumny zaznaczyć dolną i górną granicę złoŜa, przerwać dopływ cieczy do kolumny 
pozostawiając  nad  powierzchnią  Ŝelu  minimalną  warstwę  roztworu.  Przy  pomocy  strzykawki 
nanieść ostroŜnie (nie naruszając złoŜa) na czoło kolumny 0,5 m

L

 roztworu badanej próbki (uwaga: 

próbkę  naleŜy  przefiltrować  przed  naniesieniem  na  kolumnę).  Otworzyć  ostroŜnie  wylot 
kolumny,  umieszczając  jako  odbieralnik  wycieku  cylinder  miarowy.  Po  wsiąknięciu  próbki  w  Ŝel 
naleŜy  zamknąć  wylot  kolumny,  a  następnie  przy  uŜyciu  wypłukanej  uprzednio  strzykawki 
wprowadzić tyle roztworu eluentu, aby jego warstwa nad powierzchnią Ŝelu wynosiła ok. 2 cm. Do 
kolumny podłączyć rezerwuar z eluentem i otworzyć jej wylot. Pierwsze 10 m

L

 wycieku zbierać do 

cylindra  miarowego,  a  następnie  zbierać  frakcje  o  objętoÑci  2,5  m

L

  do  probówek  aŜ  do  momentu 

całkowitego  wyeluowania  chlorku  kobaltu  (II).  Przerwać  elucję,  wylać  Ŝel  z  kolumny  do  zlewki. 
Zmierzyƒ  objętość,  jaką  zajmował  Ŝel,  napełniając  kolumnę  wodą  i  mierząc  cylindrem  objętość 
wody  mieszczącej  się  w  części  kolumny  zaznaczonej  uprzednio  kreskami.  Wartość  tę  (V

tot

) 

zanotować. 

 

4. Wyniki i obliczenia 

 

Zmierzyć  absorbcję  frakcji  zawierających:  Blue  Dextran  przy  620  nm,  albuminy  z  osocza 
bydlęcego (BSA) przy 280 nm, mioglobiny i CoCl

2

 przy 510 nm. Zanotować wyniki: 

 

Absorbancja 

 

Numer frakcji 

620 nm 

510 nm 

280 nm 

1 

 

 

 

2 

 

 

 

3 

 

 

 

 

Sporządzić na papierze milimetrowym lub posługując się odpowiednim programem komputerowym 
diagram elucji. Obliczyć dla rozdzielanych związków wartości K

AV

 w/g wzoru:  

                                                        

                                      V

e

 - V

o

 

                           K

AV

 = ----------- 

                                      V

tot

 -V

o

 

  

gdzie:  V

e

   objętość elucyjna badanej substancji 

V

o

   objętość elucyjna Blue Dextranu 

V

tot

 objętość całkowita złoŜa    

 
Wyniki umieścić w tablicy: 

 

Substancja 

V

e

 [m

L

] 

V

e

 - V

o

 [m

L

] 

V

e

-V

o

/V

tot

-V

o

 

K

AV

 

BSA 

 

 

 

 

STI 

 

 

 

 

CoCl

2

 

 

 

 

 

 
Zakres materiału: 
Chromatografia  cieczowa  –  mechanizmy  rozdziału,  białka  budowa  i  funkcja,  właściwości 
spektroskopowe białek.