31 |
S t r o n a
MEDYCYNA SĄDOWA, ĆWICZENIE 3, P. 2, 16.12.2013
dr n. med. Maciej Jędrzejczyk
Wprowadzenie do genetyki sądowej
1. Materiały biologiczne – testy wstępne
2. Prawidłowe zabezpieczenie śladów biologicznych / błędy
3. DNA w komórce – źródła, podział
4. Markery stosowane w genetyce sądowej – podział, charakterystyka
5. Sekwencje tandemowo powtórzone w genomie człowieka – charakterystyka, zastosowanie
6. Proces badawczy w laboratorium genetycznym
7. Reakcja PCR / multiplex PCR – charakterystyka, zastosowanie
8. Markery nierekombinacyjne – charakterystyka, zastosowanie
9. Homozygota / heterozygota
10. Marker płci
11. Szansa ojcostwa / prawdopodobieństwo ojcostwa
12. Potwierdzenie / wykluczenie ojcostwa
13. Częstość genotypu / prawdopodobieństwo zgodności profilu genetycznego
Genetyka sądowa - zastosowanie
Ustalenie pokrewieństwa
o ojcostwo / macierzyństwo
o brak rodziców – badanie krewnych
Identyfikacje osobnicza
o identyfikacja NN denatów / osób zaginionych / ofiar katastrof masowych
Kryminalistyka
o analiza zabezpieczonego materiału dowodowego w postaci śladów biologicznych
o szukanie profilu sprawcy / ofiary na dowodach
o identyfikacja sprawców przestępstw – śladów biologicznych – bazy profili DNA
Analizy historyczne
Materiały biologiczne
wymazy np. z pochwy
krew
wycinki mięśni
kości – długie; zęby
odzież (plamy nasienia), pościel, meble, papierosy (pety)
włosy (przydatne tylko z cebulkami)
paznokcie
Możliwa degradacja – tkanki zatopione, utrwalone w formalinie / parafinie
32 |
S t r o n a
Materiały biologiczne: prawidłowe zabezpieczanie śladów
Warunki:
materiały suche: temperatura pokojowa, dostęp powietrza
ciecze, tkanki miękkie: -20
o
C do -80
o
C (kości)
Metody
Krew na antykoagulant (-20
o
C) lub bibuła / płótno/ FTA (+20
o
C)
Wymazy (-20
o
C lub +20
o
C po wysuszeniu)
Wysuszenie / zapakowanie w papierową kopertę: temperatura pokojowa – niedopałki, znaczki,
odzież (pobranie fragmentów lub w całości), włosy z cebulkami, paznokcie wraz z materiałem
znajdującym się pod nimi
Powierzchnie wchłaniające:
wycięcie fragmentu (dywan)
zabezpieczenie w całości (odzież)
Powierzchnie niewchłaniające:
zabezpieczenie na jałową wymazówkę (dźwignia zmiany biegów)
zabezpieczenie fragmentu przedmiotu wraz z zaplamieniem (kawałek stłuczonej szyby)
zabezpieczenie w całości, jeśli gabaryty niezbyt duże
Materiały biologiczne: nieprawidłowe zabezpieczanie śladów
praca w niesterylnych warunkach – brak rękawiczek, masek; używanie niejałowej wody
destylowanej – kontaminacja przy zabezpieczaniu
zabezpieczanie krwi na heparynę (inhibicja PCR)
niedosuszenie wymazów / zabezpieczonych śladów / przechowywanie w szczelnie
zamkniętych foliowych workach – rozwój mikroorganizmów i późniejsze zgnicie
zabrudzenie materiałów glebą (kwasy humusowe), rdzą, detergentami, chemikaliami (kwasy /
zasady) – degradacja DNA / inhibicja PCR
pozostawienie w nasłonecznionym miejscu – degradacja (UV)
Materiały biologiczne – testy jakościowe
A. Ślina
test niespecyficzny – test płytkowy (agar + skrobia) – aktywność α-amylazy
testy specyficzny:
o test immunochromatograficzny – obecność α-amylazy
o test odciskowy Phadebas – aktywność α-amylazy
B. Krew
testy niespecyficzne (luminol – Dexter używa, H2O2)
test specyficzny – immunochromatograficzny (hemoglobina ludzka)
33 |
S t r o n a
C. Sperma
test niespecyficzny – UV / test bardziej specyficzny – Bluemaxx – ma wyższe widmo (też
ślina i mocz)
test specyficzny – immunochromatograficzny (obecność PSA)
DNA
kwas deoksyrybonukleinowy
podwójna helisa
3 miliardy par zasad (A – G – C – T)
A = T, G = C
ok. 30000 genów
ponad 99% identyczności w populacji
1% różnica wykorzystywanych w genetyce sądowej
rejony kodujące (ok. 5%) i niekodujące (ok. 95%)
transkrypt z DNA na RNA
trójkąt nt – informacja o AA budujących białka
DNA: jądrowy i mitochondrialny
Zróżnicowanie sekwencji tandemowych
Sekwencje minisatelitarne – VNTR
Jednostka powtórzeniowa: od 9 do 100 bp / cała sekwencja kilka tysięcy bp
Bardzo wysoki stopień polimorfizmu
Polimorfizm wykrywany technikami: VNTR-RFLP lub VNTR-PCR
Sekwencje mikrosatelitarne – STR (krótkie powtórzenia tandemowe)
Motyw repetytywny: 2 – 6 bp
Duży polimorfizmu
Główna metoda analizy – PCR
34 |
S t r o n a
Techniki i markery używane w genetyce sądowej:
1. Analiza sekwencji tandemowo powtórzonych
Sekwencje mikrosatelitarne – STR
Sekwencje minisatelitarne – VNTR (znaczenie historyczne)
2. Sekwencjonowanie DNA mitochondrialnego
3. Analiza polimorfizmów typu SNP
DNA typu minisatelitarnego: VNTR
VNTR (variable number of tandem repeats) – występujące w genomie sekwencje DNA o
zmiennej liczbie tandemowych powtórzeń w locus
Jednostka powtórzeniowa: od 10 do 100 bp
Cała sekwencja – długość nawet do kilkudziesięciu tysięcy bp
Dziedziczenie i segregacja sech wg zasad Mendla
Bardzo wysoki polimorfizm
Polimorfizm wykrywany technikami: VNTR-RFLP lub VNTR-PCR
Przykład loci VNTR: D7S21, D12S11, D1S7
DNA typu mikrosatalitarnego: STR
STR – krótkie powtórzenia tandemowe
Jednostka: 2 – 6 bp
Ilość powtórzeń w rejonie może różnić się pomiędzy osobami
Duży polimorfizm; metoda analizy – PCR
Szeroko rozpowszechnione w ludzkim genomie gł. w rejonach niekodujących (brak informacji
m.in. o rasie, predyspozycjach do chorób, cechach fenotypowych np.: wzrost, kolor oczu /
włosów)
35 |
S t r o n a
Praca w laboratorium genetycznym – etapy:
1. Otrzymanie / pobranie materiału
2. Izolacja:
o
Metoda fenolowo – chloroformowa
o
Sherlock AX
3. Pomiar stężenia DNA
4. Amplifikacja DNA metodą PCR
5. Rozdział elektroforetyczny produktów PCR
o
analiza ręczna – barwienie żeli
o
analiza automatyczna – detekcja optyczna z wykorzystaniem promieni lasera
produktów znakowanych barwnikami fluorescencyjnymi (analizator genetyczny)
5. Genotypowanie
PCR – zasada reakcji
94
o
C
Denaturacja nici – pękanie wiązań wodorowych
59
o
C
Przyłączenie primerów do nici
5' TCATAAGT 3'
3' AGTATTCATT 5'
72
o
C
Wydłużenie przez polimerazę nici komplementarnej
do nici matrycy
Podwojenie ilości amplifikowanego fragmentu DNA w każdym cyklu:
1, 2, 4, 8, 16 ... [1 cykl = 2 cząsteczki (nowe fragmenty DNA)]
Multipex PCR
Jednoczesna amplifikacja wielu loci w jednej reakcji PCR.
Odpowiedni zestaw primerów w mieszaninie reakcyjnej – uniknięcie parowania się między sobą.
Primery wyznakowane różnymi barwnikami fluorescencyjnymi – odseparowanie od siebie loci o
podobnym zakresie masy (bp).
Rozdział produktów PCR w zależności od wielkości.
Oszczędność czasu i materiałów (degradacja DNA).
Potrzeba niewielkiej ilości DNA (2,5 ul).
Duża siła dyskryminacji zestawu np. 15 loci.
Amelogenina – marker płci (- 6 par zasad na X).
36 |
S t r o n a
Markery Y-STR
dziedziczenie w linii męskiej
ustalenie pochodzenia geograficznego (brak materiału referencyjnego)
SNPs – Single Nucleotide Polymorphisms
cytozyna na tyminę
najczęstsza zmiana zachodząca w sekwencji DNA
występuje w genomie średnio co 100 – 300 bp
różnica polega na ramieniu pojedynczego nukleotydu w sekwencji DNA pomiędzy osobnikami
mtDNA
przydatność przy analizie zdegradowanego jądrowego DNA
dziedziczenie w linii odmatczynej
dwuniciowa, kolista zamknięta cząsteczka
dziedziczenie wyłącznie od matki
występowanie w mitochondriach
Zasady wyłączania ojcostwa
I / LUB
muszą być 4 niezgodności, aby wykluczyć ojcostwo mężczyzny wobec dziecka
Wartość dowodowa analizy
Szansa ojcostwa – PI
Ocenia, ile razy bardziej prawdopodobne jest ojcostwo badanego pozwanego w porównaniu do
ojcostwa
losowo
wybranego
mężczyzny
dla
konkretnego
wyniku
ekspertyzy
–
PRAWDOPODOBIEŃSTWO OJCOSTWA
P = PI / PI + 1
Np. locus D12 S11:
ojciec 11 – 11
matka 15 – 15
dziecko 11 –15
u dziecka pojawia się nowa cecha
nieobecna u pozwanego o ojcostwo
mężczyzny ani u matki
dziecko nie dziedziczy cechy po
pozwanym o ojcostwo mężczyźnie
PI = 1 / częstość (15)
37 |
S t r o n a
Wartość dowodowa analizy
Łączna szansa ojcostwa – PI c
Zasada iloczynu - „PRODUCT RULE”
PI c = PI 1 lokus x PI 2 lokus x PI 3 lokus x …...
(mnożymy prawdopodobieństwo różnych loci)
Opiniowanie w analizie ojcostwa
EKSPERTYZA DNA
Wartość dowodowa analizy
Wartość dowodowa analizy
prawo Hardy'ego i Weinberga
wyłączenie minimum 4 niezgodności
potwierdzenie z
prawdopodobieństwem
> 99,9999% (PI > 1 000 000)
PI / PI + 1 = P
Analiza porównawcza uzyskanego
profilu DNA
niezgodność
zgodność
analiza statystyczna – CZĘSTOŚCI
POPULACYJNE
OPINIA
P r a w d o p o d o b i e ń s t w o
przypadkowej zgodności
STRUKTURA GENETYCZNA POPULACJI
odpowiednio liczna
kojarzenie losowe
brak doboru naturalnego
brak selekcji, mutacji i migracji
STAN DYNAMICZNEJ RÓWNOWAGI
Częstość występowania różnych
genotypów w populacji jest stała
i zależna jedynie od częstości
występowania alleli w populacji
38 |
S t r o n a
Wartość dowodowa analizy
Jeżeli allel „a” w lokus A ma częstość a, a allel „b” w lokus B ma częstość b
HWE w populacji
Wartość dowodowa analizy
ILOCZYN CZĘSTOŚCI GENOTYPÓW = CZĘSTOŚĆ PROFILU
1 / CZĘSTOŚĆ PROFILU = 1 PROFIL NA ….. OSÓB
PRAWDOPODOBIEŃSTWO PRZYPADKOWEJ ZGODNOŚCI
PE – SIŁA WYŁĄCZENIA tzw. przydatność do badań ojcostwa
Jest to odsetek niesłusznie pozwanych o ojcostwo mężczyzn, którzy zostaną wykluczeni w toku analizy.
PD – SIŁA DYSKRYMINACJI tzw. szansa zróżnicowania osób
Jest to prawdopodobieństwo, że dwie losowo wybrane osoby z populacji nie będą miały takiego
samego zestawu cech.
AA = a
2
CZĘSTOŚCI GENOTYPÓW
BB = b
2
AB = 2ab