1
BIOCHEMIA
CZYNNIKI BIOCHEMICZNE W OCENIE RYZYKA CHOROBY NIEDOKRWIENNEJ
SERCA
Czynniki ryzyka – stany, które częściej niż w populacji generalnej wiążą się z
powstawaniem patologii.
CHD w powyżej 95% powstaje na podłożu procesów miażdżycowych.
Czynniki ryzyka miażdżycy można podzielić na podstawie
1.) Częstości występowania
• Rzadko
• Często – zaburzenia gospodarki lipidowej, węglowodanowej, nadciśnienie tętnicze,
palenie tytoniu
2.) Siły oddziaływania
3.) Odwracalności (najważniejsze z punktu widzenia medycyny)
4.) Możliwości oznaczenia – dostępne, tanie, łatwe do interpretacji.
Biochemiczne czynniki ryzyka miażdżycy
• Zaburzenia metabolizmu lipidów
• Zaburzenia metabolizmu węglowodanów (tzw. zespół metaboliczny X, Reavena,
polimetaboliczny)
-hiperglikemia
-hiperinsulinemia
• Zaburzenia układu krzepnięcia i fibrynolizy
-fibrynogen, czynnik VII
-LPL (a)
• Zaburzenia przemian wolnorodnikowych
-oznaczanie przeciwciał przeciwko oxy-LDL
• Zaburzenia przemian aminokwasów
-hyperhomocysteinemia
• Zaburzenia przemian prostanoidów
-spadek wydalania metabolitów prostacykliny
-wzrost wydalania metabolitów TXA2
Metody
diagnostyczne
Biochemiczne (Ch, TG, HDL)
Koagulologiczne – układ krzepnięcia
Immunologiczne – ELISA –białka
Biologii molekularnej
Rodzaje badań diagnostycznych
Podstawowe – na poziomie podstawowej opieki zdrowotnej
Uzupełniające – na poziomie szpitala rejonowego
Specjalistyczne – bardzo trudno, niewielka liczba pacjentów
Zaburzenia gospodarki lipidowej są najczęstszym zaburzeniem metabolicznym
będącym podłożem chorób krążenia, które są pierwszą przyczyną zgonów.
2
Zaburzenia metabolizmu lipidów
• Silny związek z CHD (LDL)
• Grupa czynników o odwracalnym ryzyku (w takim samym stopniu jak narasta przy
wzroście LDL)
• Łatwość do wykonywania podstawowych oznaczeń
• Przydatność do monitorowania terapii
Etapy powstawania blaszki miażdżycowej
1.) Smuga tłuszczowa: są to złogi lipidów i komórek piankowatych pod śródbłonkiem.
Powstają już w wieku przedszkolnym i szkolnym – zmiana odwracalna
2.) Blaszka włóknista: komórki mięśniowe z warstwy środkowej proliferują i wchodzą pod
śródbłonek, tworząc kolagen i elastynę wytwarzają czepiec włóknisty
3.) Blaszka niestabilna
4.) Pęknięcie blaszki i zamknięcie światła naczynia
Groźniejsza jest mniejsza blaszka, gdyż pękając prowadzi do zawału, natomiast
większa daje objawy bólu wieńcowego.
Istnieją dwa rodzaje blaszek miażdżycowych: stabilna i niestabilna. Według koncepcji
Libbiego, będącej głównym kierunkiem terapii miażdżycowej dąży się do przejścia blaszki z
niestabilnej w stabilną , nie na odwrót.
Czynniki decydujące o powstawaniu blaszki miażdżycowej niestabilnej to wzrost:
Ilości makrofagów
Ilości proliferujących mięśni gładkich
Ilości lipidów
Prowadzą one do rozwarstwienia blaszki włóknistej.
Istotą miażdżycy jest proces zapalny, który związany jest z naciekiem makrofagów,
które z kolei pożerają lipidy tworząc komórki piankowate.
Etapy tego procesu:
1.) Dzięki molekułom adhezyjnym monocyty wchodzą pod śródbłonek, objadają się
cholesterolem i przekształcają w komórki piankowate, powstaje w ten sposób smuga
tłuszczowa, która jest całkowicie odwracalna
2.) Monocyty stymulują wydzielanie czynników wzrostowych, co powoduje z kolei wzrost
syntezy białek tkanki łącznej – powstaje czepiec włóknisty
3.) Gromadzenie się w ścianie naczyń makrofagów (degradacja czepca włóknistego)
4.) Gromadzenie się lipidów w miejscu zmiany (pokarm dla makrofagów, które tworzą
komórki piankowate)
5.) Proliferacja mięśni gładkich
6.) Wydzielanie enzymów proteolitycznych – blaszka niestabilna
7.) Rozkład blaszki (pęknięcie, oderwanie), płytki krwi zaczynają się wykrzepiać – incydent
wieńcowy
Blaszki niestabilne odznaczają się aktywniejszym metabolizmem, przez co są
cieplejsze (większy potencjał oksydacyjny), w przeciwieństwie do blaszek stabilnych, które
są zimniejsze.
Dotychczas stosowano technikę koronarografii, jednakże okazało się, iż pękają
blaszki, które były obojętne w koronarografii. Teraz paradygmat stosowany od około pół roku
– blaszka miażdżycowa nie rośnie do światła naczynia, ale na zewnątrz. Nie zakłóca więc ona
3
przepływu krwi. Dlatego też stosuje się USG wewnątrznaczyniowe. 20-25 MHz, można
prawie zobaczyć pojedyncze miocyty.
Czynniki ryzyka rozwoju miażdżycy
1.) Styl życia
• Dieta bogata w cholesterol, nasycone kwasy tłuszczowe i kalorie
• Palenie tytoniu
• Wzrost spożycia alkoholu
• Mała aktywność fizyczna
2.) Czynniki biochemiczne i fizjologiczne modyfikowalne
• Wzrost LDL (200mg%) o 1 mg% ryzyko wzrasta o 2%, jest to zasada 2:1, która jest
ryzykiem odwracalnym
• Spadek HDL (45 mg%) o 1 mg% ryzyko wzrasta o 3%, jest to zasada 3:1, która jest
ryzykiem nieodwracalnym
3.) Czynniki indywidualne niemodyfikowalne
Z powyższego wynika, iż korzyści terapeutyczne otrzymuje się obniżając LDL, nie
podwyższając HDL.
35% przypadków CHD występuje u osób ze stężeniem tCh<200mg%. Wynika z tego,
iż nie ma sensu oznaczać tCh. Trzeba znać stężenie TG, LDL, HDL.
Zasada 2:1, 3:1 – Framingham Heart Studies. Zasada 2:1 działa w obie strony (wzrost
stężenia Ch niesie za sobą wzrost ryzyka, spadek Ch – spadek ryzyka). Zasada 3:1 jest
jednokierunkowa. Stąd płynie jednoznaczny wniosek, iż NADRZĘDNYM CELEM
LECZENIA HIPERLIPIDEMII JEST REDUKCJA STĘŻENIA LDL!!!
Promiażdżycowe działanie hipercholesterolemii
Naciekanie ściany naczynia przez LPL
Modyfikacja struktury LPL (oksydacja, tiolacja, glikacja, angiotensynizacja,
homocysteinizacja, glikotiolacja)
Spadek syntezy prostacyklin i EDRF przez śródbłonek z jednoczesnym wzrostem ET 1
(wazokonstrykcyjna)
Zmniejszenie aktywności adhezyjnej śródbłonka
Zmiana reaktywności miocytów gładkich na czynniki presyjne ( wzrost ekspresji
receptora dla angiotensyny 1)
Wzrost ekspresji molekuł adhezyjnych na powierzchni endotelium
Wzrost migracji miocytów i makrofagów na powierzchni naczyń – komórki piankowate
Indukcja proliferacji miocytów gładkich w świetle naczyń (czynniki wzrostu wydzielane
przez komórki piankowate)
Zaburzenie równowagi krzepnięcia i fibrynolizy (gdy prostacyklina > TXA2, płytki
łatwiej przylegają do naczynia)
WYNIKA Z TEGO, IŻ LEKI HIPOLIPEMIZUJĄCE POWINNY POSIADAĆ TAKŻE
INNE PUNKTY UCHWYTU, NIE TYLKO OBNIŻAĆ STĘŻENIE CHOLESTEROLU
Lokalizacja
miażdżycy tętnic
• Aorta i jej odgałęzienia – przede wszystkim naczynia wieńcowe
• Naczynia mózgowe
• Naczynia duże w kończynach dolnych (mikroangiopatia –dno oka, kończyny dolne – w
cukrzycy)
4
Algorytm diagnostycznego postępowania w hipercholesterolemii
1.) Czy jest hiperlipidemia?
2.) Jaki jest jej typ?
3.) Jaka jest jej przyczyna?
4.) Czy istnieją u pacjenta nielipidowe czynniki ryzyka?
5.) Ocena globalnego ryzyka CHD.
6.) Określenie typu prewencji.
7.) Cel terapii.
Adn.1.)
Diagnostyka laboratoryjna gospodarki lipidowej na poziomie podstawowym
• Cholesterol całkowity
• HDL
• TG
• LDL (wzoru Friedewalda nie stosujemy, gdy TG>400 mg% - około 1% populacji taki
wynik ma, wtedy oznaczamy bezpośrednio stężenie LDL - chemicznie). Wzór
Friedewalda LDL(mg%)=tCH(mg%)-HDL(mg%)-TG(mg%)/5 lub (mM/l)/2,2
Zasady oznaczania
1.) Przygotowanie pacjenta
- 12-16-godzinna dieta 0 (tylko nieosłodzone płyny)
- stabilna masa ciała
2.) Wykonanie badania
- 2, 3 razy w odstępach 7-14 dni (gdy wynik nieprawidłowy lub prawidłowy, a my
oczekujemy, że nie powinien być, gdyż musimy być pewni – jest to leczenie na całe życie,
a parametry te są zmienne biologicznie)
- stosowanie identycznej diety
3.) Przeciwwskazania (niewiarygodne wyniki stężenia cholesterolu)
- ostra faza zawału mięśnia sercowego (6 tygodni od zawału parametry lipidowe są
wyższe)(zmniejszone stężenie Ch)
- ostre stany zapalne (zmniejszone)
- niewyrównane zaburzenia endokrynologiczne (niedoczynność tarczycy, niewyrównana
cukrzyca)
- leki powodujące zaburzenia lipidowe (tiazydy, β blokery nieselektywne,
glikokortykosterydy)
- ciąża (fizjologiczna hiperlipidemia)
LDL oznaczamy jak najszybciej, w momencie przyjęcia, ale rzadko pacjent jest na
czczo, wtedy trzeba zrobić oznaczenie chemiczne. Należy oznaczyć LDL w ten sam dzień w
przypadku przyjęcia chorego na zawał lub niewydolność wieńcową, gdyż już na drugi dzień
do 3 miesięcy u 98% pacjentów cholesterol spada. Po pierwsze należy usunąć przyczynę
hiperlipidemi. W przypadku wystąpienia zawału należy włączyć statyny, aby zmniejszyć
obszar zawału.
Diagnostyka laboratoryjna gospodarki lipidowej – badania uzupełniające
• Elektroforeza LPL lub test zimnej flotacji
• Apo B
• Apo A1
• LPL(a)
Diagnostyka laboratoryjna gospodarki lipidowej – badania specjalistyczne
5
• Fenotyp apo E
• Enzymy przemiany lipidowej
• NMR lipoprotein
• Polimorfizm genów kodujących białka enzymatyczne i nieenzymatyczne
Adn.2.)
Podział według Europejskiego Towarzystwa Miażdżycowego (najlepsze dla lekarza
praktyka, ale czasem taki podział jest niewystarczający)
hipercholesterolemia – cholesterol całkowity > 200mg%
hipertrójglicerydemia – TG > 200mg%
hipercholesterolemia mieszana – cholesterol całkowity >200mg%, TG >200mg%
Podział według WHO (podział Friedriecksona)
TYPY ELEKTROFOREZA
WYGLĄD OSOCZA
I
Chylomikrony Przejrzyste,
kożuch
IIA
Beta lipoproteiny (LDL)
Przejrzyste
IIB
Beta + pre-beta lipoproteiny
Opalizujące
III
Beta VLDL
Opalizujące, delikatny kożuch
IV
Pre-beta VLDL
Zmętnienie, delikatny kożuch
V
Pre-beta + chylomikrony
Zmętnienie, kożuch
CHOLESTEROL NIE POWODUJE ZMĘTNIENIA !!!
Test zimnej flotacji najbardziej jest przydatny do rozpoznania typu III – wysoce
aterogenne.
Zależność pomiędzy zgonami wieńcowymi, a stężeniem cholesterolu jest wprost
proporcjonalna. Najmniej przypadków w Japonii, najwięcej w Finlandii wschodniej
(niekorzystny fenotyp, mało Mg, Se).
Adn.3.)
Przyczyna
może być pierwotna (genetyczna) lub wtórna (towarzyszy innym
chorobom)
Przeprowadzamy kompleksowe badania
wywiad, badanie fizykalne
poziom TSH (wykluczamy subkliniczną niedoczynność tarczycy metodą ultraczułą III
generacji)
stężenie glukozy (doustny test obciążenia glukozą)
ocena nerek (kreatynina, badanie ogólne moczu)
ocena trzustki (amylaza w osoczu i moczu)
Gdy powyższe badania są ujemne rozpoznajemy pierwotną hiperlipidemię.
Adn.4.)
Nielipidowe czynniki ryzyka
• wiek, płeć (M>45, K>55 lub <55, ale nie przekwitła, nie stosująca hormonalnej terapii
zastępczej
• wywiad rodzinny (ojciec lub brat <55, matka lub siostra <65)
• palenie tytoniu
6
• nadciśnienie tętnicze >140/90 lub każde inne u osoby biorącej leki hipotensyjne
• cukrzyca lub upośledzona tolerancja glukozy
• trzewna dystrybucja tkanki tłuszczowej
• obniżona odporność
• HDL <35mg%
Adn.5.)
Ryzyko lipidowe i nielipidowe. Jakie jest ryzyko globalne. Wzrost czynników ryzyka
przy tym samym stężeniu Ch – ryzyko rośnie. Obniżamy czynniki ryzyka oraz stężenie Ch.
Jak
oszacować ryzyko CHD?
Karty ryzyka wieńcowego
Programy komputerowe
Internet
Karty ryzyka wieńcowego
Istnieją 4 karty – dla K, M., K z cukrzyca, M. z cukrzycą. Musimy znać stężenie Ch,
ciśnienie, palacz lub nie. Kolor ciemnopomarańczowy wskazuje na wzrost >20% ryzyka
wystąpienia zawału w ciągu 10 lat. Krytyka – rzeczywiste ryzyko jest znacznie wyższe,
dlatego kart tych się nie stosuje.
Internet
www.chd-taskterce.com
Kalkulator ryzyka PROCAM – tylko dla mężczyzn, FRAMINGHAM – dla obu płci.
Pięć kwintyli.
Zawał serca
I – ryzyko 4/1000 w ciągu 8 lat
V – ryzyko 167/1000 w ciągu 8 lat
Ryzyko zawału serca
I – 0,05% w ciągu roku
V – 2,26% w ciągu roku
Adn.6.)
Typy
prewencji
• Pierwotna – osoby pozornie zdrowe, niedopuszczenie do rozwoju CHD
• Wtórna – osoba z CHD lub zawałem, niedopuszczenie do pogłębienia choroby, jest
bardzo agresywna, gdyż istnieje duże ryzyko.
Wzrost ryzyka niesie za sobą wzrost agresyfikacji terapii, wysokie ryzyko plus dobrze
dobrana terapia niesie za sobą wzrost zysku.
Celem terapii nie jest obniżenie LDL o jakąkolwiek wartość.
Adn.7.)
Celem terapii nie jest obniżenie stężenia lipidów, ale osiągnięcie prawidłowego
stężenia cholesterolu, na podstawie badań klinicznych i epidemiologicznych.
Rekomendacje europejskie
Prewencja
pierwotna
Zajmowanie się tylko tym pacjentem, gdzie wysoki Ch koreluje z wysokim ryzykiem –
ryzyko > lub równe 20% w ciągu 10 lat (lub ekstrapolacja do 60r.ż.)
7
Prewencja wtórna
TCh <190 mg%
LPL <115 mg%
Rekomendacje amerykańskie
Prewencja
pierwotna
Mniej niż 2 nielipidowe czynniki ryzyka – poziom LDL obniżony do <160mg%, z reguły
jest ich więcej
2 lub więcej nielipidowych czynników ryzyka – poziom LDL obniżony do <130mg%
Prewencja wtórna
bez względu na ilość CHNS lub inna postać kliniczna miażdżycy – poziom LDL obniżony
do <100mg%
Istnieje pewna grupa pacjentów, u których obniżamy LDL <50 – 60mg%. Są to
pacjenci z grupy wysokiego ryzyka, do których należą
• pacjenci po PTLA
• pacjenci po by-pass
• pacjenci po przeszczepie serca
Agresywne leczenie hipolipemizujące jest bezpieczne, ponieważ przy stężeniu LDL
około 35mg% (0,65 mmol/l) receptory LDL są już w pełni wysycone. Trzeba tez wiedzieć, iż
nie ma takiego sposobu, aby obniżyć LDL o 30%. Im bardziej agresywna terapia tym lepsza.
Po co leczymy?
Nie po to, aby obniżyć LDL
Po to, aby obniżyć procent umieralności ogólnej – najważniejszy cel terapii
Zmniejszyć progresję miażdżycy tętnic
Uzyskać regresję
Zmniejszenie zmian ksantomatycznych
Profilaktyka OZT
Zmniejszenie zapadalności na CHD
Zmniejszenie zapadalności na zawał serca
Zmniejszenie ilości zabiegów rewaskularyzacyjnych
Algorytm postępowania lekarza
1.) Wywiad
2.) Badanie fizykalne
3.) Oznaczanie TSH metodą ultraczułą, gdyż często jest to subkliniczna niedoczynność
tarczycy – wzrost TSH przy prawidłowym stężeniu hormonów T3, T4
4.) Oznaczanie stężenia glukozy
5.) Ocena czynności wątroby
6.) Ocena czynności nerek (kreatynina)
7.) Ocena czynności trzustki
Wynika z tego, iż przy pierwszej wizycie oznaczamy TSH, gdy jest w normie - dalsze
badania.
Oznaczanie TSH
• Subkliniczna niedoczynność tarczycy jest czynnikiem ryzyka zawału serca u kobiet po
menopauzie (wzrost lepkości krwi, spadek klirensu LDL, wzrost stężenia homocysteiny)
• Częstość występowania 10% populacji
8
• Zawał serca – iloraz szans (OR)=2,3
• Zmiany miażdżycowe w aorcie OR=1,9
• TSH oznaczamy też zawsze u kobiet z hyperprolaktynemią
- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Zachorowania w Polsce
hipercholesterolemia (najczęstsza) – 61%K > 56% M.
hipercholesterolemia mieszana – 15%M. > 6%K
hipertriglicerydemia – 1%M. = 1%K
prawidłowy lipidogram – 32%K>28%M
Rodzaje hipercholesterolemii
1.) Pierwotna
• Rodzinna (1:1 000000 nie leczy się)
• Rodzinny defekt apo-B-100
• Poligeniczna
• Rodzinna hiper-alfa-lipoproteinemia (wzrost HDL)
2.) Wtórna
• Niedoczynność tarczycy
• Cholestaza
• Zespół nerczycowy
• Anorexsia nervosa
• Ostra porfiria przerywana
• Zespół Turnera
Metabolizm
LDL
Wątroba VLDL remnanty VLDL
LDL oksy LDL
Tkanki obwodowe
Mogą wchodzić w skład komórek piankowatych, które po rozpadzie
uwalniają
Enzymy proteolityczne LDL
Stężenie LDL wzrasta, gdy wzrasta produkcja VLDL – zaburzony wychwyt przez
wątrobę i tkanki obwodowe. Istnieją skrajne przypadki – rodzinna hipercholesterolemia –
występuje wtedy brak wychwytu LDL i powstają oxyLDL. Powstają wtedy komórki
piankowate, dochodzi do destabilizacji blaszki miażdżycowej. Zaburzenie to występuje z
częstotliwością 1/500 w postaci heterozygotycznej oraz 1/1000 w postaci homozygotycznej.
9
Podobny efekt występuje w niedoczynności tarczycy, kiedy brak TH receptory są
nieaktywne.
Efekt
żniwiarza – powyżej 80 r.ż. brak korelacji między stężeniem Ch a częstością
zgonów.
Niskie
stężenie LDL jest objawem raka, a nie jego przyczyną (bo niskie LDL koreluje
dodatnio ze wzrostem umieralności z powodu raka).
Badanie PROCAM (Europa) – im wyższe stężenie LDL tym większa umieralność
ogólna, za którą odpowiedzialne są zgony wieńcowe.
Metabolizm
HDL
Wątroba VLDL remnanty VLDL
LDL CETP
Tkanki obwodowe HDL
Dużo HDL hamuje białko CETP.
HDL przenosi Ch z tkanek obwodowych do wątroby. Leki blokujące CETP – nie
dochodzi do przenoszenia.
Brak jakiegokolwiek dobrego skutku z podniesienia stężenia HDL.
Nowości w metabolizmie HDL – białka ABC – zasada drzwi obrotowych – odbieranie
HDL. Jeśli HDL kontaktuje się z nimi (przez apoA1), wtedy komórka pozbawia się Ch
(receptor sulfonylo).
Kubinina – receptor apoA1 w nerkach – dzięki temu apoA1 podczas degradacji HDL
nie jest tracony z moczem. To samo białko (receptor), który znajduje się w jelicie krętym –
receptor dla witaminy B12.
HDL – normy europejskie – K<43mg%, M.<39mg%
- normy USA – K<35mg%, M.<35mg%
BADANIA FRAMINGHAM – wraz ze spadkiem stężenia HDL wzrasta ryzyko zgonu
wieńcowego. Wartości graniczne to <45mg% u M. i K.
BADANIA PROCAM – wraz ze spadkiem stężenia HDL wzrasta umieralność ogólna
za co odpowiedzialne są zgony wieńcowe.
MLF – wieloczynnikowe ryzyko wystąpienia CHD. Jeśli 10 z MLF to przy niskich
HDL większa umieralność niż przy 1 z MLF. Dlatego należy patrzeć na czynniki ryzyka.
U osób z obniżonym stężeniem HDL i równocześnie obniżonym tCh nie istnieje tak
duże ryzyko jak u osób z równoczesnym podwyższonym tCh.
Obniżone HDL i LDL < ryzyko niż obniżone HDL i wysokie LDL, dlatego lepiej
obniżać LDL niż podwyższać HDL.
10
Wskaźnik aterogenności
TCh/HDL <5, jeśli wyższe – wzrost ryzyka
(TCh-HDL)/LDL <4, tCh-HDL~LDL, dlatego im wyższy LDL/HDL tym większa liczba
zgonów i za nie są odpowiedzialne zgony pochodzenia wieńcowego. (PROCAM, Minister
Heart Study).
HDL
• im wyższy tym mniejsze przywieranie monocytów do powierzchni śródbłonka, a co za
tym idzie mniej komórek piankowatych
• w wątrobie znajduje się białko enzymatyczne paroksonaza, jest ona wbudowywana do
HDL. Hamuje ono oksydacje LDL. Im wyższe jest jego stężenie tym mniej powstaje
oxyLDL, i mniej karmy dla makrofagów. Przy danym stężeniu HDL mogą być różne
wartości tego enzymu (bo inne geny).Bada się polimorfizm kodowania paraoxynazy.
PROCAM – kamień milowy w roli TG. Przedtem uważano, iż wzrost stężenia TG jest
czynnikiem ryzyka tylko u cukrzyków, teraz uważa się, iż jest to ryzyko populacyjne. Wzrost
stężenia TG niesie za sobą wzrost umieralności ogólnej (głównie zgony wieńcowe), jednak
jeśli stężenie to przekroczy 2000mg%, zgony związane są z OZT. TG jest to heterogenna
grupa związków. VLDL i chylomikrony tworzą tzw. duże TG, których rola jest mała.
Remnanty VLDL i remnanty chylomikronów tworzą tzw. małe TG, które są wysoce
aterogenne. W związku z tym podstawowe znaczenie ma dieta pacjenta.
Chorzy na cukrzycę
U pacjentów tych rzadko dochodzi do podwyższonego stężenia tCh. Dominujące
wyniki to – obniżenie HDL, podwyższone TG, natomiast LDL w większości są w stężeniach
jak w populacji generalnej. Dlatego tutaj też badamy cały lipidogram. Gdy cukrzyca jest
niewyrównana tym większe stężenie TG i mniejsze HDL. 2 razy częściej u cukrzyków niż w
populacji generalnej TG>200mg%, HDL<35mg%.
Triada
lipidowa
Wysokie TG
Małe gęste LDL niskie HDL
Główny typ cukrzycy u 80-90% dorosłych – typ II.
Insulinooporność
Hiperinsulinemia powoduje wzrost produkcji apoB100 w komórkach wątroby,
powstają małe gęste LDL (bardzo dużo białka, mało Ch). Gdyż posiadają bardzo dużo białka,
trudniej wiążą się z receptorami, dłużej pozostają w krążeniu częściej ulegając modyfikacjom,
dzięki czemu łatwiej przylegają do ściany naczyń – wysoce aterogenne. Dodatkową ich wada
jest to, iż nie da się ich oznaczyć rutynowo. Wtedy można oznaczyć apoB100 (ELISA,
metody immunologiczne).
Małe gęste LDL
• Małe powinowactwo do receptorów
• Długi okres półtrwania
• Intensywne naciekanie ściany naczyń
• Silne wiązanie z proteoglikanami
11
• Przyspieszona oksydacja
• Intensywny wychwyt przez makrofagi
Oznaczanie małych gęstych LDL
Pośrednio oznaczamy poprzez obliczanie stosunku apoB100:LDL. Gdy jest on wysoki
oznacza to, że jest podwyższone stężenie małych gęstych LDL.
Bezpośrednio – wykonuje się NMR lipoprotein (MNR lipo Profile). Oznaczamy w ten
sposób nie stężenie LDL, ale stężenie cząsteczek LDL – poszczególnych modułów (7
podtypów).Na przykład 1100-1399 – duże lekkie A. Sens badania opiera się na tym, iż
przy tym samym stężeniu Ch, jest więcej cząsteczek LDL, ponieważ są one małe i więcej
ich może się zmieścić.
Panel ryzyka polega na uwzględnieniu, czy jest wzrost stężenia cząsteczek LDL oraz czy jest
aterogenna triada lipidowa.
Cele prewencji
1.) Pierwotnej
Zmniejszenie progresji miażdżycy tętnic i uzyskanie regresji
Zmniejszenie zmian ksantomatycznych
Profilaktyka OZT
Zmniejszenie zapadalności na CHD
Zmniejszenie umieralności ogólnej
2.) Wtórna
Zmniejszenie zapadalności na zawał serca
Zmniejszenie ilości zabiegów rewaskularyzacji
Leczenie hiperlipidemii
1.) Usunięcie przyczyny (hiperlipidemia wtórna)
2.) Dieta, modyfikacja stylu życia
3.) Farmakoterapia
4.) W zaburzeniach pierwotnych
- plazmafereza LDL (HELP system – przygotowanie do przeszczepu wątroby – stosuje się w
pierwotnej hipercholesterolemii o odmianie homozygotycznej). W Polsce 2-Warszawa, 1-
Kraków.
- przeszczep wątroby
- terapia
genowa
Wybór leków hipolipemizujących
• Mechanizm działania
• Skuteczność kliniczna
• Zalecenia Organizacji i Towarzystw Międzynarodowych
Leki
1.) Inhibitory reduktazy HMG-CoA (statyny), nie wolno ich stosować u dzieci
2.) Żywice jonowymienne – wolno u dzieci i u pacjentów z czystą hipercholesterolemią
3.) Fibraty
4.) Kwas nikotynowy i ACIPIMOX
5.) PROBUCOL (nie stosowany)
6.) Inhibitory ACAT – w fazie badań
7.) ANSAMYCYNA – w fazie badań
12
Adn.1.,4.)
Żywice jonowymienne i kwas nikotynowy są rzadko stosowane ze względu na dużą
ilość efektów ubocznych i często są one odstawiane w ciągu 1 roku.
Adn.1.)
Generacje
1.) Lowastatyna, Prowastatyna
2.) Simwastatyna
3.) Fluwostatyna
4.) Ceriwastatyna, Atorwastatyna
Najlepsza jest 4 generacja, cechująca się hydrofilnością, lipofilne dają koszmary
senne. Lepiej także stosować krótko działające -–Fluwostatyna, Ceriwastatyna.
Mechanizm działania
Szlak mewalonianowy
Acetylo-CoA
HMG-CoA
Reduktaza HMG-CoA statyny
Mewalonian
Ubichinon gernazylo formezylowane białka
Farnezyl
Dolichol cholesterol
• Hamują endogenną syntezę cholesterolu całkowitego w wątrobie
• Lepszy wychwyt LDL i remnantów VLDL (poprzez produkcję większej ilości receptorów
na powierzchni komórek wątrobowych)
• Spadek stężenia LDL z reguły o 30-35%
• Spadek stężenia VLDL nawet o 60%, ale rutynowo o 30%
• Obniżenie TG, ponieważ hamownie syntezy VLDL w wątrobie
• Rośnie synteza HDL
• Fluwostatyna rozpuszcza się w LDL i są one mniej podatne na oksydację, co powoduje
spadek ilości komórek piankowatych, a co z kolei powoduje spadek enzymów
proteolitycznych uwalnianych z tychże komórek
Efekty lecznicze
• Spadek stężenia tCh
• Spadek LDL
• Spadek TG
• Wzrost HDL przez wzrost syntezy nowych cząsteczek HDL (o kilka do kilkanaście %)
13
Statyny przez swój punkt uchwytu – głównie komórki wątroby
• Spadek geranylo i formylowanych białek
• Spadek ubichinonu
• Spadek dolicholu
Statyny a komórki mięśni gładkich
Statyna
wchodząc do komórek mięśni gładkich hamuje syntezę ubichinonu (blok
energii bo jest on składnikiem łańcucha oddechowego), gernazylu, fernazylu (działanie
antyproliferacyjne w leczeniu nowotworów), dolicholu (spadek wrażliwości na bodźce
wysyłane przez makrofagi). Wszystkie te działania powodują spadek proliferacji mięśni
gładkich w blaszce miażdżycowej.
Cerwistatyna, Fluwostatyna, Prawostatyna – działania antyproliferacyjne na mięśnie
gładkie.
Statyny a płytki krwi
Hamują one agregację płytek krwi i syntezę TXA (wyjątek Prawostatyna).
Statyny a glejaki
Hamowanie rozrostu nowotworu (wzmacniają działanie leków
przeciwnowotworowych). Spadek umieralności o około 30%.
Statyny a ciąża
Wnikają do komórek embrionalnych powodując poronienie.
Pozalipidowe
działanie statyn
• Plejotropowe
• Hamują proliferację mięśni gładkich
• Hamują naciek makrofagów w ścianie tętnic
• Stabilizują blaszkę miażdżycową
• Ochronny wpływ na śródbłonek (wzrost NO, prostacyklin, spadek endotelin)
• Modulacja reaktywności miocytów gładkich
• Hamowanie syntezy wolnych rodników
• Hamowanie adhezji i agregacji płytek krwi
• Hamowanie ekspresji czynników tkankowych
• Obniżenie stężenia LPL (a)
Leczenie hipolipemizujące osób normolipemicznych – aby ujawniły się pozalipidowe
działanie statyn. ABS – A- kwas acetylosalicylowy, B- β blokery, S- statyny. Leczenie po
zawale, mimo braku podwyższenia stężenia Ch. W Polsce to nie działa.
Adn.3.)
Fibraty
• Klofibrat (wycofany)
• Bezafibrat
• Fenofibrat
• Etafibrat
• Ciprofibrat
• Gemfibrozil
14
Mechanizm działania
• Bardzo silnie hamują syntezę TG w wątrobie co powoduje spadek VLDL
• Na LDL działają różnie – podwyższają ich stężenie, gdy wyjściowe VLDL jest bardzo
wysokie, gdy nieduże wyjściowe stężenie TG – brak lub obniżenie LDL
• Wzrost LPL (lipazy lipoproteinowej) – wtedy dochodzi do degradacji VLDL
• Wzrost HDL poprzez zahamowanie CETP, ale nie HDL w pełni funkcjonalnych
• Spadek β LDL (mechanizm zahamowania syntezy apoB100)
• Spadek ApoB 100 u pacjentów z cukrzycą i insulinoopornością
• Gwałtowne obniżenie TG – małe dawki o 30-35%, duże nawet o 60%
Działanie ogólne
• Spadek stężenia TG
• Spadek stężenia tCh
• Wzrost stężenia HDL
• Wzrost lub spadek stężenia LDL
Działanie pozalipidowe – spadek stężenia
• Fibrynogenu
• Czynnika 7
• PAI-1
• Lp(a)
• CRP (działanie przeciwzapalne)
• TNF-α (działanie przeciwzapalne)
• IL-6 (działanie przeciwzapalne)
Fenofibraty pozbawione są działania antyproliferacyjnego, podając je doustnie przy
przejściu przez wątrobę powstaje kwas fenofibrynowy, który to właśnie pozbawiony jest
działania antyproliferacyjnego. Jedynie , gdyby podać je i.v.
Działania uboczne fibratów – wzrost litogenności żółci.
TYLKO STATYNY MAJĄ DZIAŁANIE ANTYPROLIFERACYJNE NA MIĘŚNIE
GŁADKIE !!!!! (wspomagają je IKA, antagoniści wapnia)
Wybór leku – skuteczność kliniczna (EBM)
Wartość statystyczna uzyskanych wyników
Badania randomizowane kontrolne, albo metaanaliza. Aby porównać skuteczność
działania statyn i fibratów – metaanaliza (wyciąganie wniosków z 10 ślepych prób),
podwójnie ślepa próba. Metaanaliza – badania wirtualne – wyniki kilku badań podobnych
analizowanych przez komputer.
Punkty końcowe (end points)
Uzyskuje się punkty końcowe – na przykład twardy – o ile zmniejszyła się
umieralność ogólna. Jeszcze miększy choć twardy – spadek umieralności sercowo-
naczyniowej. Jeszcze miększy – zapadalność na incydenty wieńcowe; zabiegi
rewaskularyzacji. Najbardziej miękki – obniżenie LDL.
Ryzyko względne (RR)
Musi być pokazane o ile zmniejsza się ryzyko. Lek powinien być lepszy od placebo o
50%. Gorszy od plecebo – leki proarytmiczne. Placebo – leki przeciwarytmiczne.
Liczba pacjentów, która wymaga leczenia dla zapobieżenia jednemu powikłaniu (NNT –
number needed to treat).
15
Znamienność statystyczna różnic
4S (Simwastatyna), prewencja wtórna pacjentów z wysokim LDL. NNT 13 – trzeba leczyć 13
pacjentów, aby zmniejszyć ryzyko o 1.
-25% tCh
-35% LDL
+8 HDL
-10TG
-30% umieralności ogólnej
-20% z powodu nowotworu
AF CAPS (air force), Tex Caps (Lowastatyna)
-18% tCh
-25% LDL
-40% 1-ego zawału serca
-36% 1-ego incydentu wieńcowego
80 NNT
Helsinki Hard Study
+4% LDL
+7,5% HDL
-24,5% TG
-10% umieralność
Bip study
+15% HDL, bez efektu
Metaanaliza
99
59
badań 300 000 pacjentów.
Statyny 0,69 – redukcja 31%
Fibraty 0.89
Żywice 0,71
Niacyna 0,95
Dieta 0,97
Zalecenia American Heart Association
• Gdy wzrastają TG do 200 (400?)mg%, wtedy lekiem z międzynarodowego wyboru są
statyny
• Zarówno w prewencji pierwotnej jak i wtórnej – statyny
• Wszystko statyny
• FDA – nie stosować
W Polsce stosowany głównie fenofibrat, ponieważ statyny są droższe. W pierwszym
projekcie przy hiper TG – fibraty.
Statyny są zalecane, gdyż
• Najwyższa skuteczność w obniżaniu LDL
• Plejotropowe nielipidowe działanie
• Udowodniony spadek umieralności ogólnej i sercowo-naczyniowej
• Zalecane przez najważniejsze organizacje
16
• Wygodne w dawkowaniu – 1/dzień, a potem na noc – rytm dobowy
• Bezpieczne w stosowaniu
• Powikłania – miopatia –1-2‰ przypadków
• Najrzadziej odstawiane przez pacjentów, a leczenie musi być do końca życia
• Uzasadnione farmakoekonomicznie – koszty niższe od uzyskanych efektów
Priorytety terapii hipolipemicznej – na pierwszym miejscu CHD lub inne jej
manifestacje.
Monitorowanie
statyn
• Stężenie LDL (20% w ciągu 10 lat)
• Skuteczność – w 1 miesiącu, potem w pierwszym kwartale
- tCh
- HDL
- TG
- LDL
• Bezpieczeństwo
- CPK –po miesiącu i 1-szym kwartale, 10 razy norma przekroczona – odstawić. Miopatia –
na początku bezobjawowo, wzrost CPK. Trzeba być ostrożnym przy stosowaniu u
pacjentów ciężko pracujących i uprawiających sport, odstawić siłownię. Mogą rozwinąć
się bóle mięśniowe – druga forma miopatii. Trzecia forma to rabdomiopatia- ostra
niezapalna niewydolność nerek i zgon.
- Transaminazy – odstawić, gdy norma przekroczona jest 3-krotnie
Inne nielipidowe czynniki ryzyka
Lipoproteina (a)
Czynniki prooksydacyjne
Homocysteina
Leczenie hipercholesterolemii
• Do końca życia, ale trzeba powiedzieć pacjentowi, że zobaczymy za rok, a potem jeszcze
rok, po dwóch latach (przy statynach 1 rok) widać efekty kliniczne.
• Gdy odstawić po 5 latach – powrót do stanu 0
Wdrożenie leczenia
• Od razu po rozpoznaniu
• U młodszego pacjenta bardziej spada ryzyko
• Nie wdrażamy u pacjentów powyżej 80r.ż. (u 75 tak)
Zespół niskiego HDL
Czy defekt pierwotny czy objaw. Objaw zespołu metabolicznego (hiperinsulinemii,
triada lipidowa).
1998, Fibrate Consensus Group – leki z wyboru na niskie HDL, 1999 BIP – obalił.
Obecnie lekiem z wyboru są statyny, działają one antyproliferacyjnie (insulina działa
proliferacyjnie), wzrost stężenia receptorów (spadek LDL, spadek małych gęstych LDL, bo
spadek apoB100).
17
Lipoproteina
(a)
Działa proaterogennie. Nie u każdego oznaczamy. Zaleca się oznaczać :
U kobiet po 50r.ż., bo w wyniku menopauzy wzrasta jej stężenie, obniżać należy przez
zastosowanie hormonalnej terapii zastępczej
Pacjenci po zawale serca (PROCAM – wzrost Lp(a) w grupie kontrolnej o 15%, po
zawale o 36%)
Osoby z podwyższonym LDL
Homocysteina
• Hyperhomocysteinemia
- wrodzona
- niedobór
witamin
- przewlekła niewydolność nerek
- niewydolność nerek u osób starszych
• Mechanizm proaterogenny
- główny powód zakrzepicy
- tiolacja
apoB100
- wzrost ekspresji czynników tkankowych
- choroba
wieńcowa w młodym wieku
- krzywa proporcjonalnego przeżycia – krzywa Kaplana –Meyera, powyżej 9 mmol/l
• Oznaczanie
- zakrzepica
- przebyty
zawał
Homocysteina najbardziej obniża kwas foliowy, witaminę B6, witamina B12.
Oznaczanie czynników ryzyka miażdżycy
Markery stresu oksydacyjnego
Markery dysfunkcji śródbłonka
Rozpuszczalne formy molekuł adhezyjnych
Czynnik von Willebrandta
Asymetryczna dimetyloarginina (ADMA) – doprowadza do dysfunkcji syntazy NO,
oznaczana w cukrzycy
Markery stanu zapalnego – m.in. bialko C reaktywnego
Markery swoiste dla cukrzycy AGE (advanced glycation endproducts)
Afereza LDL (met.DALI)
• 80 ml krwi/kg m.c. jednorazowo
• Cytrynian – krótsza
• Oznaczanie Ca, K, Na
• Zapobieganie hipokalcemii – przepłukiwanie roztworami wapnia
• Skuteczność po czterech zabiegach
• Obniżenie Ch u chorych z CHD, gdy zawodzą inne metody obniżenia LDL
• Nie zmienia poziomu HDL
PROCAM – tylko mężczyźni 40-65
Zamiast amplifikować dawkę leku, wprowadzić politerapię – na przykład dwukrotna
dawka statyny – spadek większy zaledwie o 6% od dawki jednorazowej.
18
Pierwszy lek – statyna, do tego żywica (colestypol) przy drugiej wizycie.
Rodzinna hipercholesterolemia – dziecko – plazmafereza LDL i przygotowanie do
terapii genowej.
Kobiety po menopauzie – spada liczba receptorów przy spadku estrogenów, co
powoduje wzrost remnantow VLDL (pre beta i beta). Włączyć HTZ transdermalną, jako
wyłączenie przyczyny wtórnej. Estradiol per os – przy pierwszym przejściu wzrost VLDL.
Per os można tylko w czystej hipercholesterolemii, gdy wzrost TG tylko transdermalnie.
Monitoring wtedy nie przez LDL (bo niski), tylko przez TG i tCh.
Test
wysiłkowy u kobiet po 50 nie jest znamienny diagnostycznie (może być FD lub
FU).
Jeśli nie można HTZ to włączamy statyny (w USA – Specific Estrogen Receptor
Modulation – SERM-y).
Raloxifen
działa na kości i naczynia tylko jak estrogen.
TCh 5,2 mmol/l
TG 2,3 mmol/l
HDL 5,5 mmol/l
Glukoza 5 mmol/l
AC-inhibitory
zapobiegają nefropatii, także w cukrzycy.
Glinidy, pochodne metyloglinidów, nowa generacja. Repoglinid – stary lek. Powoduje
rzut insuliny w pierwszym piku, pulsacyjnie po jedzeniu.
TG w niedoczynności tarczycy nie są podwyższone (z tego powodu). Z
niedoczynnością tarczycy łączy się hyperhomocysteinemia.
JEŚLI JEST DUŻE RYZYKO NATYCHMIAST WŁĄCZAMY LECZENIE, JEŚLI
NIE – NAJPIERW DIAGNOSTYKA, NIE RECEPTA PRZY PIERWSZEJ WIZYCIE !!!
19
BIOCHEMIA
MARKERY NOWOTWOROWE
Złośliwe choroby nowotworowe
• Około 200 jednostek chorobowych
• Druga pozycja w śmiertelności (na pierwszym miejscu choroby układu sercowo-
naczyniowego
• Wzrasta tendencja do powstawania nowotworów, ważne staje się ich wczesne
wykrywanie
• Wzrost zapadalności
• Wzrost umieralności
• Wzrost wykrywalności
Wykrywanie nowotworów
1.) Wywiad – wcześniejsze rozpoznanie da tylko, gdy mamy do czynienia z nowotworem
hormonalnie czynnym (na przykład pheochromocytoma)
2.) Badanie fizykalne – j.w.
3.) Badania obrazujące
- Rtg
- TK
- USG
- NMR
4.) Badania laboratoryjne
Badania obrazujące
• Średnica > lub równa 1 cm ( może być nieuchwytna, TK – warstwa co 1 cm, mała zmiana
często trudna do odróżnienia na przykład od naczynia)
• Masa > lub równa 1 g
• Liczba komórek > lub równa 1 miliard – już poza kontrolą
Rozpoznanie
• Badania biochemiczne - ograniczenia
• Histopatologiczne i cytologiczne
• Badania cytochemiczne – określenie rodzaju komórek (w szpiku – różne białka –
limfoblastyczne i nielimfoblastyczne)
Rozpoznanie uzupełniające
• Przeciwciała monoklonalne przeciw określonym antygenom nowotworu. Ilość świecenia
– określenie typu nowotworu, liczby komórek, stosowane na przykład w raku sutka
• Markery nowotworowe, wykrycie – stwierdzenie, że jest, rozpoznanie – określenie typu i
lokalizacji, ograniczenia
Odpowiedź organizmu
1.) Swoiste parametry laboratoryjne
- markery
nowotworowe
20
2.) Nieswoiste parametry laboratoryjne
a)
- występują też w innych nowotworach
- wzrost OB.- najczęstsze
- niedokrwistość lub wzrost stężenia krwinek - najczęstsze
- morfologia
- proteinogram - hipoproteinemia
- hiperkalcemia ( w nowotworach i chorobach kości)
- hipokaliemia,
najczęściej spowodowana przez hiperkalcemię, która upośledza wychwyt
potasu w nerkach
b) zmiany występujące w nowotworach hormonalnie czynnych
- efekt nadmiaru hormonów (np. ACTH, kortyzol) – hipokaliemia, - hipernatremia, -
zasadowica
- stężenie hormonów – np. kalcytoniny w raku rdzeniastym tarczcy
- metabolity hormonów (w DZM)
kwas 3 – metoksy 4 – hydroksymigdałowy (MHM, kwas wanilinomigdałowy VMA),
katecholaminy – pheochromocytoma, rak rdzeniasty tarczycy, ektopowo rak
owsianokomórkowy płuc
kwas homowanilinowy (HVA), dopamina
kwas 5 hydroksyindolooctowy – serotonina (rdzeniak, srebrzak, carcinoid)
c) stężenie glukozy
- hipoglikemia
wyspiak trzustki (insulinoma, wzrost wydzielania insuliny)
guzy mezenchymalne
- hiperglikemia
glucagonoma
- normoglikemia
NSILAP (nonsupresible insuline like activit protein), białko o aktywności podobnej do
insuliny nie reagujące z przeciwciałami przeciwko insulinie, fibrosarcoma, neurofibroma
d) przeciwciała monoklonalne – szpiczak
Enzymy jako markery nowotworowe
• Fosfataza zasadowa – podobna do izoenzymu łożyskowego
• Fosfataz kwaśna - sterczowy
• Dehydrogenaza mleczanowa
- wzrost LDH3, mniejszy LDH2 we krwi m.in. w białaczkach
- torbiel nerki w USG jeśli narasta może maskować nowotwór nerki, trzeba wykonać
punkcję nerki i określić aktywność LDH w płynie – jeśli jest niska, jest to tylko torbiel,
jeśli wysoka – nowotwór (30%)
Badania genetyczne
• chromosom Philadelphia
- translokacja 9:22, MLC
• translokacja 8(2,14 lub 22)
- dziecięca postać chłoniaka B-komórkowego
Markery nowotworowe
• Wielkocząsteczkowe substancje
• Wytwarzane przez komórki nowotworowe
• Obecne na ich powierzchni (do badań cytologicznych) lub uwalniane do krwiobiegu
21
Markery
Podział I - stary
1.) Pośrednie – zmiany w różnych chorobach nie tylko w nowotworach, są to niespecyficzne
parametry biochemiczne
2.) Bezpośrednie – zmiany tylko w nowotworach
Podział II
1.) Komórkowe – receptory dla czynników wzrostu, białka błonowe, marker ulegający
ekspresji na powierzchni komórki nowotworowej (bioptat, rozmaz krwi, szpiku)
2.) Krążące – uwolnione z komórki , w formie rozpuszczalnej
a) swoiste tylko dla nowotworu – neoantygeny
b) antygeny towarzyszące nowotworom
- antygeny
płodowo-zarodkowe (CEA, AFP)
- antygeny
łożyskowe (HCG, białko ciążowe SP-1, FA łożyskowo-podobna) – fosforylacja
alkaliczna
- antygeny wykrywane przez przeciwciała monoklonalne (Ca 19.9, Ca 50, Ca 15.3)
- inne (PSA, NSE, tPA)
Markery a etapy rozwoju komórki
• Proliferacji, na przykład TPS – swoisty tkankowy antygen polipeptydowy - rozrost
- synteza w końcowej fazie syntezy DNA
- stężenie we krwi koreluje z intensywnością podziałów
• Różnicowania – masa, dojrzałość guza
- CEA, AFP, HCG, Ca 125, Ca 19.9
- stężenie zależy od masy guza
• Obumierania
- TPA, CYFRA 21-1
- uwalniane
są, gdy dochodzi do nekrozy
Cechy badań wykrywających nowotwory
1.) Analityczne
- czułość
- swoistość
2.) Diagnostyczne
- czułość
- swoistość
- dodatnia
wartość predykcyjna
- ujemna
wartość predykcyjna
- krzywa ROC (receiver operating characteristic)
czułość – zdolność wykrycia rzeczywiście chorych, PD
PD/(PD+FU)
Rośnie wraz z zaawansowaniem nowotworu.
Rośnie, gdy obniżany punkt odcięcia (wartość dyskryminacyjna)
Gdy obniżamy punkt odcięcia rośnie wartość dyskryminacyjna testu.
swoistość – zdolność do wykrywania rzeczywiście zdrowych, PU
PU/(PU+FD)
Wzrasta, gdy wzrasta punkt odcięcia.
22
dodatnia wartość predykcyjna
PD/(PD+FD)
ujemna wartość predykcyjna
PU/(PU+FU)
krzywa ROC – zależność czułości względem swoistości, pole pod krzywą im większe tym
lepsze. Test idealny, gdy pole to >1, jeśli 0,5 – test bez wartości diagnostycznej.
PSA – swoisty antygen sterczowy
1970 – Hara i wsp., 1979 – Wang i wsp.
Glikoproteina, 237
W osoczu
- 10%
postać wolna
- 90%
związana z α-1 antytrypsyną i α-2 makroglobuliną (oba białka to białka ostrej fazy,
są one inhibitorami proteaz)
Produkowana w nabłonku kanalików stercza (też w gruczole sutkowym, śliniankach)
Funkcja
- upłynnia nasienie (proteolityczna degradacja białek formujących żel)
- regulacja wzrostu komórek (rozkład proteolityczny białka wiążącego IGF, IGFBP)
- wolny PSA może być efektywnym enzymem lub zymogenem
- rola w nasieniu dodatnia, rola w osoczu -ujemna
Zakres referencyjny 0,0-4,0 ng/ml
Przyczyny
- wysokiego wzrostu stężenia – rak stercza
- mierny wzrost stężenia – gruczolak stercza (podział umowny, bo przy nowotworze
złośliwym wzrost może być umiarkowany.
Indeks PSA (PSAD, gęstość PSA) – stosunek stężenia PSA do całkowitej objętości
stercza (USG per rectum)
- wyższa czułość diagnostyczna (70-80%)
- identyczna
swoistość
Wolny/całkowity PSA
- wyższy w gruczolaku niż w raku stercza
- wskazania do oznaczania tego indeksu – gdy całkowity między 4,0-10,0 ng/ml
AFP – α fetoproteina (białko płodowe α)
1956 Bergstand, 1963 Abler, 1964 Tatarinow
Glikoproteina, dimer, 70 kD
3-7 epitopów
30% homologia z albuminami
Między albuminami a α-1 proteinami w elektroforezie
Funkcja fizjologiczna nieznana – transport KT, rola immunosupresyjna
Produkcja w
- wątrobie płodu
- komórkach
pęcherzyka żółtkowego
- przewodzie pokarmowym płodu
Okres półtrwania 5 dni
Występowanie
- krew
płodu
- płyn owodniowy
- krew
matki
Zakres referencyjny K 0,0-10,0 ng/ml, M. 0,0-12,5 ng/ml; ng/ml x 0,83= IU/ml
23
Przyczyny wzrostu stężenia
- znaczne – pierwotny rak wątroby, - niektóre nowotwory zarodkowe jądra i jajnika
- mierne – marskość wątroby, - żółtaczka, - zapalenie wątroby
- ciąża – maksymalne stężenie w 32Hbd
CEA – antygen karcinoembrionalny
1965 Gold, Friedman
Glikoproteina
Beta globulina
Półokres rozpadu 2-8 dni
Fizjologiczna produkcja
- przewód pokarmowy – trzustka płodu, po narodzinach produkcja ulega znacznemu
zmniejszeniu
- potem
wątroba, jelito, trzustka dorosłych – śladowa ilość
Zakres referencyjny – niepalący 0,0-3,2 ng/ml, palacze 0,0-5,8 ng/ml
Przyczyny wzrostu stężenia
- wysokie- rak jelita grubego (inne jako ciekawostka, na przykład dla żołądka brak
markerów, inne narządy mogą lecz nie muszą wydzielać CEA), - odbytnicy, - odbytu
- rzadziej – rak żołądka, - trzustki, - gruczolak, - rak płuc
- miernego – ciąża, - marskość wątroby, - zapalenie wątroby, - jelit, - płuc
Czułość wykrycia raka jelita grubego późna – u palaczy do 30%, u niepalących – powyżej
80%
Były to trzy najważniejsze markery, których normy obowiązują, pozostałe mają mniejszą
przydatność i są rzadziej oznaczane.
CA 19.9 – antygen towarzyszący nowotworom przewodu pokarmowego
Glikolipid, m.cz.36
Hapten grupy krwi Lewisa (nie ma go w grupie Lewisa ab)
Półokres trwania 7 godzin
Fizjologiczna produkcja
- nabłonek przewodu pokarmowego płodu
- u
dorosłego – gruczoły ślinowe, - oskrzela, - trzustka, - drogi żółciowe, - nabłonek
przewodu pokarmowego – ilości śladowe
Zakres referencyjny 0,0-37,0 mU/ml
Wzrost stężenia
- wysoki – nowotwory przewodu pokarmowego, - trzustki, - inne
- mierny – zapalenie trzustki, - wątroby, - dróg żółciowych, - marskość wątroby
CA 15.3 – antygen raka sutka
Mucynopodobna glikoproteina o zmiennym składzie
Nabłonek wydzielający przewodu sutkowego
Stężenie 0,0-30,0/40,0 mU/ml, sprawdzić normę dla laboratorium, gdyż istnieją różne
epitopy i różne dla nich zestawy, ponadto wartości zależą od płci , palenia papierosów.
Wzrost stężenia
- wysoki – zaawansowany rak sutka, - inne nowotwory (bardzo rzadko)
- mierny – ciąża, - niezłośliwe nowotwory sutka(kazuistyka)
24
CA 125 – antygen raka jajnika
Glikoproteina
Półokres trwania 2-6 dni
Produkcja
- nabłonek jam ciała, - dróg oddechowych płodu i dorosłych
- nabłonek jajowodu, trzonu i szyjki macicy
Stężenie 0,0-35,0 mU/ml lub 0,0-65,0 mU/ml
Wzrost stężenia
- wysoki – rak jajnika
- mierny – ciąża, - menstruacja, -endometrioza, - nienowotworowe choroby układy
rodnego, - marskość wątroby, - zapalenie trzustki
CA 72.4 – mucynopodobny antygen towarzyszący nowotworom
Glikoproteina
Stężenie 0,0-3,0 UI/ml
Wzrost stężenia
- nowotwory
żołądka , - rak jajnika, - niedrobnokomórkowy rak płuc (może być wzrost, ale
nie musi)
SCC – antygen ca planoepitheliale
Glikoproteina
Półokres trwania 20minut
Produkowany w dojrzałych komórkach płaskonabłonkowych
Stężenie 0,0-2,0 ng/ml
Wzrost stężenia
- raki
płaskonabłonkowe - szyjki macicy, - płuc, - głowy, - szyi
- metabolizm i usuwanie markera wpływa na jego stężenie – choroby nerek (upośledzenie
wydalania), - zapalenie płuc, - uszkodzenie wątroby (może ale nie musi)
N SE – swoista enolaza neuronowa
Enzym, dimer, m.cz.87kD
Produkcja
- komórki
nerwowe
- komórki
neuroendokrynne
- erytrocyty
- trombocyty
Stężenie 0,0-20,0 ng/ml
Wzrost stężenia
- nowotwory
układu nerwowego
- nowotwory
APUD
- rak drobnokomórkowy płuc (marker nowotworowy – nazwa)
- nienowotworowe zapalenie płuc – przewlekła niewydolność oddechowa, - wstrząs
septyczny
CYFRA 21-1 – rozpuszczalny fragment cytokeratyny 19 (kwaśne białko filamentarne)
W wielu tkankach – niespecyficzny
Stężenie 0,0-3,3 ng/ml
Wzrost stężenia
- rak
płaskonabłonkowy płuc
- nowotwory
głowy i szyi
25
- rak
pęcherza moczowego (po raz pierwszy)
- niewydolność nerek (spadek wydalania)
- niezłośliwe choroby płuc i wątroby
HCG – gonadotropina kosmówkowa
Glikoproteina, m.cz. 38kD
2 podjednostki α i β
Półokres trwania 12-36 godzin
Stężenie 0,0-10,0 mU/ml
Wzrost stężenia
- ciąża (maxymalnie 10-12 tygodnia)
- nowotwory zarodkowe jądra i jajnika (utkanie trofoblastu)
- chorionepithelioma
- zaśniad groniasty
Zastosowanie markerów nowotworowych
1.) Wykrywanie nowotworów
2.) Rozpoznanie nowotworów
3.) Ocena zawansowania – słabo
4.) Monitorowanie leczenia – najważniejsze
Adn.1.)
Znaczenie niewielkie, ponieważ duża część nowotworów nie wydziela markerów.
Stężenie wzrasta zazwyczaj dopiero wtedy, gdy nowotwór jest już w bardzo zaawansowanej
fazie, a wtedy znamy już wywiad, badanie fizykalne, diagnozę.
Badania przesiewowe
• Wzrost stężenia, gdy nowotwór jest już zaawansowany
• Gdy jest niejasny pacjent
• Grupa podwyższonego ryzyka
Adn.2.) Badania pomocnicze
• Szukanie punktu wyjścia
• Nowotwory produkujące hormony
Adn.3.) Stężenie markera we krwi nie koreluje ze stopniem zaawansowania nowotworu – nie
jest przydatne
Adn.1.)
Badania przesiewowe w grupach wysokiego ryzyka
PSA
• M.>50
• M.>40 przy udokumentowanej predyspozycji rodzinnej
• Przed rozpoczęciem hormonalnej terapii zastępczej
• Nie zapominać o badaniu per rectum
26
AFP
• Zagrożenie rakiem wątroby
- osoby HBs Ag (+), (po przebyciu zakażenia HBV i HCV z długą antygenemią),
przetrwałe zapalenie wątroby
- osoby z marskością wątroby
HCG
• U K po usunięciu zaśniadu groniastego
Kalcytonina
• Oznaczanie u osób z zaawansowanym rakiem rdzeniastym tarczycy, u członków rodziny
– kalcytonina to nie jest stricte marker
Rozpoznawanie
• PSA, PAP (izoenzym sterczowej fosfatazy kwaśnej), stężenie lub aktywność
- rak stercza
• AFP
- pierwotny rak wątroby
- nowotwory zarodkowe jądra i jajnika (+HCG)
• CA 125
- rak jajnika
• Kalcytonina
- rak rdzeniasty tarczycy
• Tyreoglobulina
- rak
zróżnicowany tarczycy
Kalcytonina i tyreoglobulina nie spełniają warunków markerów nowotworowych.
Dotyczą leczenia radykalnego, nie paliatywnego.
Adn.4.) Monitorowanie leczenia
Wykrycie wznowy po zabiegu operacyjnym
Ocena skuteczności operacji, chemioterapii i radioterapii
Wysoka dodatnia wartość predykcyjna dla wznowy lub przerzutów
Wzrost stężenia markera nawet rok przed manifestacja kliniczną
Ocena skuteczności leczenia
Oznaczanie przed rozpoczęciem leczenia
Regularne oznaczanie po leczeniu (radykalnym nawet przez 5 lat, późne wznowy)
Uwzględnienie półokresu rozpadu (stężenie najwcześniej po 1 T1/2)
Inny punkt odcięcia – dokładna diagnostyka, gdy zaczyna się wzrost stężenia (mimo
ciągłej normy)
Oznaczać też markery, które były przed leczeniem podwyższone
Lokalizacja nowotworowa a markery – markery do monitorowania muszą być
charakterystyczne dla konkretnych nowotworów
♦ Rak jelita grubego
- CEA
- CEA + CA 19.9(?)
♦ Rak żołądka (brak markerów)
- CA 72.4, CA 19.9 (norma w 1/3 do1/4 przypadków raka żołądka)
27
- ewentualnie CA 72.4 + CEA
♦ Rak trzustki
- CA 19.9 (rośnie tylko w małym % raków)
♦ Rak wątroby pierwotny
- AFP (90% raków – z komórek miąższu wątroby – ca hepatocellulare, hepatoma)
- CA 19.9 (10% raków z komórek nabłonka przewodów wewnątrzwątrobowych dróg
żółciowych)
- AFP + CEA (różnicowanie pomiędzy pierwotnym nowotworem a przerzutem)
- Rak jelita grubego wykrywamy często po przerzucie w wątrobie – najczęstszy przerzut)
♦ Rak drobnokomórkowy płuca
- NSE 24-30%
♦ Rak płaskonabłonkowy płuca
- SCC 20-30%
♦ Gruczolakorak płuca
- CEA
♦ Niedrobnokomórkowy rak płuca
- CYFRA
21-1
- CEA?
- SCC?
♦ Nowotwory głowy i szyi
- SCC – z nabłonka płaskiego
- CEA – z nabłonka wydzielniczego, gruczołu
- SCC + CEA (postulat)
♦ Rak sutka
- CA 15.3 (zaawansowany)
- CA 15.3 + CEA
♦ Rak jajnika
- CA 125
♦ Rak szyjki macicy
- SCC
- SCC + CEA(postulat)
♦ Nowotwory zarodkowe jądra
- AFP (ca zarodkowe, potworniaki)
- HCG
(nasieniak)
- PLAP
(łożyskopodobna FA, alkaliczna, nasieniaki)
- CEA (potworniaki z elementami gruczołowymi, niewielki wzrost do 20ng/ml, rak jelita
grubego – 3 cyfrowe)
♦ Rak stercza
- PSA
28
BIOCHEMIA
BIOCHEMICZNE PODSTAWY TOKSYKOLOGII. DIAGNOSTYKA LABOLATORYJNA
OSTRYCH ZATRUĆ.
Podział toksykologii
Toksykologia teoretyczna
- ogólna
- szczegółowa
- doświadczalna
Toksykologia stosowana (praktyczna)
- kliniczna
- sądowo-lekarska
Analityka toksykologiczna
Zabezpieczenie analityczne badań doświadczalnych
Diagnostyka chemiczno-toksykologiczna zatruć
Kontrola higieniczno-toksykologiczna
Trucizna – substancja, która po wprowadzeniu do organizmu wywołuje w nim
uszkodzenia, zaburzenia czynności i fizjologiczną śmierć.
Działanie toksyczne substancji zależy od dawki.
Podział dawek
• Dawka graniczna/progowa (dosis minima, DM) – ilość substancji wywołująca uchwytne
skutki biologiczne
• Dawka lecznicza (dosis therapeutica, curativa, DC) – dawka substancji wykazująca
działanie lecznicze
• Dawka toksyczna (dosis toxica, DT) – dawka wywołująca objawy zatrucia i odwracalne
zaburzenia czynności organizmu
• Dawka śmiertelna (dosis letalis, DL) – dawka wywołująca nieodwracalne uszkodzenia i w
efekcie śmierć organizmu, trudna do oceny, zmienność osobnicza
DL 50 – dawka substancji toksycznej powodująca śmierć połowy zwierząt doświadczalnych,
zmienność międzygatunkowa – ostrożnie z ocenami
Wielkość dawki – masa substancji wprowadzonej do organizmu lub masa substancji
przypadająca na jednostkę masy ciała, zazwyczaj nie wiemy jaka była dawka przyjęta,
zmienność osobnicza, tolerancja
29
Podział zatruć ze względu na dynamikę
• Zatrucia ostre – leki, zatrucia jatrogenne
• Zatrucia podostre
• Zatrucia przewlekłe
W zatruciach ostrych i przewlekłych – substancje kumulujące się, głównie sole metali
ciężkich.
Podział zatruć ze względu na przyczynę
• Rozmyślne – samobójcze (65%) zwykle TLPD, mordercze – łatwe do wykrycia
• Przypadkowe (32%), około 1/3, głównie leki
• Zawodowe (3%) – ciężkie przypadki, głównie zbiorowe
Substancje najczęściej wywołujące ostre zatrucia
• Leki - najczęściej
• Tlenek węgla
• Alkohol etylowy
• Pestycydy
• Rozpuszczalniki
• Substancje żrące
• Glikol
• Muchomory - najrzadziej
• Metale ciężkie - najrzadziej
• Alkohol metylowy - najrzadziej
Czynniki warunkujące toksyczność trucizn
Rozpuszczalność
- związki toxyczne są zazwyczaj bardzo dobrze rozpuszczalne w wodzie lub lipidach
- nierozpuszczalne formy substancji toksycznych są nieszkodliwe (np.PbS, BaSO4) –
podawanie soli helatujących przy zatruciu metalami ciężkimi jako leczenie
Współczynnik podziału
- określa drogi wchłaniania się substancji, gdzie głównie gromadzi się toksyna, gdzie ją
oznaczać, np., gdy głownie w lipidach – nie ma sensu oznaczać lub bez znaczenia jest
oznaczanie w osoczu
Stopień dysocjacji w roztworze
- wartość pKa substancji toksycznych warunkuje ich przemieszczanie przez błony
biologiczne, wchłanianie i wydalanie z organizmu
- formy niezjonizowane łatwiej się wchłaniają – np. niezjonizowane w żołądku –
wchłonięcie przez śluzówkę. W większym pH – forma zjonizowana – zmniejszone
wchłanianie nawet z krwi. Analogicznie w moczu – zakwaszenie – zmniejszenie resorpcji,
a nawet wydzielania
Osocze pH 7,4
Bariera lipidowa
Sok żołądkowy pH 1-2
Niezdysocjowane kwasy,
zasady
Zdysocjowane sole
Niezdysocjowane
kwasy,
zasady
Zdysocjowane sole
30
Właściwości fizykochemiczne
- temperatura wrzenia i parowania
- wielkość cząsteczek – substancja przechodząca przez skórę, drogi oddechowe – np.
benzyna (strażacy, ratownicy, lekarze). Duże cząstki zatrzymują się na rzęskach dróg
oddechowych – zmniejszone wchłanianie w płucach
- budowa chemiczna związku
zdolność do wiązania się z określonymi receptorami
podstawniki zmieniające wartość stałej Km i zmieniające toksyczność (np. grupy COOH-
zmniejsza, SO3H – zielone, SH – zmniejsza, OH – żółte, CH3 – czerwone, NH2, NO2,
NO, CN-, F). Hydroksylowanie – wzrost toksyczności związku, a w alkoholu – mniejsza
toksyczność a duża liczba grup OH.
obecność wiązań nienasyconych (zwiększenie hydrofilności i reaktywności)
czynniki biologiczne (wiek, płeć, stan zdrowia i odżywienia)
Wiek – bardzo wrażliwe na zatrucia są noworodki i osoby w podeszłym wieku,
podstawową rolę odgrywa tu sprawność narządów (wątroba, nerka)
- brak lub niska aktywność enzymów: glukuronylotransferazy, transferazy glutationowej,
monooksydaz, dehydrogenazy alkoholowej, cytochromu P450, hydroksylazy aniliny, N-
demetylazy etylomorfiny
- brak wystarczającej ilości substratów: zredukowanej formy glutationu, glicyny
- jedyne sprawne drogi metaboliczne u noworodków to acetylacja i sprzęganie z
siarczanami
Płeć – u mężczyzn szybszy jest metabolizm ksenobiontyków
- szybsza hydroksylacja heksobarbitalu, N-demetylacja aminofenazonu, tworzenie
glukuronidów o-aminofenolu, sprzęganie pochodnych arylowych z kwasem
glukuronowym – procesy zależne od aktywności enzymów mikrosomalnych
indukowanych między innymi androgenami
- brak
różnic np. w hydroksylacji aniliny i oksazolaminy
Stan hormonalny organizmu
- hormony tarczycy – podwyższony poziom zwiększa aktywność mikrosomalnej
dehydrogenazy i reduktazy NADPH, zmniejsza zawartość cytochromu P450, zmniejsza
zdolność do acetylacji kwasu p-aminobenzoesowego
- hormony nadnerczy – ich niedobór zmniejsza aktywność wątrobowych enzymów
mikrosomalnych zmniejszając metabolizm np. aminofenazonu i heksobarbitalu
Czynniki genetyczne
- są odpowiedzialne za swoistą toksyczność substancji u danego osobnika np. brak lub
mutacja genu pseudocholinoesterazy, niedobór reduktazy glutationowej, niedobór
glukozo-6-fosfatazy – 2 ostatnie - nasilona hemoliza krwinek po np. sulfonamidach
- ostra porfiria polekowa – wzrost ekspresji u osób wrażliwych syntetazy δ-
aminolewulinianowej po stosowaniu barbituranów i pochodnych sulfonowych
31
Methemoglobinemia polekowa
Acetanilid fenylohydroksylamina
Reduktaza MetHb oxyHb
Kompleks nitrobenzen + Hb + H2O2
Hb
Reduktaza MetHb
MetHb
H2O
Niedokrwistość hemolityczna
Acetanilid to produkt metabolizmu NLPZ. Problem powstaje, gdy następuje spadek
stężenia reduktazy MetHb – kumulacja MetHb – hemoliza i toksyczne działanie uwalnianej
Hb.
Wrażliwość osobnicza
- Ciąża – dla płodu jest toksyczne także to co nie jest toksyczne dla dorosłego
- choroby
wątroby – zmniejszenie biotransformacji wszystkich ksenobiontyków
ostre wirusowe zapalenie wątroby
żółtaczka zastoinowa
marskość wątroby
nowotwory wątroby
- choroby nerek – retencja toksyn i ich metabolitów na skutek upośledzenia zdolności
wydzielniczych, dobór dawki leku w oparciu o klirens kreatyniny
Metabolizm toksyn w organizmie
Absorbcja Rozmieszczenie (dystrybucja) Wydalanie
Osocze Płyn tkankowy Komórki - nerki
- płuca T R RT - płuca
- skóra + T + - skóra
- przewód pokarmowy B T - przewód p.
TB
Kumulacja,
Biotransformacja
T-CP
TB – substancja związana z białkami osocza – neutralna. Hemodializa – gdy
substancja znajduje się w dużej części w stanie wolnym. Stosowanie związków
konkurujących z toksyna o związanie z białkami – wzrost toksyczności. Na przykład –
32
kompetycja o wiązanie z białkami – wypieranie bilirubiny – groźne dla noworodków –
kernictherus.
Wchłanianie trucizn
• Skóra
• Układ pokarmowy
• Przewód pokarmowy
• Inne
Wiązanie ksenobiontyków przez białka osocza
• Albuminy – odgrywają największą rolę ze względu na:
- duże powinowactwo
- nieswoistość wiązania
- duże stężenie w osoczu
Z albuminami wiążą się: barbiturany, salicylany, sulfonamidy, streptomycyna,
tetracykliny, imipramina.
• Alfa i beta lipoproteiny – wiążą głównie substancje silnie lipofilne takie polichlorowe
insektycydy
Ksenobiontyki wiążą się z białkami zazwyczaj w sposób odwracalny przy udziale
wiązań jonowych, wodorowych i sił van der Waalsa, z wyjątkiem związków
fosforoorganicznych i alkilujących wiążących się nieodwracalnie za pomocą wiązań
kowalencyjnych.
Kompetycja o miejsce wiązania na albuminach
• Substancje o charakterze kwaśnym (salicylany, sulfonamidy, witamina K) wypierają
bilirubinę zwiększając jej stężenie w osoczu
• Substancje silniej wiążące się z albuminami wypierają substancje wiążące się słabiej np.
- sulfonamidy
wypierają tolbutamid – śpiączka hipoglikemiczna
- fenylobutazon wypiera warfarynę – zwiększenie działania przeciwzakrzepowego
- salicylany i sulfonamidy wypierają metotreksat co może spowodować nasilenie działania
toksycznego
Wydalanie toksyn
• Wydalanie z moczem
- w ten sposób wydalane są substancje dobrze rozpuszczalne w wodzie, o małej masie
cząsteczkowej: leki, związki fosforoorganiczne, fluorki, metale ciężkie
- wchłanianie zwrotne ksenobiontyków zachodzi głównie w kanaliku dalszym
alkalizacja moczu sprzyja wydalaniu substancji kwaśnych – np. zmiana pH z 6,4 do 8,0
zwiększa 4-6 razy wydalanie kwasu salicylowego
zakwaszenie moczu sprzyja wydalaniu substancji zasadowych
- wydzielanie kanalikowe (transport ten nie jest w pełni wykształcony u wcześniaków i
niemowląt)
anionów: salicylany, fenylobutazon, sulfonamidy, dinitrofenol
kationów: chinina, dihydromorfina
Wydalane są tylko zjonizowane substancje – substancje zasadowe np.LSD,
amfetamina – zmiana pH z 6,4-8,0 zwiększa nawet o 100 razy wydalanie. Wiąże się to z tym,
że zmiana pH w złą stronę powoduje zatrzymanie wydalania.
33
• Wydalanie z żółcią
- głównie substancje o wyższej m.cz. (300-500)
- wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne, amitryptylina, morfina, chlorotiazyd,
strychnina, metale: mangan, organiczne połączenia rtęci, ołów, arsen
- część wydalonych w ten sposób substancji może być ponownie wchłonięta w jelitach –
można temu zapobiec stosując żywice
• Wydalanie przez płuca –głównie substancje lotne, trzeba wiedzieć, że w ten sposób
może też się substancja wchłonąć. Nie można zwiększyć wydalania. Uwaga dla lekarza –
może dojść do zatrucia wziewnego podczas udzielania pomocy.
Postępowanie przy udzielaniu pomocy
1.) Stabilizacja stanu pacjenta
- udrożnienie dróg oddechowych
- zapewnienie
wentylacji
- wydolność układu krążenia
- dokładny i częsty pomiar funkcji życiowych (temperatura, akcja serca, oddech, ciśnienie
2.) Trzeba zwrócić uwagę na zabezpieczenie personelu udzielającego pomocy – związki
fosforoorganiczne, insektycydy karbaminowe
3.) Postępowanie z pacjentem nieprzytomnym
- tlen
- 50%
dekstran
- naloxon – 2 mg lub 0,2-0,4 mg, jeśli nie istnieje wskazanie życiowe, ma on krótki
półokres trwania, dlatego należy często go podawać
- zatrucie alkoholowe – tiamina 100mg i.v. lub i.m.
4.) Pacjent z drgawkami
- diazepam i.v. lub per rectum
- TLPD – kwasica nasila ich kardiotoksyczność
- hipoglikemia – podać glukozę
- indukowane
teofiliną – zwykle wymaga znieczulenia ogólnego
- po
zażyciu substancji paraliżujących należy zrobić EEG
- izoniazyd – ustępuje tylko po podaniu pirydoksyny
5.) Temperatura
- hipotermia jest często wywoływana przez barbiturany
- hipertermia - po przedawkowaniu kokainy, amfetaminy – aspiryna, piracetam
6.) Utrzymanie prawidłowego ciśnienia i perfuzji tkanek przez wlewy krystaloidów, krwi,
substancji o działaniu presyjnym
Wykrywanie substancji wywołującej zatrucie
• W przypadku, kiedy pacjent jest przytomny – wywiad, rzadko można uzyskać przydatne
informacje
• Wywiad z rodziną i znajomymi zatrutego
- poprzednie
przedawkowania
- leki i chemikalia dostępne dla pacjenta
- przeszukanie domu, garażu w kierunku pojemników po toksycznych substancjach,
opakowania po lekach
• Kontakt z lekarzem prowadzącym pacjenta – jakie pacjent zażywał leki?
• Dokładne badanie fizykalne – daje najwięcej cennych informacji
- poszukiwanie
urazów
- badanie neurologiczne – poszukiwanie przyczyn nie związanych z zatruciem, ogniskowe
objawy neurologiczne związane np. z krwiakiem podtwardówkowym, zapalenie opon
34
- choroby metaboliczne i zaburzenia elektrolitowe
- poszukiwanie
śladów po wkłuciach
• Badanie fizykalne – zapach z ust
- owocowy – charakterystyczny dla ketonów i ketokwasów (zatrucie etanolem i
izopropanolem)
- benzyny
- czosnku – arszenik, związki fosforoorganiczne
- migdałów – cyjanki
- zepsutych jaj – disulfiram, siarkowodór
- kleju – pochodne toluenu
• Badania dodatkowe
- EKG – diagnostyka zatrucia lekami wywołującymi zaburzenia rytmu, TLPD
- zdjęcia przeglądowe klatki piersiowej – obrzęk płuc
- poziom
elektrolitów
- pH krwi – kwasica metaboliczna: salicylany, metanol, glikol etylenowy, tlenek węgla,
cyjanki, siarkowodór, toluen, wypicie kwasu
Diagnostykę w/w należy przeprowadzić dopiero po zabezpieczeniu życia pacjenta.
Trzeba wiedzieć, iż zatrucie może maskować zaburzenia neurologiczne.
Laboratoryjna diagnostyka toksykologiczna
• Stosuje się w przypadku poważniejszych zatruć
• Nie jest pomocna w zatruciach ostrych ze względu na długi czas oczekiwania na wyniki
(3-8 godzin)
• Często występuje brak korelacji pomiędzy stężeniem substancji toksycznej a efektem
biologicznym
• Ryzyko wyników FD – zatrucie kilkoma substancjami, FU – pominiemy coś z dużego
panela toksyn
• Rzadko wynik badania wpływa na zmianę decyzji klinicznej
• Do badania należy zabezpieczyć
- mocz w lodówce w kierunku powszechnie występujących zatruć, od razu należy go
pobrać a nie po naszych działaniach leczniczych, można zamrozić 50-100ml
- surowicę – pomiar stężeń najczęściej występujących leków, aby ją uzyskać należy pobrać
krew na skrzep
- skrzep
też jest przydatny, ponieważ część toksyn znajduje się w dużym stężeniu w
erytrocytach (substancje cytofilne)
- popłuczyny żołądkowe – nie pobierać specjalnie, ale tylko przy okazji płukania ze
wskazań leczniczych, a poza tym i tak substancje są szybko w nim wchłaniane
- należy zabezpieczyć próbki do czasu, kiedy będzie wiadomo jakie ukierunkowane badania
należy wykonać
- największe znaczenie ma diagnostyka laboratoryjna zatruć wywołanych: paracetamolem,
lekami przeciwdrgawkowymi, aspiryną, digoxyną, etanolem, glikolem etylenowym,
żelazem, izopropanolem, litem, metanolem, teofiliną
Zatrucie alkoholami
Zatrucie metanolem
Wchłanianie
- przewód
pokarmowy
- skóra
- układ pokarmowy
35
Zatrucie
- kumulacja mrówczanów w tkankach, głównie w oku (degeneracja siatkówki)
- ciężka kwasica metaboliczna, musi być wyrównana, aby pacjent przeżył
- formaldehyd powoduje zwyrodnienie wątroby, nerek i serca
- bóle
głowy, zmęczenie, zaburzenia widzenia
- nudności, wymioty, depresja OUN
- szybki i płytki oddech (Kusmaulla)
- spadek
ciśnienia krwi, rozszerzenie źrenic, śpiączka, obrzęk tarczy nerwu wzrokowego
- niewydolność oddechowa
- niedobór zasad <20 mmol/l
Leczenie
- etanol
początkowo wypiera 10 ml/kg 10% roztworu, następnie 0,15 ml/kg/h, tak aby
poziom etanolu w osoczu wynosił 100mg/dl (1 promil)
- dializa
Zatrucie glikolem etylenowym
Wchłanianie
- pary i aerozole z układu oddechowego
- skóra
- przewód
pokarmowy
Zatrucie
- działanie narkotyczne na OUN
- ciężka kwasica metaboliczna
- nefropatia z powodu kumulacji szczawianów
- utrata
świadomości, śpiączka
- niewydolność oddechowa, obrzęk płuc
- brak
reakcji
źrenic na światło
- zniesienie czucia bólu
- przyspieszony
oddech
- tachykardia
- leukocytoza
- oliguria, anuria, mocznica
- drgawki
- hipokalcemia na wskutek wiązania wapnia z kwasem szczawiowym
Leczenie
- takie jak w zatruciu metanolem
Zatrucie glikozydami nasercowymi
U osób z hipokaliemią <5 mmol/l podajemy potas
Zaburzenia rytmu – lidokaina, fenytoina
Przeciwciała przeciwko digoksynie, liczba ampułek 1,7x ilość mg digoksyny lub 10-20
ampułek
Zatrucie lekami antyarytmicznymi
Chinidin, disopiramid, prokainamid, amiodaron
Trudna diagnostyka
Objawy – nudności, spadek ciśnienia krwi, ból, zawroty głowy, niewydolność krążenia
Leczenie – objawowe
Zatrucie β-adrenolitykami
36
Zaburzenia przewodnictwa, niewydolność serca, blok A-V, spadek ciśnienia tętniczego,
zaburzenia krążenia
Odtrutka – glukagon 5-10 mg, aż do poprawienia stanu
Zatrucie blokerami kanałów wapniowych
Amlodypina
Podawanie chlorka wapniowego, trzeba jednak to zatrucie różnicować z zatruciem
digoksyną, kiedy to CaCl2 może mieć toksyczne działanie
Zatrucie diazepamem
Na początku pacjent śpi
Gorsze są późne objawy – zwyrodnienie wątroby, nerek
W lżejszych zatruciach antagonistą jest flumazenil, w cięższych – leczenie objawowe
Zatrucie związkami cyjanowymi (CN-)
Występowanie
- cyjanokobalamina
- z
cystyną
- cyjanowodory
- rodanki
ulegające szybkiemu wysyceniu, pod wpływem siarkotransferazy tiosiarczanowej
do rodanków
- przejście cystyny w kwas iminotiazoidynokarboksylowy
Działanie toksyczne
- odwracalne hamowanie oksydazy cytochromowej, główne znaczenie toksyczne
- hamowanie
aktywności innych enzymów i Hb (cyjanoHb), nie ma takiego znaczenia
Leczenie
- tlen
- leki – 2x12,5 mg tiosiarczan sodu, 2x300mg azotyn sodu, 12 amp.azotyn amylu ( ten
ostatni - wziewnie, i.v., silnie wywołuje MetHb, która ma działanie detoksykacyjne –
związanie CN i nie wiąże się on wtedy z oksydazą), hydroksykobalamina – nie jest
dostępna w Polsce, bardzo droga
37
BIOCHEMIA
DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA
Metody biologii molekularnej umożliwiają poznawanie i diagnozowanie defektów
metabolicznych oraz innych schorzeń, w tym także chorób nowotworowych. Badania
molekularne opierają się o analizę DNA, które uzyskać można z każdej komórki posiadającej
jądro.
Materiały najczęściej wykorzystywane to
• krew pełna obwodowa (leukocyty)
• komórki płynu owodniowego i kosmówki
• hodowla komórek (fibroblasty, komórki nabłonka)
• cebulki włosowe
Rzadziej wykorzystuje się
• plamy krwi
• plamy nasienia
• fragmenty tkanek pobrane metodą BAC (biopsja aspiracyjna cienkoigłowa) – bioptaty
tkankowe
• szpik kostny
Wystarczy pobrać
• 0,3-1 ml krwi pełnej obwodowej na wersenian (EDTA), heparyna interferuje z
endonukleazami restrykcyjnymi
• pobiera się 2cm krwi – podciśnieniowe systemy pobierania – Vacutainer, Monoretta
• 20-30 mg tkanki
• 10 ml płynu owodniowego
• popłuczyny z jamy ustnej (10ml 4% roztworu), choroby uwarunkowane genetycznie
• 100 cząsteczek wirusa/ml³ wystarczy do PCR
Pobieranie materiału genetycznego
• DNA wyizolować bezpośrednio po pobraniu materiału genetycznego
• Przechowywanie - 4ºC – kilka miesięcy, -20ºC – wiele lat
• Jeśli szybkie wyizolowanie DNA nie jest możliwe, materiał należy zamrozić w
temperaturze -20ºC
Izolowanie DNA
• Izolowanie DNA wolnego od białek i niebiałkowych inhibitorów enzymów
• Komercyjne zestawy (np. Master Pure)
• Badanie stężenia i czystości próbki DNA
- metody spektrofotometryczne (np. Gene Quant)
- metody
elektrofotometryczne
Amplifikacja
• technika PCR
• Nested PCR – gniazdowa, 2 pary primerów – większa czułość. 1 primer – powielanie
szerszego fragmentu genu, drugi – węższego.
• PCR – ASA
38
• RT-PCR
• PCR in situ
Przed wynalezieniem PCR – technika hybrydyzacji (N,S,W-blott). Wymagało to
obecności sond o wysokiej specyficzności. Powielanie całego genu. W PCR specyficzny jest
starter i powielany jest tylko wybrany gen 1 lub 10 milionów razy.
Powielanie uzyskanego DNA osiąga się za pomocą techniki reakcji łańcuchowej
polimerazy (PCR).
Kolejne etapy w technice PCR
pobranie materiału – krew obwodowa (na antykoagulant)
izolacja DNA
denaturacja DNA (t = 92-94 ˚C)
wiązanie starterów (fragmenty 20-nukleotydowe komplementarne do końca 3’ DNA dla
polimerazy DNA termostabilnej) w temp. 40-60 ˚C
synteza DNA (t = 72 ˚C)
sprawdzanie „czystości” uzyskanych sekwencji (elektroforeza, spektrofotometria przy
długości fali 260-280nm)
czynność 3,4,5 – cyklicznie 20-25x
Technika PCR jest wyłącznie techniką amplifikacji DNA. Nie jest ona techniką
diagnostyczną dla określenia nowych mutacji punktowych. Może ona jednak stanowić metodę
diagnostyczną np. w przypadku dużych delecji 200-300 p.z. w połączeniu z elektroforezą.
Oprócz przesiewowego (tzn. jest mutacja, ale nie znamy jej struktury) zastosowania do
wykrywania mutacji w DNA, PCR jest także techniką wstępną w sekwencjonowaniu DNA
restryktazami. Jest to wariant PCR – PCR-RFLP. Enzymy restrykcyjne rozpoznają podwójnie
symetryczne sekwencje palindromowe. Dobieramy swoiste enzymy restrykcyjne – taki
enzym, który nie rozpoznaje miejsca restrykcyjnego w dzikim genie, ale dopiero w
zmutowanym lub na odwrót.
Technika PCR-RFLP – etapy
PCR
Dwuniciowe DNA genów homologicznych
Trawienie endonukleazami restrykcyjnymi
Mapy restrykcyjne
W przypadku powstania mutacji dochodzi do zmian miejsc restrykcji w DNA, a tym
samym do zmian wzoru restrykcyjnego (np. powstanie nowych lub usunięcia wcześniej
istniejących miejsc restrykcji).
Używane w tej technice nukleazy to egzo- i endonukleazy oraz restryktazy wraz ze
swoistymi metylazami DNA. Uzyskiwane są z bakterii i sinic. Rozpoznają i przecinają
charakterystyczne dla poszczególnych fragmentów sekwencje DNA zwane sekwencjami
palindromowymi, powstają fragmenty DNA z tzw. lepkimi bądź tępymi końcami.
39
Przeniesienie DNA na błonę nitrocelulozową odbywa się techniką Southern blotting. Inne
techniki blottingu – Northern (użycie RNA), Western (białka).
Zastosowanie
badanie zmian struktury genu (delecje, insercje, rearanżacje)
polimorfizm restrykcyjny
badanie ekspresji genów i RNA
wykrywanie genów nie ulegających ekspresji
Etapy
Uzyskanie materiału
Izolacja DNA
Trawienie nukleazami restrykcyjnymi (mapa restrykcyjna całego dostępnego, uzyskanego od
pacjenta DNA)
Elektroforeza
Denaturacja
Blotting (transfer na nitrocelulozę)
Hybrydyzacja ze znakowaną sonda molekularną (np. izotop promieniotwórczy P)
Uwidocznienie prążków DNA po odpłukaniu nie związanego DNA
analiza
W metodzie Western blott używa się znakowanych przeciwciał zamiast sondy DNA.
Wymienione wyżej metody mają zastosowanie wtedy, gdy znamy miejsce mutacji
oraz dysponujemy odpowiednimi starterami i enzymami restrykcyjnymi. Do wykrywania
nowych mutacji służą warianty (inne) metody PCR.
40
1.) PCR-SSCP (polimorfizm konformacji jednoniciowego DNA)
PCR
Denaturacja DNA
DNA jednoniciowe
Elektroforeza (20˚C)
DNA przybiera określona konformację i z charakterystyczną szybkością migruje
Konformacja oraz szybkość wędrówki fragmentów DNA zależy od masy i struktury
przestrzennej tychże fragmentów. Każda mutacja zmienia szybkość wędrówki i konformację.
2.) PCR-HD (heterodupleksy DNA)
PCR
DNA dwuniciowe
Denaturacja
Hybrydyzacja przypadkowa
Elektroforeza
Brak
parowania
świadczący o wystąpieniu mutacji w DNA zmienia strukturę
cząsteczek. Powstają heterodupleksy wędrujące z inną szybkością podczas elektroforezy niż
homodupleksy.
3.) PCR-DGGE (elektroforeza w gradiencie żelu denaturującego)
PCR
Elektroforeza w gradiencie czynnika denaturującego
Wzrost gradientu czynnika denaturującego
A. im silniejsze wiązanie obu nici DNA, tym dalej wędruje w żelu denaturacyjnym
(prawidłowe, dzikie DNA)
B. mutacja w obu allelach (najszybsza denaturacja, najbardziej zmienione)
C. mutacja w jednym allelu
41
Inne warianty PCR
1.) ASA-PCR
- wykorzystanie starterów do reakcji PCR charakterystycznych dla DNA dzikiego lub
zmutowanego; możliwa wybiórcza amplifikacja określonego fragmentu DNA, amplifikacja
specyficzna zależna od allelu. Jeśli mamy allel zmutowany choć jednym nukleotydem to
reakcja zajdzie z allelem do zmutowanego genu, nie do dzikiego.
2.) PCR-ASO
- rozróżnienie alleli odbywa się przy użyciu sond (komplementarnych do „dzikiego” lub
„zmutowanego” produktu reakcji PCR)
3.) Odwrócone PCR
- amplifikacja fragmentu DNA o nieznanej sekwencji
4.) Wewnętrzny PCR
- wykorzystanie dwóch par starterów; druga para umieszczona wewnętrznie w stosunku do
pierwszej
5.) RT-PCR – do badania RNA, poprzedzone odwrotną transkrypcją
6.) PCR in situ – pobrać bioptat narządu, zrobić szkiełko, dodać odczynników, które
zwiększają przepuszczalność, połączenie z reakcją barwną
mRNA
rewertaza
DNA RNA kompleks
CDNA
PCR
Elektroforeza
• umożliwia uwidocznienie produktu reakcji PCR
• struktury palindromowe (wędrują do anody)
• szybkość wędrówki zależy od
- wielkości i kształtu cząstek (zmiany przy mutacji)
- stężenia i struktury żelu
• wzorce masy (na przykład DNA faga lambda)
• znakowanie izotopami pierwiastków – odchodzi się od tego
• podłoża – uwidocznienie prążków
- żel agarozowy
bromek etydyny
fluorescencja w promieniach UV
ilości nanogramowe
- żel poliakrylamidowy
azotan srebra
nie wymaga UV
większa czułość 1-10 pg DNA/mm³
42
Zastosowanie metody PCR
I. Diagnostyka
zakażeń wirusowych, bakteryjnych, pasożytniczych
Pobieramy krew lub fragment narządu. Przeprowadzamy amplifikację z primerami
rozpoznającymi jakiś gen mikroba (np. białko otoczkowe), jeśli uzyskamy prążek –
zamplifikował się.
A. zakażenia wirusowe
• HBV; HCV; HTLV-1, 2; EBV; HDV; HEV; HSV; HIV; CMV; HPV; wścieklizna
• Najważniejsze jest zastosowanie PCR w diagnostyce, rokowaniu, proponowaniu leczenia
w przypadku zakażeń HBV, HCV.
• Diagnostyka WZWB jest przede wszystkim immunologiczna. Można jednak posłużyć się
metodą PCR.
• W przypadku zakażeń WZWC diagnostyka immunologiczna nie jest użyteczna, ponieważ
brak informacji o dynamice choroby oraz o czasie utrzymywania się przeciwciał. Wirus
ten jest RNA, stąd stosuje się RT-PCR. Dokonuje się oznaczania jakościowego (jak
HBV), ilościowego (ilość kopii wirusa na jednostkę krwi). Dokładne badanie genotypu
HCV pozwala na odpowiednie wdrożenie leczenia. Stosowanie INFα daje wyleczenie u
14-40% chorych. Niski efekt terapeutyczny związany jest ze swoistą „odpornością”
wirusa, a właściwie jego genotypów 1a i 1b na terapię INF. Pobudza on kinazę białkową
indukowaną przez RNA, w konsekwencji fosforylowane są białka przeciwwirusowe i
hamowane jest powstanie białek wirusa (tzn. białko otoczkowe E2). Wirus jest
niewrażliwy na leczenie INF ze względu na większe powinowactwo do kinazy PRK
patologicznych białek wirusów o genotypie 1a i 1b, niż białek przeciwwirusowych. Stąd
waga wykazania genotypu wirusa.
WZW B,C i D
♦ Wykrywanie wirusowego RNA (WZW C) lub DNA (WZW B i D)
♦ Monitorowanie liczby kopii RNA wirusa (WZW C), PCR ilościowe
♦ Genotypowanie wirusa (WZW C), ponieważ różnie reagują na INF α
♦ Jeżeli WZW ma przebieg objawowy, proste rozpoznanie
♦ WZW B i C – marskość, rak pierwotny wątroby, postacie bezobjawowe
♦ WZW C – największe zastosowanie, często postać bezobjawowa, można oznaczać
przeciwciała przeciwko HCV (długo pozostają), PCR
HIV
♦ Po pierwsze – wykrycie przeciwciał
♦ Potwierdzenie – Western blotting
♦ Monitorowanie leczenia, diagnostyka zakażenia – RT-PCR
♦ Wykrywanie prowirusa w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej metodą PCR (1
kopia /10000 do100000 komórek – diagnostyka zakażenia)
CMV – wirus cytomegalii
♦ Zakażenie wrodzone noworodków
♦ Zapalenie wątroby, zapalenie płuc, siatkówki, jelit, mózgu u chorych z AIDS lub
leczonych immunosupresją
♦ Wykrywanie DNA wirusa we krwi i PMR
43
B. zakażenia bakteryjne
Wykrywanie sekwencji genów bakteryjnych.
• gruźlica (gen białka MTB-64)
• borelioza
• zakażenia Clostridium difficile
• zakażenia Chlamydia trachomatis – hybrydyzacja RNA-DNA, wykrywanie DNA
patogenu we krwi i moczu metodą PCR i LCR
• zapalenie płuc – Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, wykrywanie DNA
metodą PCR, PCR-ASO
C. pasożyty
• zakażenia Pneumocystis carini
• toxoplasmosa (Toxoplasma gondi)
• malaria (Plasmodium falciparum)
• mikrosporidioza
• rzęsistkowica (Trichomonas vaginalis)
• lamblioza (Gardia lamblia)
• czerwonka pełzakowata
• leiszmanioza
II.
Choroby o podłożu dziedzicznym – wykrywanie
A. choroby uwarunkowane genetycznie
• mukowiscydoza
• niedobór α 1-inhibitora proteaz (rozedma płuc, marskość wątroby w młodym wieku,
elastaza)
• anemia sierpowata
• rodzinna hipercholesterolemia (FH) – rozpoznanie z wywiadu i wysokości stężenia Ch
• hemofilia A i B
• hemoglobinopatie
• pląsawica Huntingtona
• dystrofia mięśniowa Duchenn’a (DMD)
• fenyloketonuria (PKU) – test Gutriego, nie ma sensu badanie molekularne
• rdzeniowa dystrofia mięśniowa
• fragile X syndrome
Ocena wzrokowa prążków.
W przypadku mukowiscydozy, choroby dziedziczonej autosomalnie recesywnie, mają
miejsce liczne mutacje (ponad 600), stąd istnieje prawdopodobieństwo uzyskania wyniku FU.
Mutacjom tym typu nonsens, przesuniecie ramki odczytu, podlega fragment chromosomu 7 (z
genem dla białka CFTR). Zaburzone może też być składanie RNA oraz składanie białka
CFTR w transporcie. Najczęstsza jest mutacja w pozycji 508 (70%), Phe 508 delecja (wypada
fenyloalanina w pozycji 508). Do wykrywania tych mutacji służy PCR-multiplex
(wykrywanie panelu mutacji). Uzyskanie wyniku + wiąże się z dużym prawdopodobieństwem
potwierdzenia choroby, wyniku – z dużym prawdopodobieństwem wykluczenia choroby.
Trzeba jednak pamiętać, iż nie wykrycie mutacji nie wyklucza choroby.
1.) Phe 508 del PCR, 98 p.z., fragment egzonu, diagnoza u 50% pacjentów
2.) PCR multiplex (np. Johnson & Johnson CF (4) m. kit)
3.) 5 najczęstszych mutacji – 75-80% rozpoznań
Podobnie postępuje się w DMD.
44
B. Nowotwory
• zwłaszcza w hematologii (typ nowotworu, leczenie, rokowanie)
- chromosom Philadelphia w przewlekłej białaczce szpikowej (PBS)
- gen myc (tzn. mutacje w tym genie), w chłoniaku Burkitta
• nowotwory z predyspozycją rodzinną
- gen p-53 („strażnik genomu”)
- gen APC – rak gruczołowy jelita grubego, polipowatość rodzinna jelita grubego
- gen Rb – retinoblastoma
- gen WT-1 – guz Wilmsa (nephroblastoma)
- geny NF-1,2 – neurofibromatosis, guzy mózgu
- gen p-16 – melanoma (postać rodzinna)
- gen protoonkogenowy c-ret – MEN2 – mnogie endokrynne nowotwory (ryzyko
wystąpienia raka rdzeniastego tarczycy, pheochromocytoma, przerost lub gruczolak
przytarczyc)
- inne – gen BRCA-1– rak sutka, BRCA-2 - rak jajnika, - zespół Li-Fraumeni (mięsaki, rak
sutka, rak jelita grubego (p-53), - zespół von Hippol-Lindou (gen VHC), - rak prostaty –
BRCA-2
Podatność na choroby
Cały czas trzeba mieć na uwadze, że oprócz uwarunkowań genetycznych, obecne też
są uwarunkowania środowiskowe. Obecność genu nie daje 100% pewności wystąpienia
choroby. Trzeba mieć pewność, że jest to choroba dziedziczna (np. rak sutka – tylko w 5%
występuje rodzinnie, w reszcie przypadków to mutacja spontaniczna.
Wiele chorób (cukrzyca, nadciśnienie) – wielogenowość, praktycznie nie jest możliwa
diagnostyka molekularna. Cukrzyca – zmora genetyków.
Onkohematologia
Diagnostyka – wykrywanie wielu typów białaczek
Wykrywanie choroby resztkowej (MRD) – czy jeszcze po przeszczepie szpiku
zmutowane komórki
Prognozowanie
Choroba Translokacja
Gen/onkogen
Chłoniak Burkitta
t (8;14)
Myc
CML
t(9;22);chromosom
Philadelphia
chimeryczny gen BCR-ABL;
większa ekspresja – produkt –
kinaza tyrozynowa (komórka
odpowiada tak jakby cały
czas była stymulowana
czynnikiem wzrostu)
AML, ostra białaczka
szpikowa
t(3;21)
AML1, EAP, EV11
Ostra białaczka limfatyczna
T-cell
t(1,7)
LCK, TCRB
CLL
t(14;19)
BCL3, IgH
BCR-ABL – też ostre białaczki, jeśli ten gen jest – gorsza odpowiedź na leczenie.
45
III. Ustalanie
ojcostwa
• prawdopodobieństwo
• wykrycie polimorfizmu poza obszarem transkrypcyjnie czynnym w tzw. mikro, mini
satelitach (sekwencje VNTR); polimorfizm restrykcyjny w VNTR jest dziedziczony
zgodnie z prawami Mendla
matka dziecko ojciec
krew obwodowa
izolacja DNA
PCR
restrykcja DNA
mapy restrykcyjne
analiza – porównanie map restrykcyjnych
IV.
Identyfikacja osobnicza – tzw. DNA fingerprint
• krew
• sperma
V.
Wykrywanie chorób genetycznych uwarunkowanych wielogenowo i środowiskowo (np.
choroby układu krążenia,insulinooporność, nadciśnienie; określenie predyspozycji do
zachorowania)
A. choroby układu sercowo-naczyniowego – oznaczanie polimorfizmu dla:
• poligenowe, zależne od czynników środowiskowych – taki pacjent nie jest w zasadzie
kandydatem do diagnostyki molekularnej
• genu enzymu konwertującego (polimorfizm dotyczy tu intronu 16, a nie eksonu); możliwe
genotypy to: DD, II, ID (I – insercja, D – delecja). Konsekwencje posiadania genotypu
DD, to wzrost stężenia i aktywności ACE w surowicy. Ponadto: nadciśnienie tętnicze (I),
zawał (D), CHD (D), przerost lewej komory serca(D), kardiomiopatia przerostowa i
rozstrzeniowa (D).
• polimorfizm genu receptora AT1 (A1166CAT1R); konsekwencje kliniczne to wystąpienie
nadciśnienia u osób starych, zawał mięśnia sercowego, skurcz naczyń wieńcowych,
większa odpowiedź hipotensyjna na perindopril
• genu angiotensynogenu
• genu reniny (nadciśnienie tętnicze)
• genu syntetazy NO ( a zasadzie powtórzenie 27-nukleotydowe i polimorfizm
mikrosatelitów) – CHD, zawał, nadciśnienie tętnicze, przerost lewej komory
• E-selektyny (CHD, miażdżyca)
46
• genu striomielizyny 1 (CHD)
• genu apo-E – E2 hiperlipidemia typ III, E4 hiper Ch, CHD, udar mózgu, choroba
Alzheimera
• genu apo-B – hiper Ch, CHD
• genu apo(a) – (a właściwie polimorfizm dla struktur obwarzankowych), CHD
• genu LPL – hiper TG, miażdżyca tętnic
• genu reduktazy tetrahydrofolianowej – hiperhomocysteinemia (gen MTHFR, Ala 677),
CHD
• genu neuropeptydu Y – hiper Ch
• genu receptora adrenergicznego β3 – otyłość trzewna, insulinooporność
• genu receptora insulinowego (mikrosatelity) – nadciśnienie tętnicze
• genu haptoglobiny – miażdżyca tętnic, zawał, krótsze przeżycie po CABG
• genu SOD (dysmutazy ponadtlenkowej) – hiper Ch, CHD
Polimorfizm Patologia
Insercyjno-delecyjny ACE (różnice pomiędzy
populacjami)
nadciśnienie tętnicze, CHD, zawał serca,
przerost lewej komory, nasilenie zmian
miażdżycowych
Angiotensynogenu (M.(t?,czy 1)74, T235
nadciśnienie tętnicze, CHD, zawał serca,
retinopatia cukrzycowa
Apolipoproteina E (populacja fińska)
ApoE2 hiperlipidemia typu III, ApoE4 –
hipercholesterolemia
Czynnik V (czynnik V Leiden)
zakrzepica żylna, zatorowość płucna
gen reduktazy metylenotetrahydrofolianowej Hyperhomocysteinemia, CHD
Metoda bio-chip – na szkiełko podstawowe nanosi się sondy molekularne do
hybrydyzacji. Z kropli krwi można badać 7-12 tysięcy zmienności genetycznych, odczyt
laserowy. Można badać kto jest bardziej narażony – przyszłość badań nad chorobami
wielogenowymi.
B. układ krzepnięcia – polimorfizm
• genu czynnika V (Aro 506 – Glu), zakrzepica żylna, zatorowość płucna
• genu czynnika VII – wzrost jego aktywności, hiper TG, zawał serca
• fibrynogenu – G 455-A, hiperfibrynogenemia, zawał serca, udar mózgu, progresja CHD
• tromboduliny – zawał serca
• Gp III a – zawał serca, zwiększenie stenozy naczyń wieńcowych
• PAI-1 – wzrost stężenia PAI-1 – pogorszenie CHD, udar mózgu
47
BIOCHEMIA
TERAPIA GENOWA
Pierwsza próba kliniczna terapii genowej – Anderson, Rosenberg i wsp., 14.09.1990 –
gen ADA, (Severe Combined Immunodeficiency – SCJD).
Metoda polega na modyfikacji genetycznej komórek somatycznych, wprowadzenie
genu terapeutycznego (transgenu).
Terapia genowa ma zastosowanie w leczeniu nowotworów, infekcji wirusowych,
tworzeniu szczepionek DNA, leczeniu chorób uwarunkowanych genetycznie (na przykład
niedobór enzymu).
Korekcja mutacji
• metoda in vivo (gdy nie można usunąć komórek z organizmu, neurony)
• metoda ex vivo (komórki szpiku, skóry)
Pobranie komórki → hodowla→ podanie genu X→ komórka o niedoborze X→gen
podejmuje swoją funkcję (30%)→ prawidłowe białko jest syntezowane
Metody transferu genu terapeutycznego
• fizyczne i chemiczne
- precypitacja
CaPO4
- elektropolacja (wypalanie prądem dziurek w błonie komórkowej)
- metody biobalistyczne – kulki złota opłaszczone DNA i rozpędzone różnica potencjałów
„wstrzelane” do komórki
• wektory
wirusowe
- retrowirusy
- adenowirusy
- defektywne parwowirusy (wirusy adenosatelitarne – AAV)
niewirusowe
- liposomy anionowe i kationowe
- koniugaty
molekularne
- nagie
DNA
Retrowirusy
W terapii genowej stosowane są wirus HIV i białaczki mysiej (MnLV – gen białaczki
mysiej).
• duże prawdopodobieństwo wprowadzenia genów terapeutycznych do odpowiednich
komórek
• trwała ekspresja wprowadzonego genu (integracja z genomem)
• możliwość wyleczenia
• duża wydajność
• zależność ekspresji od podziału komórkowego (z wyjątkiem HIV)
• mała pojemność (7 k p.z.)
• mała immunogenność
48
• trudności techniczne – mała ilość kopii wirusa
• podstawowe niebezpieczeństwo – możliwość wystąpienia mutagenezy insercyjnej
(aktywacja protoonkogenu, inaktywacja antyonkogenu)
LTR – gen terapeutyczny, marker transkrypcji, schemat wektora retrowirusowego.
Sekwencja ta zostaje wprowadzona do genomu, gen terapeutyczny ulega ekspresji, co podlega
kontroli dzięki produktowi genu markera transkrypcji.
LTR – gag – env – pol – LTR
LTR – gen terapeutyczny (markerowy) – LTR
Powoli stwierdza się czy gen „wszedł”, zadziałał
Adenowirusy (HSV, Vaccinia)
• pozwalają na wprowadzenie genu terapeutycznego do komórki
• brak integracji z genomem (bo jest to DNA episomalny)
• ekspresja niezależna od podziału komórki
• krótkotrwała ekspresja wprowadzonego genu (CF – około 4 tygodni, złuszczony nabłonek
oskrzeli)
• małe niebezpieczeństwo transformacji
• duża immunogenność
• większa pojemność (powyżej 30 p.z.)
• duża wydajność transdukcji
• naturalne powinowactwo do nabłonka dróg oddechowych i przewodu pokarmowego
• łatwa hodowla
HSV
• tropizm do komórek nerwowych
• pojemność powyżej 20 k p.z.
• brak integracji z genomem
Defektywne parwowirusy
• wymagana koinfekcja adenowirusa
• integracja w 19q
• trwała integracja
• mała pojemność (4 k p.z.)
• brak genów wirusowych
• odwrócona powtórzona sekwencja LTR
• często – niespecyficzna integracja genu terapeutycznego
Liposomy
• tworzymy w laboratoriach
• podwójna błona lipidowa
• nadajemy im ładunek – kationowe lub anionowe
• dowolna, nieograniczona pojemność
49
• krótka ekspresja
• gen nie integruje z chromosomem
• brak toksyczności
• niska immunogenność
• możliwość zwiększenia specyficzności (gen dochodzi tam gdzie chcemy, a nie
przypadkowo) poprzez sprzęganie z
- przeciwciałami
- hormonami
- czynnikiem
wzrostu
- białkiem fuzjogennym F wirusa SENDAI
• kationowe wprowadzają gen terapeutyczny do makrofagów wątroby, szpiku kostnego,
śledziony
• anionowe mają dodatek gangliozydu
Koniugaty molekularne
Mają formę: plazmid – polikation (np. polilizyna) – ligand (np. przeciwciało)
Działania niepożądane w terapii genowej
• Mogą mieć związek z wektorem, z produktem genu terapeutycznego, z terapią antysensu
• Wektory retrowirusowe mogą powodować mutagenezę insercyjną, reakcje
immunologiczne (przeciw wirionom i zakażonym komórkom; wirus białaczki mysiej jest
inaktywowany przez układ dopełniacza).
• Liposomy kationowe mogą być toksyczne.
• Wirus wprowadzony z genem terapeutycznym może nabrać zdolności samodzielnej
replikacji.
• Przeciwnowotworowe działanie cytokin, zwłaszcza IL-2, której gen wprowadza się do
organizmu może być powikłane ogólnoustrojową toksycznością i reakcją zapalną.
• W terapii antysensownej może dojść do paradoksalnej aktywności genu docelowego.
Obecnie selektywnośc terapii genowej nie jest zbyt wysoka, można podnieść jej
wybiórczość przez zastosowanie
specyficznych dla różnych komórek ligandów, np. przeciwciał monoklonalnych
sprzęgniętych z genem terapeutycznym
przez zastosowanie metod chemicznych
przez wybiórczą transkrypcję genów terapeutycznych
• promotorów tkankowo-specyficznych, gen połączony ze specyficznym promotorem
aktywowanym tylko w komórkach określonej tkanki, np.
- wątroba – promotor dla albuminy
- melanocyty – tyrozynaza
- ca hepatocellulare – α fetoproteina
- rak
sutka,
żołądka, jelita grubego i cienkiego – ERBB2
- rak jelita grubego, płuca, żołądka – CEA
• promotory indukowane
- aktywowanie kwasem retinowym
wykorzystuje się też naturalne powinowactwo wirusa HIV do komórek posiadających
CD4
Korekty można dokonać w
chorobach uwarunkowanych genetycznie, są tu jednak pewne warunki
50
- choroba uwarunkowana jest jednogenowo, dziedziczenie recesywne
- mutacja „loss of function”
- ograniczenie
ilości komórek, których naprawa prowadzi do efektu klinicznego
- szeroki
przedział terapeutyczny
- wielkość kodującego DNA
- dostępność komórek
- brak
konieczności regulacji ekspresji genu terapeutycznego
- szeroki
przedział terapeutyczny
- ważna są także typy schorzenia – w chorobie uwarunkowanej recesywnie – wzmożenie
ekspresji genu bez eliminacji zmutowanego allelu, uwarunkowanej dominująco –
usunięcie allelu terapią antysensu
- u heterozygot 40-50% aktywności genu wystarczy dla zachowania jego funkcji
• mukowiscydozie
- uzyskanie ekspresji genu CFTR w nabłonku oskrzeli
- wziewne podawanie wektora wirusowego z genem dla CFTR
- ekspresja w 20% komórek
- krótkotrwały efekt terapeutyczny (obrót komórkowy)
• SCID (gen dla ADA – dezaminazy adeninowej)
• rodzinnej hipercholesterolemii – gen receptora LDL
• hemofilia A, B – gen czynników krzepnięcia
• choroba Gauchera – gen glukocerebrydazy
• DMD – gen dystrofiny
• Fenyloketonuria – gen hydroksylazy Phe
• choroby spichrzeniowe (glikogenozy, lipidozy)
nowotworach
• wprowadzenie genów samobójczych (in vivo do guza)
- wszystko polega na tym, iż do komórek nowotworowych wprowadzamy gen enzymu,
którego komórki te nie mają, następnie podajemy prolek (na przykład gancyklowir), który
jest przerabiany przez nie na cytostatyk
- metoda wprowadzania – stereotaksja, z wykorzystaniem TK
- gen kinazy tymidynowej HSV (fosforylacja acyklowiru, gancyklowiru do mono-P-
acyklowiru – gancyklowiru, następnie do tri-P-acyklowiru – gancyklowiru), wysoka
miejscowa toksyczność, niszczenie komórek nowotworowych (glejaki), także tych, do
których nie dostał się gen terapeutyczny, wpływ komórki transfekowanej na sąsiednie
(Bystender Killing Effect);
- gen dezaminazy cytozynowej (DC); 5-fluorocytozyna (nietoksyczny prolek)→CD→5-
fluorouracyl (toksyczny cytostatyk), brak BKE
- gen cytochromu p-450; cyklofosfamid, ifosfamid (nietoksyczne proleki)→p-
450→toksyczne metabolity, silny BKE, zastosowanie w białaczkach, chłoniakach
• naprawa genetyczna nowotworu
- geny
supresorowe
- hamowanie onkogenów z użyciem terapii antysensu
• immunomodulacja - pobudzanie odpowiedzi limfocytów Tc
- wyizolowanie limfocytów naciekających guz, wprowadzenie ex vivo genów dla TNFα,
IL-2, ponowne wprowadzenie do organizmu – silniejszy atak
• szczepionki nowotworowe
- pobranie komórek guza→ wprowadzenie genu IL-6, sIL-6R (receptor)→naświetlanie
RTG→ wprowadzenie do organizmu
- wprowadzenie genów MHC (bardzo immunogenne)
51
- niektóre nowotwory mają białka odporności na cytostatyki (białka ABC) – wyrzucanie
cytostatyku poza komórki; ochrona komórek szpiku w czasie terapii cytostatykami -
wprowadzenie genu odporności wielolekowej (MDR) do komórek macierzystych szpiku,
podanie cytostatyku w większej dawce
• immunoterapia lub spadek aktywności onkogenu
- melanoma malignum – immunoterapia, terapia antysensu (HLA B7; IL-2, 4, 7, 12; INF γ;
GM-CSF; TNF;
- rak nerki (IL-2, IFN γ, MDR1)
Terapia genowa AIDS
Podstawową trudność stanowi niestabilność genetyczna HIV, co niesie za sobą
powstanie wirusów opornych. W terapii genowej AIDS stosuje się:
kompetencyjne sensowne RNA, tzw. pułapki RNA
• oligonukleotyd wiążący RNA – nie dochodzi do syntezy białek wirusa: wprowadzenie
sensownego RNA dla genów TAR i RRE, wiązanie białek Tat i Rev odpowiedzialnych za
regulacje replikacji, brak replikacji
• sensowne RNA z sygnałem pakowania (fałszywe RNA sygnalizuje przedwczesne
pakowanie, powstają wiriony defektywne)
strategia antysensu
• gen kodujący rybozym (wiązanie produktów ekspresji prowirusa, niszczenie RNA wirusa
wprowadzonego podczas infekcji)
• białka Tat i Rev - sekwencje TAR i RRE
produkcja wewnątrzkomórkowych białek przeciwwirusowych
• mutanty transdominujące hamują replikację
• wprowadzenie do komórki genu kodującego receptor CD4, wydzielanie do krwi sCD4,
wiązanie Gp 120
• wewnątrzkomórkowe jednołańcuchowe przeciwciała (specyficzne dla glikoproteiny 160,
powstają wiriony nieinfekcyjne, bez oddziaływania z CD4, bądź specyficzne dla Rev)
• eliminacja zainfekowanej komórki (gen samobójczy pod kontrolą promotora wirusowego)
• szczepionki genetyczne
Szczepionki genetyczne
szczepionki DNA
klasyczne – nie zawsze skuteczne
genetyczna modyfikacja antygenu
genetyczna modyfikacja patogenu zakaźnego
wprowadzamy gen terapeutyczny (gen patogenu) na przykład do mięśni poprzecznie
prążkowanych, antygen ten jest wychwytywany przez komórki prezentujące antygen,
następuje degradacja w lizosomach i antygen wraca na powierzchnię komórki; dłuższa
odporność i skuteczność
szczepionki klasyczne – prezentacja z MHC klasy II (prezentacja komórkom CD4)
szczepionki genowe – prezentacja z MHC klasy I (prezentacja komórkom CD8), lepsza
prezentacja m.in. w infekcjach wirusowych
Szczepionki DNA – zastosowanie praktyczne
• infekcje
- WZW B, C - próby
- AIDS (Gp-120, Gp-160, Rev, Nef) - próby
- opryszczka - próby
- grypa
(wewnętrzna nukleoproteina) - próby
52
- wścieklizna
- malaria - próby
- leiszmanioza
- gruźlica (białko szoku termicznego)
• choroby autoimmunologiczne
- SM (sclerosis multiplex), MBP (myelin basic protein, zasadowe białko mieliny)
• nowotwory
- czerniak
złośliwy – MHC I
- rak
okrężnicy
- rak sutka - onkogen Nev
Wektory w szczepionkach DNA to układ plazmid – gen terapeutyczny – promotor;
DNA podawane jest
• i.m., s.c. w roztworach soli fizjologicznej
• kompleksy z lipidami
• kulki złota opłaszczone DNA
• aerozol donosowy
Donaczyniowy transfer genów – leczenie chorób układu krążenia
metody transferu
- hodowle komórkowe (miocyty, śródbłonek)
- ex vivo (przeszczepy żylne, tętnicze, śródbłonek, przydanka)
- in vivo (cewnik z podwójnym balonem, mikroiniekcja, stenty pokryte śródbłonkiem,
polimery biodegradowane)
wektory
- retrowirusy
- adenowirusy
- AAV
- liposomy z białkami wirusa SENDAI
- kompleksy
liposom-adenowirus
- kompleks
DNA-liposom
- DNA-białko
zastosowanie w terapii
• miażdżyca tętnic, geny dla:
- VEGF – poprawa krążenia u pacjentów z miażdżycą naczyń obwodowych (tworzenie
naczyń, wzrost komórek śródbłonka)
- eNOS (syntetaza tlenku azotu), COX (cyklooksygenaza) – poprawa reaktywności
śródbłonka, wzrost syntezy PGI i NO
- gen receptora LDL
- apo-A1
- TIMP-1
- t-PA
- hamowanie
NKkβ (nuclear factor kappa-beta)
• niedokrwienie mięśnia sercowego (gdy inne metody terapeutyczne zawiodły, CCS 4)
- nagie DNA, igłą do mięśnia lewej komory, u 80% pacjentów z CCS 4 – CCS 2
- VEGF (mitogen komórek śródbłonka), wzrost krążenia obocznego
- FGF, wzrost ilości naczyń włosowatych i perfuzji mięśnia sercowego
• restenoza
♦ hamowanie proliferacji miocytów
- HSV-tk (kinaza tymidynowa z HSV), podawanie gancyklowiru
53
- Rb
- p-21 (hamowanie CPK)
- H-ras DN (transdukcja sygnałów mitogennych – hamowanie)
- deaminaza cytozynowa (5-fluorocytozyna)
- oligonukleotydy antysensowne (dla czynników wzrostowych, transkrypcyjnych)
- pułapki RNA dla Nk kappa-beta
- pułapki RNA (receptor czynników wzrostowych NK kappa-beta)
♦ hamowanie procesów zakrzepowych
- TIMP-1 (inhibitor tkankowych metaloproteinaz)
- eNOS (wzrost syntezy NO)
- COX (wzrost syntezy PGI)
- rekombinowana hirudyna (inhibitor trombiny)
Leki oligonukleotydowe
20 p.z.
produkowane sztucznie
oligonukleotydy antysensowne
• oporność na działanie nukleaz: zamiana atomu 0 na atom S (tiolacja),podstawienie atomu
Se, C, N
• transport do komórki
• hybrydyzacja z RNA, DNA lub z białkami
- wiązanie z DNA – struktura III-o rzędowa
- wiązanie z RNA – blokada transkrypcji
- wiązanie z białkiem – zahamowanie transportu dobłonowego i dezaktywacja
- hamowanie ekspresji genów
oligonukleotydy katalityczne
• degradacja RNA przez syntetyczne rybozymy („enzymy” zbudowane z RNA)
• zapalenie wątroby B, C – rybozymy degradujące regiony końcowe genomu
• terapia nowotworów (c-fas, BCR-ABL, H-ras)
aptamery
• wiązanie z białkami i hamowanie ich funkcji
• selektyny
• integraza HIV
Leki oligonukleotydowe – zasada doboru
oporność na działanie nukleaz: zamiana atomu O na S lub grupę metylową
optymalna długość 15-25 nukleotydów
sekwencje zależne od sekwencji docelowego mRNA (często zawierające kodon AUG)
stabilność termodynamiczna hybrydy
transport przezbłonowy
• pęcherzyki endosomalne
• liponektyna
• związki polikationowe (np. polilizyna)
• modyfikowane, ułatwiające transport 4 związki lipofilne (cholesterol, heptodekanol,
mentol)
54