Microsoft Word - Biochemia - 4ty rok 2001 -wszytsko.doc

BIOCHEMIA

CZYNNIKI BIOCHEMICZNE W OCENIE RYZYKA CHOROBY NIEDOKRWIENNEJ

SERCA

Czynniki ryzyka – stany, które częściej niż w populacji generalnej wiążą się z

powstawaniem patologii.

CHD w powyżej 95% powstaje na podłożu procesów miażdżycowych.

Czynniki ryzyka miażdżycy można podzielić na podstawie

1.) Częstości występowania
• Rzadko

• Często – zaburzenia gospodarki lipidowej, węglowodanowej, nadciśnienie tętnicze,

palenie tytoniu

2.) Siły oddziaływania
3.) Odwracalności (najważniejsze z punktu widzenia medycyny)
4.) Możliwości oznaczenia – dostępne, tanie, łatwe do interpretacji.

Biochemiczne czynniki ryzyka miażdżycy

• Zaburzenia metabolizmu lipidów
• Zaburzenia metabolizmu węglowodanów (tzw. zespół metaboliczny X, Reavena,

polimetaboliczny)

-hiperglikemia
-hiperinsulinemia
•  Zaburzenia układu krzepnięcia i fibrynolizy
-fibrynogen, czynnik VII
-LPL (a)
•  Zaburzenia przemian wolnorodnikowych
-oznaczanie przeciwciał przeciwko oxy-LDL
•  Zaburzenia przemian aminokwasów
-hyperhomocysteinemia
•  Zaburzenia przemian prostanoidów
-spadek wydalania metabolitów prostacykliny
-wzrost wydalania metabolitów TXA2

Metody

diagnostyczne

Biochemiczne (Ch, TG, HDL)
Koagulologiczne – układ krzepnięcia
Immunologiczne – ELISA –białka
Biologii molekularnej

Rodzaje badań diagnostycznych

Podstawowe – na poziomie podstawowej opieki zdrowotnej
Uzupełniające – na poziomie szpitala rejonowego
Specjalistyczne – bardzo trudno, niewielka liczba pacjentów

Zaburzenia gospodarki lipidowej są najczęstszym zaburzeniem metabolicznym

będącym podłożem chorób krążenia, które są pierwszą przyczyną zgonów.

Zaburzenia metabolizmu lipidów

• Silny związek z CHD (LDL)

• Grupa czynników o odwracalnym ryzyku (w takim samym stopniu jak narasta przy

wzroście LDL)

• Łatwość do wykonywania podstawowych oznaczeń
• Przydatność do monitorowania terapii

Etapy powstawania blaszki miażdżycowej
1.) Smuga tłuszczowa: są to złogi lipidów i komórek piankowatych pod śródbłonkiem.

Powstają już w wieku przedszkolnym i szkolnym – zmiana odwracalna

2.) Blaszka włóknista: komórki mięśniowe z warstwy środkowej proliferują i wchodzą pod

śródbłonek, tworząc kolagen i elastynę wytwarzają czepiec włóknisty

3.) Blaszka niestabilna
4.) Pęknięcie blaszki i zamknięcie światła naczynia

Groźniejsza jest mniejsza blaszka, gdyż pękając prowadzi do zawału, natomiast

większa daje objawy bólu wieńcowego.

Istnieją dwa rodzaje blaszek miażdżycowych: stabilna i niestabilna. Według koncepcji

Libbiego, będącej głównym kierunkiem terapii miażdżycowej dąży się do przejścia blaszki z
niestabilnej w stabilną , nie na odwrót.

Czynniki decydujące o powstawaniu blaszki miażdżycowej niestabilnej to wzrost:

Ilości makrofagów
Ilości proliferujących mięśni gładkich
Ilości lipidów

Prowadzą one do rozwarstwienia blaszki włóknistej.

Istotą miażdżycy jest proces zapalny, który związany jest z naciekiem makrofagów,
które z kolei pożerają lipidy tworząc komórki piankowate.
Etapy tego procesu:
1.) Dzięki molekułom adhezyjnym monocyty wchodzą pod śródbłonek, objadają się

cholesterolem i przekształcają w komórki piankowate, powstaje w ten sposób smuga
tłuszczowa, która jest całkowicie odwracalna

2.) Monocyty stymulują wydzielanie czynników wzrostowych, co powoduje z kolei wzrost

syntezy białek tkanki łącznej – powstaje czepiec włóknisty

3.) Gromadzenie się w ścianie naczyń makrofagów (degradacja czepca włóknistego)
4.) Gromadzenie się lipidów w miejscu zmiany (pokarm dla makrofagów, które tworzą

komórki piankowate)

5.) Proliferacja mięśni gładkich
6.) Wydzielanie enzymów proteolitycznych – blaszka niestabilna
7.) Rozkład blaszki (pęknięcie, oderwanie), płytki krwi zaczynają się wykrzepiać – incydent

wieńcowy

Blaszki niestabilne odznaczają się aktywniejszym metabolizmem, przez co są

cieplejsze (większy potencjał oksydacyjny), w przeciwieństwie do blaszek stabilnych, które
są zimniejsze.

Dotychczas stosowano technikę koronarografii, jednakże okazało się, iż pękają

blaszki, które były obojętne w koronarografii. Teraz paradygmat stosowany od około pół roku
– blaszka miażdżycowa nie rośnie do światła naczynia, ale na zewnątrz. Nie zakłóca więc ona

przepływu krwi. Dlatego też stosuje się USG wewnątrznaczyniowe. 20-25 MHz, można
prawie zobaczyć pojedyncze miocyty.

Czynniki ryzyka rozwoju miażdżycy

1.) Styl życia
• Dieta bogata w cholesterol, nasycone kwasy tłuszczowe i kalorie

• Palenie tytoniu

•  Wzrost spożycia alkoholu
•  Mała aktywność fizyczna

2.)  Czynniki biochemiczne i fizjologiczne modyfikowalne
•  Wzrost LDL (200mg%) o 1 mg% ryzyko wzrasta o 2%, jest to zasada 2:1, która jest

ryzykiem odwracalnym

• Spadek HDL (45 mg%) o 1 mg% ryzyko wzrasta o 3%, jest to zasada 3:1, która jest

ryzykiem nieodwracalnym

3.) Czynniki indywidualne niemodyfikowalne

Z powyższego wynika, iż korzyści terapeutyczne otrzymuje się obniżając LDL, nie

podwyższając HDL.

35% przypadków CHD występuje u osób ze stężeniem tCh<200mg%. Wynika z tego,

iż nie ma sensu oznaczać tCh. Trzeba znać stężenie TG, LDL, HDL.

Zasada 2:1, 3:1 – Framingham Heart Studies. Zasada 2:1 działa w obie strony (wzrost

stężenia Ch niesie za sobą wzrost ryzyka, spadek Ch – spadek ryzyka). Zasada 3:1 jest
jednokierunkowa. Stąd płynie jednoznaczny wniosek, iż NADRZĘDNYM CELEM
LECZENIA HIPERLIPIDEMII JEST REDUKCJA STĘŻENIA LDL!!!

Promiażdżycowe działanie hipercholesterolemii

Naciekanie ściany naczynia przez LPL
Modyfikacja struktury LPL (oksydacja, tiolacja, glikacja, angiotensynizacja,

homocysteinizacja, glikotiolacja)

Spadek syntezy prostacyklin i EDRF przez śródbłonek z jednoczesnym wzrostem ET 1

(wazokonstrykcyjna)

Zmniejszenie aktywności adhezyjnej śródbłonka
Zmiana reaktywności miocytów gładkich na czynniki presyjne ( wzrost ekspresji

receptora dla angiotensyny 1)

Wzrost ekspresji molekuł adhezyjnych na powierzchni endotelium
Wzrost migracji miocytów i makrofagów na powierzchni naczyń – komórki piankowate
Indukcja proliferacji miocytów gładkich w świetle naczyń (czynniki wzrostu wydzielane

przez komórki piankowate)

Zaburzenie równowagi krzepnięcia i fibrynolizy (gdy prostacyklina > TXA2, płytki

łatwiej przylegają do naczynia)

WYNIKA Z TEGO, IŻ LEKI HIPOLIPEMIZUJĄCE POWINNY POSIADAĆ TAKŻE
INNE PUNKTY UCHWYTU, NIE TYLKO OBNIŻAĆ STĘŻENIE CHOLESTEROLU

Lokalizacja

miażdżycy tętnic

• Aorta i jej odgałęzienia – przede wszystkim naczynia wieńcowe

• Naczynia mózgowe
• Naczynia duże w kończynach dolnych (mikroangiopatia –dno oka, kończyny dolne – w

cukrzycy)

Algorytm diagnostycznego postępowania w hipercholesterolemii

1.)  Czy jest hiperlipidemia?
2.)  Jaki jest jej typ?
3.)  Jaka jest jej przyczyna?
4.) Czy istnieją u pacjenta nielipidowe czynniki ryzyka?
5.)  Ocena globalnego ryzyka CHD.
6.) Określenie typu prewencji.
7.) Cel terapii.

Adn.1.)

Diagnostyka laboratoryjna gospodarki lipidowej na poziomie podstawowym

• Cholesterol całkowity

• HDL

• TG
• LDL (wzoru Friedewalda nie stosujemy, gdy TG>400 mg% - około 1% populacji taki

wynik ma, wtedy oznaczamy bezpośrednio stężenie LDL - chemicznie). Wzór
Friedewalda LDL(mg%)=tCH(mg%)-HDL(mg%)-TG(mg%)/5 lub (mM/l)/2,2

Zasady oznaczania

1.) Przygotowanie pacjenta
-  12-16-godzinna dieta 0 (tylko nieosłodzone płyny)
-  stabilna masa ciała
2.) Wykonanie badania
-  2, 3 razy w odstępach 7-14 dni (gdy wynik nieprawidłowy lub prawidłowy, a my

oczekujemy, że nie powinien być, gdyż musimy być pewni – jest to leczenie na całe życie,
a parametry te są zmienne biologicznie)

-  stosowanie identycznej diety
3.)  Przeciwwskazania (niewiarygodne wyniki stężenia cholesterolu)
-  ostra faza zawału mięśnia sercowego (6 tygodni od zawału parametry lipidowe są

wyższe)(zmniejszone stężenie Ch)

- ostre stany zapalne (zmniejszone)
- niewyrównane zaburzenia endokrynologiczne (niedoczynność tarczycy, niewyrównana

cukrzyca)

- leki powodujące zaburzenia lipidowe (tiazydy, β blokery nieselektywne,

glikokortykosterydy)

- ciąża (fizjologiczna hiperlipidemia)

LDL oznaczamy jak najszybciej, w momencie przyjęcia, ale rzadko pacjent jest na

czczo, wtedy trzeba zrobić oznaczenie chemiczne. Należy oznaczyć LDL w ten sam dzień w
przypadku przyjęcia chorego na zawał lub niewydolność wieńcową, gdyż już na drugi dzień
do 3 miesięcy u 98% pacjentów cholesterol spada. Po pierwsze należy usunąć przyczynę
hiperlipidemi. W przypadku wystąpienia zawału należy włączyć statyny, aby zmniejszyć
obszar zawału.

Diagnostyka laboratoryjna gospodarki lipidowej – badania uzupełniające

• Elektroforeza LPL lub test zimnej flotacji
• Apo B

• Apo A1

• LPL(a)

Diagnostyka laboratoryjna gospodarki lipidowej – badania specjalistyczne

• Fenotyp apo E

• Enzymy przemiany lipidowej
• NMR lipoprotein

• Polimorfizm genów kodujących białka enzymatyczne i nieenzymatyczne

Adn.2.)
Podział według Europejskiego Towarzystwa Miażdżycowego (najlepsze dla lekarza
praktyka, ale czasem taki podział jest niewystarczający)

hipercholesterolemia – cholesterol całkowity > 200mg%
hipertrójglicerydemia – TG > 200mg%
hipercholesterolemia mieszana – cholesterol całkowity >200mg%, TG >200mg%

Podział według WHO (podział Friedriecksona)

TYPY ELEKTROFOREZA

WYGLĄD OSOCZA

Chylomikrony Przejrzyste,

kożuch

IIA

Beta lipoproteiny (LDL)

Przejrzyste

IIB

Beta + pre-beta lipoproteiny

Opalizujące

III

Beta VLDL

Opalizujące, delikatny kożuch

Pre-beta VLDL

Zmętnienie, delikatny kożuch

Pre-beta + chylomikrony

Zmętnienie, kożuch

CHOLESTEROL NIE POWODUJE ZMĘTNIENIA !!!

Test zimnej flotacji najbardziej jest przydatny do rozpoznania typu III – wysoce

aterogenne.
Zależność pomiędzy zgonami wieńcowymi, a stężeniem cholesterolu jest wprost
proporcjonalna. Najmniej przypadków w Japonii, najwięcej w Finlandii wschodniej
(niekorzystny fenotyp, mało Mg, Se).

Adn.3.)
Przyczyna

może być pierwotna (genetyczna) lub wtórna (towarzyszy innym

chorobom)

Przeprowadzamy kompleksowe badania

wywiad, badanie fizykalne
poziom TSH (wykluczamy subkliniczną niedoczynność tarczycy metodą ultraczułą III

generacji)

stężenie glukozy (doustny test obciążenia glukozą)
ocena nerek (kreatynina, badanie ogólne moczu)
ocena trzustki (amylaza w osoczu i moczu)

Gdy powyższe badania są ujemne rozpoznajemy pierwotną hiperlipidemię.

Adn.4.)

Nielipidowe czynniki ryzyka

• wiek, płeć (M>45, K>55 lub <55, ale nie przekwitła, nie stosująca hormonalnej terapii

zastępczej

• wywiad rodzinny (ojciec lub brat <55, matka lub siostra <65)
• palenie tytoniu

• nadciśnienie tętnicze >140/90 lub każde inne u osoby biorącej leki hipotensyjne

• cukrzyca lub upośledzona tolerancja glukozy
• trzewna dystrybucja tkanki tłuszczowej

• obniżona odporność

• HDL <35mg%

Adn.5.)

Ryzyko lipidowe i nielipidowe. Jakie jest ryzyko globalne. Wzrost czynników ryzyka

przy tym samym stężeniu Ch – ryzyko rośnie. Obniżamy czynniki ryzyka oraz stężenie Ch.
Jak

oszacować ryzyko CHD?

Karty ryzyka wieńcowego

Programy komputerowe

Internet

Karty ryzyka wieńcowego

Istnieją 4 karty – dla K, M., K z cukrzyca, M. z cukrzycą. Musimy znać stężenie Ch,
ciśnienie, palacz lub nie. Kolor ciemnopomarańczowy wskazuje na wzrost >20% ryzyka
wystąpienia zawału w ciągu 10 lat. Krytyka – rzeczywiste ryzyko jest znacznie wyższe,
dlatego kart tych się nie stosuje.

Internet

www.chd-taskterce.com

Kalkulator ryzyka PROCAM – tylko dla mężczyzn, FRAMINGHAM – dla obu płci.
Pięć kwintyli.
Zawał serca
I – ryzyko 4/1000 w ciągu 8 lat
V – ryzyko 167/1000 w ciągu 8 lat
Ryzyko zawału serca
I – 0,05% w ciągu roku
V – 2,26% w ciągu roku

Adn.6.)
Typy

prewencji

• Pierwotna – osoby pozornie zdrowe, niedopuszczenie do rozwoju CHD

• Wtórna – osoba z CHD lub zawałem, niedopuszczenie do pogłębienia choroby, jest

bardzo agresywna, gdyż istnieje duże ryzyko.

Wzrost ryzyka niesie za sobą wzrost agresyfikacji terapii, wysokie ryzyko plus dobrze

dobrana terapia niesie za sobą wzrost zysku.

Celem terapii nie jest obniżenie LDL o jakąkolwiek wartość.

Adn.7.)

Celem terapii nie jest obniżenie stężenia lipidów, ale osiągnięcie prawidłowego

stężenia cholesterolu, na podstawie badań klinicznych i epidemiologicznych.

Rekomendacje europejskie
Prewencja

pierwotna

Zajmowanie się tylko tym pacjentem, gdzie wysoki Ch koreluje z wysokim ryzykiem –

ryzyko > lub równe 20% w ciągu 10 lat (lub ekstrapolacja do 60r.ż.)

Prewencja wtórna

TCh <190 mg%
LPL <115 mg%

Rekomendacje amerykańskie
Prewencja

pierwotna

Mniej niż 2 nielipidowe czynniki ryzyka – poziom LDL obniżony do <160mg%, z reguły

jest ich więcej

2 lub więcej nielipidowych czynników ryzyka – poziom LDL obniżony do <130mg%

Prewencja wtórna

bez względu na ilość CHNS lub inna postać kliniczna miażdżycy – poziom LDL obniżony

do <100mg%

Istnieje pewna grupa pacjentów, u których obniżamy LDL <50 – 60mg%. Są to

pacjenci z grupy wysokiego ryzyka, do których należą
• pacjenci po PTLA

• pacjenci po by-pass

• pacjenci po przeszczepie serca

Agresywne leczenie hipolipemizujące jest bezpieczne, ponieważ przy stężeniu LDL

około 35mg% (0,65 mmol/l) receptory LDL są już w pełni wysycone. Trzeba tez wiedzieć, iż
nie ma takiego sposobu, aby obniżyć LDL o 30%. Im bardziej agresywna terapia tym lepsza.

Po co leczymy?

Nie po to, aby obniżyć LDL
Po to, aby obniżyć procent umieralności ogólnej – najważniejszy cel terapii
Zmniejszyć progresję miażdżycy tętnic
Uzyskać regresję
Zmniejszenie zmian ksantomatycznych
Profilaktyka OZT
Zmniejszenie zapadalności na CHD
Zmniejszenie zapadalności na zawał serca
Zmniejszenie ilości zabiegów rewaskularyzacyjnych

Algorytm postępowania lekarza

1.) Wywiad
2.) Badanie fizykalne
3.) Oznaczanie TSH metodą ultraczułą, gdyż często jest to subkliniczna niedoczynność

tarczycy – wzrost TSH przy prawidłowym stężeniu hormonów T3, T4

4.) Oznaczanie stężenia glukozy
5.) Ocena czynności wątroby
6.) Ocena czynności nerek (kreatynina)
7.) Ocena czynności trzustki

Wynika z tego, iż przy pierwszej wizycie oznaczamy TSH, gdy jest w normie - dalsze

badania.

Oznaczanie TSH

• Subkliniczna niedoczynność tarczycy jest czynnikiem ryzyka zawału serca u kobiet po

menopauzie (wzrost lepkości krwi, spadek klirensu LDL, wzrost stężenia homocysteiny)

• Częstość występowania 10% populacji

• Zawał serca – iloraz szans (OR)=2,3

• Zmiany miażdżycowe w aorcie OR=1,9
• TSH oznaczamy też zawsze u kobiet z hyperprolaktynemią

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -

Zachorowania w Polsce

hipercholesterolemia (najczęstsza) – 61%K > 56% M.
hipercholesterolemia mieszana – 15%M. > 6%K
hipertriglicerydemia – 1%M. = 1%K
prawidłowy lipidogram – 32%K>28%M

Rodzaje hipercholesterolemii

1.) Pierwotna
• Rodzinna (1:1 000000 nie leczy się)

• Rodzinny defekt apo-B-100

•  Poligeniczna
•  Rodzinna hiper-alfa-lipoproteinemia (wzrost HDL)
2.) Wtórna
•  Niedoczynność tarczycy

• Cholestaza
• Zespół nerczycowy

• Anorexsia nervosa

• Ostra porfiria przerywana
• Zespół Turnera

Metabolizm

LDL

Wątroba VLDL remnanty VLDL

LDL oksy LDL

Tkanki obwodowe

Mogą wchodzić w skład komórek piankowatych, które po rozpadzie
uwalniają

Enzymy proteolityczne LDL

Stężenie LDL wzrasta, gdy wzrasta produkcja VLDL – zaburzony wychwyt przez
wątrobę i tkanki obwodowe. Istnieją skrajne przypadki – rodzinna hipercholesterolemia –
występuje wtedy brak wychwytu LDL i powstają oxyLDL. Powstają wtedy komórki
piankowate, dochodzi do destabilizacji blaszki miażdżycowej. Zaburzenie to występuje z
częstotliwością 1/500 w postaci heterozygotycznej oraz 1/1000 w postaci homozygotycznej.

Podobny efekt występuje w niedoczynności tarczycy, kiedy brak TH receptory są

nieaktywne.
Efekt

żniwiarza – powyżej 80 r.ż. brak korelacji między stężeniem Ch a częstością

zgonów.
Niskie

stężenie LDL jest objawem raka, a nie jego przyczyną (bo niskie LDL koreluje

dodatnio ze wzrostem umieralności z powodu raka).

Badanie PROCAM (Europa) – im wyższe stężenie LDL tym większa umieralność

ogólna, za którą odpowiedzialne są zgony wieńcowe.

Metabolizm

HDL

Wątroba VLDL remnanty VLDL

LDL CETP

Tkanki obwodowe HDL

Dużo HDL hamuje białko CETP.

HDL przenosi Ch z tkanek obwodowych do wątroby. Leki blokujące CETP – nie

dochodzi do przenoszenia.

Brak jakiegokolwiek dobrego skutku z podniesienia stężenia HDL.

Nowości w metabolizmie HDL – białka ABC – zasada drzwi obrotowych – odbieranie
HDL. Jeśli HDL kontaktuje się z nimi (przez apoA1), wtedy komórka pozbawia się Ch
(receptor sulfonylo).

Kubinina – receptor apoA1 w nerkach – dzięki temu apoA1 podczas degradacji HDL

nie jest tracony z moczem. To samo białko (receptor), który znajduje się w jelicie krętym –
receptor dla witaminy B12.

HDL – normy europejskie – K<43mg%, M.<39mg%

- normy USA – K<35mg%, M.<35mg%

BADANIA FRAMINGHAM – wraz ze spadkiem stężenia HDL wzrasta ryzyko zgonu

wieńcowego. Wartości graniczne to <45mg% u M. i K.

BADANIA PROCAM – wraz ze spadkiem stężenia HDL wzrasta umieralność ogólna

za co odpowiedzialne są zgony wieńcowe.

MLF – wieloczynnikowe ryzyko wystąpienia CHD. Jeśli 10 z MLF to przy niskich

HDL większa umieralność niż przy 1 z MLF. Dlatego należy patrzeć na czynniki ryzyka.

U osób z obniżonym stężeniem HDL i równocześnie obniżonym tCh nie istnieje tak

duże ryzyko jak u osób z równoczesnym podwyższonym tCh.

Obniżone HDL i LDL < ryzyko niż obniżone HDL i wysokie LDL, dlatego lepiej

obniżać LDL niż podwyższać HDL.

Wskaźnik aterogenności

TCh/HDL <5, jeśli wyższe – wzrost ryzyka
(TCh-HDL)/LDL <4, tCh-HDL~LDL, dlatego im wyższy LDL/HDL tym większa liczba
zgonów i za nie są odpowiedzialne zgony pochodzenia wieńcowego. (PROCAM, Minister
Heart Study).

HDL

• im wyższy tym mniejsze przywieranie monocytów do powierzchni śródbłonka, a co za

tym idzie mniej komórek piankowatych

• w wątrobie znajduje się białko enzymatyczne paroksonaza, jest ona wbudowywana do

HDL. Hamuje ono oksydacje LDL. Im wyższe jest jego stężenie tym mniej powstaje
oxyLDL, i mniej karmy dla makrofagów. Przy danym stężeniu HDL mogą być różne
wartości tego enzymu (bo inne geny).Bada się polimorfizm kodowania paraoxynazy.

PROCAM – kamień milowy w roli TG. Przedtem uważano, iż wzrost stężenia TG jest

czynnikiem ryzyka tylko u cukrzyków, teraz uważa się, iż jest to ryzyko populacyjne. Wzrost
stężenia TG niesie za sobą wzrost umieralności ogólnej (głównie zgony wieńcowe), jednak
jeśli stężenie to przekroczy 2000mg%, zgony związane są z OZT. TG jest to heterogenna
grupa związków. VLDL i chylomikrony tworzą tzw. duże TG, których rola jest mała.
Remnanty VLDL i remnanty chylomikronów tworzą tzw. małe TG, które są wysoce
aterogenne. W związku z tym podstawowe znaczenie ma dieta pacjenta.

Chorzy na cukrzycę

U pacjentów tych rzadko dochodzi do podwyższonego stężenia tCh. Dominujące

wyniki to – obniżenie HDL, podwyższone TG, natomiast LDL w większości są w stężeniach
jak w populacji generalnej. Dlatego tutaj też badamy cały lipidogram. Gdy cukrzyca jest
niewyrównana tym większe stężenie TG i mniejsze HDL. 2 razy częściej u cukrzyków niż w
populacji generalnej TG>200mg%, HDL<35mg%.

Triada

lipidowa

Wysokie TG

Małe gęste LDL niskie HDL

Główny typ cukrzycy u 80-90% dorosłych – typ II.

Insulinooporność
Hiperinsulinemia powoduje wzrost produkcji apoB100 w komórkach wątroby,

powstają małe gęste LDL (bardzo dużo białka, mało Ch). Gdyż posiadają bardzo dużo białka,
trudniej wiążą się z receptorami, dłużej pozostają w krążeniu częściej ulegając modyfikacjom,
dzięki czemu łatwiej przylegają do ściany naczyń – wysoce aterogenne. Dodatkową ich wada
jest to, iż nie da się ich oznaczyć rutynowo. Wtedy można oznaczyć apoB100 (ELISA,
metody immunologiczne).

Małe gęste LDL

• Małe powinowactwo do receptorów

• Długi okres półtrwania

• Intensywne naciekanie ściany naczyń
• Silne wiązanie z proteoglikanami

• Przyspieszona oksydacja

• Intensywny wychwyt przez makrofagi

Oznaczanie małych gęstych LDL

Pośrednio oznaczamy poprzez obliczanie stosunku apoB100:LDL. Gdy jest on wysoki

oznacza to, że jest podwyższone stężenie małych gęstych LDL.

Bezpośrednio – wykonuje się NMR lipoprotein (MNR lipo Profile). Oznaczamy w ten

sposób nie stężenie LDL, ale stężenie cząsteczek LDL – poszczególnych modułów (7
podtypów).Na przykład 1100-1399 – duże lekkie A. Sens badania opiera się na tym, iż
przy tym samym stężeniu Ch, jest więcej cząsteczek LDL, ponieważ są one małe i więcej
ich może się zmieścić.

Panel ryzyka polega na uwzględnieniu, czy jest wzrost stężenia cząsteczek LDL oraz czy jest
aterogenna triada lipidowa.

Cele prewencji

1.) Pierwotnej

Zmniejszenie progresji miażdżycy tętnic i uzyskanie regresji
Zmniejszenie zmian ksantomatycznych
Profilaktyka OZT
Zmniejszenie zapadalności na CHD
Zmniejszenie umieralności ogólnej

2.) Wtórna

Zmniejszenie zapadalności na zawał serca
Zmniejszenie ilości zabiegów rewaskularyzacji

Leczenie hiperlipidemii

1.) Usunięcie przyczyny (hiperlipidemia wtórna)
2.) Dieta, modyfikacja stylu życia
3.) Farmakoterapia
4.) W zaburzeniach pierwotnych
- plazmafereza LDL (HELP system – przygotowanie do przeszczepu wątroby – stosuje się w
pierwotnej hipercholesterolemii o odmianie homozygotycznej). W Polsce 2-Warszawa, 1-
Kraków.
- przeszczep wątroby
- terapia

genowa

Wybór leków hipolipemizujących

• Mechanizm działania

• Skuteczność kliniczna

• Zalecenia Organizacji i Towarzystw Międzynarodowych

Leki

1.)  Inhibitory reduktazy HMG-CoA (statyny), nie wolno ich stosować u dzieci
2.)  Żywice jonowymienne – wolno u dzieci i u pacjentów z czystą hipercholesterolemią
3.) Fibraty
4.)  Kwas nikotynowy i ACIPIMOX
5.)  PROBUCOL (nie stosowany)
6.)  Inhibitory ACAT – w fazie badań
7.)  ANSAMYCYNA – w fazie badań

Adn.1.,4.)

Żywice jonowymienne i kwas nikotynowy są rzadko stosowane ze względu na dużą

ilość efektów ubocznych i często są one odstawiane w ciągu 1 roku.

Adn.1.)
Generacje
1.) Lowastatyna, Prowastatyna
2.) Simwastatyna
3.) Fluwostatyna
4.) Ceriwastatyna, Atorwastatyna

Najlepsza jest 4 generacja, cechująca się hydrofilnością, lipofilne dają koszmary

senne. Lepiej także stosować krótko działające -–Fluwostatyna, Ceriwastatyna.

Mechanizm działania

Szlak mewalonianowy

Acetylo-CoA

HMG-CoA

Reduktaza HMG-CoA statyny
Mewalonian

Ubichinon gernazylo formezylowane białka
Farnezyl
Dolichol cholesterol

•  Hamują endogenną syntezę cholesterolu całkowitego w wątrobie
•  Lepszy wychwyt LDL i remnantów VLDL (poprzez produkcję większej ilości receptorów

na powierzchni komórek wątrobowych)

• Spadek stężenia LDL z reguły o 30-35%

• Spadek stężenia VLDL nawet o 60%, ale rutynowo o 30%
• Obniżenie TG, ponieważ hamownie syntezy VLDL w wątrobie

• Rośnie synteza HDL

• Fluwostatyna rozpuszcza się w LDL i są one mniej podatne na oksydację, co powoduje

spadek ilości komórek piankowatych, a co z kolei powoduje spadek enzymów
proteolitycznych uwalnianych z tychże komórek

Efekty lecznicze

• Spadek stężenia tCh

• Spadek LDL

• Spadek TG
• Wzrost HDL przez wzrost syntezy nowych cząsteczek HDL (o kilka do kilkanaście %)

Statyny przez swój punkt uchwytu – głównie komórki wątroby

• Spadek geranylo i formylowanych białek

• Spadek ubichinonu

• Spadek dolicholu

Statyny a komórki mięśni gładkich

Statyna

wchodząc do komórek mięśni gładkich hamuje syntezę ubichinonu (blok

energii bo jest on składnikiem łańcucha oddechowego), gernazylu, fernazylu (działanie
antyproliferacyjne w leczeniu nowotworów), dolicholu (spadek wrażliwości na bodźce
wysyłane przez makrofagi). Wszystkie te działania powodują spadek proliferacji mięśni
gładkich w blaszce miażdżycowej.

Cerwistatyna, Fluwostatyna, Prawostatyna – działania antyproliferacyjne na mięśnie

gładkie.

Statyny a płytki krwi

Hamują one agregację płytek krwi i syntezę TXA (wyjątek Prawostatyna).

Statyny a glejaki

Hamowanie rozrostu nowotworu (wzmacniają działanie leków
przeciwnowotworowych). Spadek umieralności o około 30%.

Statyny a ciąża

Wnikają do komórek embrionalnych powodując poronienie.

Pozalipidowe

działanie statyn

• Plejotropowe
• Hamują proliferację mięśni gładkich

• Hamują naciek makrofagów w ścianie tętnic

• Stabilizują blaszkę miażdżycową
• Ochronny wpływ na śródbłonek (wzrost NO, prostacyklin, spadek endotelin)

• Modulacja reaktywności miocytów gładkich

• Hamowanie syntezy wolnych rodników
• Hamowanie adhezji i agregacji płytek krwi

• Hamowanie ekspresji czynników tkankowych

• Obniżenie stężenia LPL (a)

Leczenie hipolipemizujące osób normolipemicznych – aby ujawniły się pozalipidowe

działanie statyn. ABS – A- kwas acetylosalicylowy, B- β blokery, S- statyny. Leczenie po
zawale, mimo braku podwyższenia stężenia Ch. W Polsce to nie działa.

Adn.3.)

Fibraty
• Klofibrat (wycofany)

• Bezafibrat

• Fenofibrat
• Etafibrat

• Ciprofibrat

• Gemfibrozil

Mechanizm działania

• Bardzo silnie hamują syntezę TG w wątrobie co powoduje spadek VLDL

• Na LDL działają różnie – podwyższają ich stężenie, gdy wyjściowe VLDL jest bardzo

wysokie, gdy nieduże wyjściowe stężenie TG – brak lub obniżenie LDL

• Wzrost LPL (lipazy lipoproteinowej) – wtedy dochodzi do degradacji VLDL
• Wzrost HDL poprzez zahamowanie CETP, ale nie HDL w pełni funkcjonalnych

• Spadek β LDL (mechanizm zahamowania syntezy apoB100)

• Spadek ApoB 100 u pacjentów z cukrzycą i insulinoopornością
• Gwałtowne obniżenie TG – małe dawki o 30-35%, duże nawet o 60%

Działanie ogólne

• Spadek stężenia TG

• Spadek stężenia tCh
• Wzrost stężenia HDL

• Wzrost lub spadek stężenia LDL

Działanie pozalipidowe – spadek stężenia

• Fibrynogenu
• Czynnika 7

• PAI-1

• Lp(a)
• CRP (działanie przeciwzapalne)

• TNF-α (działanie przeciwzapalne)

• IL-6 (działanie przeciwzapalne)

Fenofibraty pozbawione są działania antyproliferacyjnego, podając je doustnie przy

przejściu przez wątrobę powstaje kwas fenofibrynowy, który to właśnie pozbawiony jest
działania antyproliferacyjnego. Jedynie , gdyby podać je i.v.
Działania uboczne fibratów – wzrost litogenności żółci.

TYLKO STATYNY MAJĄ DZIAŁANIE ANTYPROLIFERACYJNE NA MIĘŚNIE

GŁADKIE !!!!! (wspomagają je IKA, antagoniści wapnia)

Wybór leku – skuteczność kliniczna (EBM)

Wartość statystyczna uzyskanych wyników

Badania randomizowane kontrolne, albo metaanaliza. Aby porównać skuteczność

działania statyn i fibratów – metaanaliza (wyciąganie wniosków z 10 ślepych prób),
podwójnie ślepa próba. Metaanaliza – badania wirtualne – wyniki kilku badań podobnych
analizowanych przez komputer.

Punkty końcowe (end points)

Uzyskuje się punkty końcowe – na przykład twardy – o ile zmniejszyła się

umieralność ogólna. Jeszcze miększy choć twardy – spadek umieralności sercowo-
naczyniowej. Jeszcze miększy – zapadalność na incydenty wieńcowe; zabiegi
rewaskularyzacji. Najbardziej miękki – obniżenie LDL.

Ryzyko względne (RR)

Musi być pokazane o ile zmniejsza się ryzyko. Lek powinien być lepszy od placebo o

50%. Gorszy od plecebo – leki proarytmiczne. Placebo – leki przeciwarytmiczne.

Liczba pacjentów, która wymaga leczenia dla zapobieżenia jednemu powikłaniu (NNT –

number needed to treat).

Znamienność statystyczna różnic

4S (Simwastatyna), prewencja wtórna pacjentów z wysokim LDL. NNT 13 – trzeba leczyć 13
pacjentów, aby zmniejszyć ryzyko o 1.
-25% tCh
-35% LDL
+8 HDL
-10TG
-30% umieralności ogólnej
-20% z powodu nowotworu

AF CAPS (air force), Tex Caps (Lowastatyna)
-18% tCh
-25% LDL
-40% 1-ego zawału serca
-36% 1-ego incydentu wieńcowego
80 NNT

Helsinki Hard Study
+4% LDL
+7,5% HDL
-24,5% TG
-10% umieralność

Bip study
+15% HDL, bez efektu

Metaanaliza

badań 300 000 pacjentów.

Statyny 0,69 – redukcja 31%
Fibraty 0.89
Żywice 0,71
Niacyna 0,95
Dieta 0,97

Zalecenia American Heart Association

• Gdy wzrastają TG do 200 (400?)mg%, wtedy lekiem z międzynarodowego wyboru są

statyny

• Zarówno w prewencji pierwotnej jak i wtórnej – statyny
• Wszystko statyny

• FDA – nie stosować

W Polsce stosowany głównie fenofibrat, ponieważ statyny są droższe. W pierwszym

projekcie przy hiper TG – fibraty.

Statyny są zalecane, gdyż

• Najwyższa skuteczność w obniżaniu LDL
• Plejotropowe nielipidowe działanie

• Udowodniony spadek umieralności ogólnej i sercowo-naczyniowej

• Zalecane przez najważniejsze organizacje

• Wygodne w dawkowaniu – 1/dzień, a potem na noc – rytm dobowy

• Bezpieczne w stosowaniu
• Powikłania – miopatia –1-2‰ przypadków

• Najrzadziej odstawiane przez pacjentów, a leczenie musi być do końca życia

• Uzasadnione farmakoekonomicznie – koszty niższe od uzyskanych efektów

Priorytety terapii hipolipemicznej – na pierwszym miejscu CHD lub inne jej

manifestacje.

Monitorowanie

statyn

•  Stężenie LDL (20% w ciągu 10 lat)
•  Skuteczność – w 1 miesiącu, potem w pierwszym kwartale
- tCh
- HDL
- TG
- LDL
•  Bezpieczeństwo
-  CPK –po miesiącu i 1-szym kwartale, 10 razy norma przekroczona – odstawić. Miopatia –

na początku bezobjawowo, wzrost CPK. Trzeba być ostrożnym przy stosowaniu u
pacjentów ciężko pracujących i uprawiających sport, odstawić siłownię. Mogą rozwinąć
się bóle mięśniowe – druga forma miopatii. Trzecia forma to rabdomiopatia- ostra
niezapalna niewydolność nerek i zgon.

- Transaminazy – odstawić, gdy norma przekroczona jest 3-krotnie

Inne nielipidowe czynniki ryzyka

Lipoproteina (a)
Czynniki prooksydacyjne
Homocysteina

Leczenie hipercholesterolemii

• Do końca życia, ale trzeba powiedzieć pacjentowi, że zobaczymy za rok, a potem jeszcze

rok, po dwóch latach (przy statynach 1 rok) widać efekty kliniczne.

• Gdy odstawić po 5 latach – powrót do stanu 0

Wdrożenie leczenia

• Od razu po rozpoznaniu

• U młodszego pacjenta bardziej spada ryzyko

• Nie wdrażamy u pacjentów powyżej 80r.ż. (u 75 tak)

Zespół niskiego HDL

Czy defekt pierwotny czy objaw. Objaw zespołu metabolicznego (hiperinsulinemii,

triada lipidowa).

1998, Fibrate Consensus Group – leki z wyboru na niskie HDL, 1999 BIP – obalił.

Obecnie lekiem z wyboru są statyny, działają one antyproliferacyjnie (insulina działa
proliferacyjnie), wzrost stężenia receptorów (spadek LDL, spadek małych gęstych LDL, bo
spadek apoB100).

Lipoproteina

(a)

Działa proaterogennie. Nie u każdego oznaczamy. Zaleca się oznaczać :

U kobiet po 50r.ż., bo w wyniku menopauzy wzrasta jej stężenie, obniżać należy przez

zastosowanie hormonalnej terapii zastępczej

Pacjenci po zawale serca (PROCAM – wzrost Lp(a) w grupie kontrolnej o 15%, po

zawale o 36%)

Osoby z podwyższonym LDL

Homocysteina

• Hyperhomocysteinemia
- wrodzona
- niedobór

witamin

- przewlekła niewydolność nerek
- niewydolność nerek u osób starszych
• Mechanizm proaterogenny
- główny powód zakrzepicy
- tiolacja

apoB100

- wzrost ekspresji czynników tkankowych
- choroba

wieńcowa w młodym wieku

- krzywa proporcjonalnego przeżycia – krzywa Kaplana –Meyera, powyżej 9 mmol/l
• Oznaczanie
- zakrzepica
- przebyty

zawał

Homocysteina najbardziej obniża kwas foliowy, witaminę B6, witamina B12.

Oznaczanie czynników ryzyka miażdżycy

Markery stresu oksydacyjnego
Markery dysfunkcji śródbłonka
Rozpuszczalne formy molekuł adhezyjnych
Czynnik von Willebrandta
Asymetryczna dimetyloarginina (ADMA) – doprowadza do dysfunkcji syntazy NO,

oznaczana w cukrzycy

Markery stanu zapalnego – m.in. bialko C reaktywnego
Markery swoiste dla cukrzycy AGE (advanced glycation endproducts)

Afereza LDL (met.DALI)

• 80 ml krwi/kg m.c. jednorazowo
• Cytrynian – krótsza

• Oznaczanie Ca, K, Na

• Zapobieganie hipokalcemii – przepłukiwanie roztworami wapnia
• Skuteczność po czterech zabiegach

• Obniżenie Ch u chorych z CHD, gdy zawodzą inne metody obniżenia LDL

• Nie zmienia poziomu HDL

PROCAM – tylko mężczyźni 40-65

Zamiast amplifikować dawkę leku, wprowadzić politerapię – na przykład dwukrotna

dawka statyny – spadek większy zaledwie o 6% od dawki jednorazowej.

Pierwszy lek – statyna, do tego żywica (colestypol) przy drugiej wizycie.

Rodzinna hipercholesterolemia – dziecko – plazmafereza LDL i przygotowanie do

terapii genowej.

Kobiety po menopauzie – spada liczba receptorów przy spadku estrogenów, co

powoduje wzrost remnantow VLDL (pre beta i beta). Włączyć HTZ transdermalną, jako
wyłączenie przyczyny wtórnej. Estradiol per os – przy pierwszym przejściu wzrost VLDL.
Per os można tylko w czystej hipercholesterolemii, gdy wzrost TG tylko transdermalnie.
Monitoring wtedy nie przez LDL (bo niski), tylko przez TG i tCh.
Test

wysiłkowy u kobiet po 50 nie jest znamienny diagnostycznie (może być FD lub

FU).
Jeśli nie można HTZ to włączamy statyny (w USA – Specific Estrogen Receptor
Modulation – SERM-y).
Raloxifen

działa na kości i naczynia tylko jak estrogen.

TCh 5,2 mmol/l
TG 2,3 mmol/l
HDL 5,5 mmol/l
Glukoza 5 mmol/l

AC-inhibitory

zapobiegają nefropatii, także w cukrzycy.

Glinidy, pochodne metyloglinidów, nowa generacja. Repoglinid – stary lek. Powoduje

rzut insuliny w pierwszym piku, pulsacyjnie po jedzeniu.

TG w niedoczynności tarczycy nie są podwyższone (z tego powodu). Z

niedoczynnością tarczycy łączy się hyperhomocysteinemia.

JEŚLI JEST DUŻE RYZYKO NATYCHMIAST WŁĄCZAMY LECZENIE, JEŚLI
NIE – NAJPIERW DIAGNOSTYKA, NIE RECEPTA PRZY PIERWSZEJ WIZYCIE !!!

BIOCHEMIA

MARKERY NOWOTWOROWE

Złośliwe choroby nowotworowe

• Około 200 jednostek chorobowych

• Druga pozycja w śmiertelności (na pierwszym miejscu choroby układu sercowo-

naczyniowego

• Wzrasta tendencja do powstawania nowotworów, ważne staje się ich wczesne

wykrywanie

• Wzrost zapadalności

• Wzrost umieralności

• Wzrost wykrywalności

Wykrywanie nowotworów

1.) Wywiad – wcześniejsze rozpoznanie da tylko, gdy mamy do czynienia z nowotworem

hormonalnie czynnym (na przykład pheochromocytoma)

2.) Badanie fizykalne – j.w.
3.) Badania obrazujące
- Rtg
- TK
- USG
- NMR
4.) Badania laboratoryjne

Badania obrazujące

• Średnica > lub równa 1 cm ( może być nieuchwytna, TK – warstwa co 1 cm, mała zmiana

często trudna do odróżnienia na przykład od naczynia)

• Masa > lub równa 1 g

• Liczba komórek > lub równa 1 miliard – już poza kontrolą

Rozpoznanie

• Badania biochemiczne - ograniczenia
• Histopatologiczne i cytologiczne

• Badania cytochemiczne – określenie rodzaju komórek (w szpiku – różne białka –

limfoblastyczne i nielimfoblastyczne)

Rozpoznanie uzupełniające

• Przeciwciała monoklonalne przeciw określonym antygenom nowotworu. Ilość świecenia

– określenie typu nowotworu, liczby komórek, stosowane na przykład w raku sutka

• Markery nowotworowe, wykrycie – stwierdzenie, że jest, rozpoznanie – określenie typu i

lokalizacji, ograniczenia

Odpowiedź organizmu

1.) Swoiste parametry laboratoryjne
- markery

nowotworowe

2.)  Nieswoiste parametry laboratoryjne
a)
- występują też w innych nowotworach
-  wzrost OB.- najczęstsze
- niedokrwistość lub wzrost stężenia krwinek - najczęstsze
- morfologia
-  proteinogram - hipoproteinemia
-  hiperkalcemia ( w nowotworach i chorobach kości)
- hipokaliemia,

najczęściej spowodowana przez hiperkalcemię, która upośledza wychwyt

potasu w nerkach

b) zmiany występujące w nowotworach hormonalnie czynnych
- efekt nadmiaru hormonów (np. ACTH, kortyzol) – hipokaliemia, - hipernatremia, -

zasadowica

- stężenie hormonów – np. kalcytoniny w raku rdzeniastym tarczcy
- metabolity hormonów (w DZM)

kwas 3 – metoksy 4 – hydroksymigdałowy (MHM, kwas wanilinomigdałowy VMA),

katecholaminy – pheochromocytoma, rak rdzeniasty tarczycy, ektopowo rak
owsianokomórkowy płuc

kwas homowanilinowy (HVA), dopamina
kwas 5 hydroksyindolooctowy – serotonina (rdzeniak, srebrzak, carcinoid)

c) stężenie glukozy
- hipoglikemia

wyspiak trzustki (insulinoma, wzrost wydzielania insuliny)
guzy mezenchymalne

- hiperglikemia

glucagonoma

- normoglikemia

NSILAP (nonsupresible insuline like activit protein), białko o aktywności podobnej do

insuliny nie reagujące z przeciwciałami przeciwko insulinie, fibrosarcoma, neurofibroma

d) przeciwciała monoklonalne – szpiczak

Enzymy jako markery nowotworowe

• Fosfataza zasadowa – podobna do izoenzymu łożyskowego
• Fosfataz kwaśna - sterczowy

•  Dehydrogenaza mleczanowa
-  wzrost LDH3, mniejszy LDH2 we krwi m.in. w białaczkach
-  torbiel nerki w USG jeśli narasta może maskować nowotwór nerki, trzeba wykonać

punkcję nerki i określić aktywność LDH w płynie – jeśli jest niska, jest to tylko torbiel,
jeśli wysoka – nowotwór (30%)

Badania genetyczne

• chromosom Philadelphia
- translokacja 9:22, MLC
• translokacja 8(2,14 lub 22)
- dziecięca postać chłoniaka B-komórkowego

Markery nowotworowe

• Wielkocząsteczkowe substancje

• Wytwarzane przez komórki nowotworowe

• Obecne na ich powierzchni (do badań cytologicznych) lub uwalniane do krwiobiegu

Markery

Podział I - stary
1.) Pośrednie – zmiany w różnych chorobach nie tylko w nowotworach, są to niespecyficzne

parametry biochemiczne

2.) Bezpośrednie – zmiany tylko w nowotworach
Podział II
1.) Komórkowe – receptory dla czynników wzrostu, białka błonowe, marker ulegający

ekspresji na powierzchni komórki nowotworowej (bioptat, rozmaz krwi, szpiku)

2.) Krążące – uwolnione z komórki , w formie rozpuszczalnej
a) swoiste tylko dla nowotworu – neoantygeny
b) antygeny towarzyszące nowotworom
- antygeny

płodowo-zarodkowe (CEA, AFP)

- antygeny

łożyskowe (HCG, białko ciążowe SP-1, FA łożyskowo-podobna) – fosforylacja

alkaliczna

- antygeny wykrywane przez przeciwciała monoklonalne (Ca 19.9, Ca 50, Ca 15.3)
- inne (PSA, NSE, tPA)

Markery a etapy rozwoju komórki

•  Proliferacji, na przykład TPS – swoisty tkankowy antygen polipeptydowy - rozrost
-  synteza w końcowej fazie syntezy DNA
- stężenie we krwi koreluje z intensywnością podziałów
•  Różnicowania – masa, dojrzałość guza
-  CEA, AFP, HCG, Ca 125, Ca 19.9
- stężenie zależy od masy guza
•  Obumierania
-  TPA, CYFRA 21-1
- uwalniane

są, gdy dochodzi do nekrozy

Cechy badań wykrywających nowotwory

1.) Analityczne
- czułość
- swoistość
2.) Diagnostyczne
- czułość
- swoistość
- dodatnia

wartość predykcyjna

- ujemna

wartość predykcyjna

- krzywa ROC (receiver operating characteristic)

czułość – zdolność wykrycia rzeczywiście chorych, PD
PD/(PD+FU)
Rośnie wraz z zaawansowaniem nowotworu.
Rośnie, gdy obniżany punkt odcięcia (wartość dyskryminacyjna)
Gdy obniżamy punkt odcięcia rośnie wartość dyskryminacyjna testu.

swoistość – zdolność do wykrywania rzeczywiście zdrowych, PU
PU/(PU+FD)
Wzrasta, gdy wzrasta punkt odcięcia.

dodatnia wartość predykcyjna
PD/(PD+FD)
ujemna wartość predykcyjna
PU/(PU+FU)
krzywa ROC – zależność czułości względem swoistości, pole pod krzywą im większe tym
lepsze. Test idealny, gdy pole to >1, jeśli 0,5 – test bez wartości diagnostycznej.

PSA – swoisty antygen sterczowy

1970 – Hara i wsp., 1979 – Wang i wsp.
Glikoproteina, 237
W osoczu

- 10%

postać wolna

- 90%

związana z α-1 antytrypsyną i α-2 makroglobuliną (oba białka to białka ostrej fazy,

są one inhibitorami proteaz)

Produkowana w nabłonku kanalików stercza (też w gruczole sutkowym, śliniankach)
Funkcja

- upłynnia nasienie (proteolityczna degradacja białek formujących żel)
-  regulacja wzrostu komórek (rozkład proteolityczny białka wiążącego IGF, IGFBP)
-  wolny PSA może być efektywnym enzymem lub zymogenem
-  rola w nasieniu dodatnia, rola w osoczu -ujemna

Zakres referencyjny 0,0-4,0 ng/ml
Przyczyny

- wysokiego wzrostu stężenia – rak stercza
- mierny wzrost stężenia – gruczolak stercza (podział umowny, bo przy nowotworze

złośliwym wzrost może być umiarkowany.

Indeks PSA (PSAD, gęstość PSA) – stosunek stężenia PSA do całkowitej objętości

stercza (USG per rectum)

- wyższa czułość diagnostyczna (70-80%)
- identyczna

swoistość

Wolny/całkowity PSA

- wyższy w gruczolaku niż w raku stercza
- wskazania do oznaczania tego indeksu – gdy całkowity między 4,0-10,0 ng/ml

AFP – α fetoproteina (białko płodowe α)

1956 Bergstand, 1963 Abler, 1964 Tatarinow
Glikoproteina, dimer, 70 kD
3-7 epitopów
30% homologia z albuminami
Między albuminami a α-1 proteinami w elektroforezie
Funkcja fizjologiczna nieznana – transport KT, rola immunosupresyjna
Produkcja w

- wątrobie płodu
- komórkach

pęcherzyka żółtkowego

- przewodzie pokarmowym płodu

Okres półtrwania 5 dni
Występowanie

- krew

płodu

- płyn owodniowy
- krew

matki

Zakres referencyjny K 0,0-10,0 ng/ml, M. 0,0-12,5 ng/ml; ng/ml x 0,83= IU/ml

Przyczyny wzrostu stężenia

- znaczne – pierwotny rak wątroby, - niektóre nowotwory zarodkowe jądra i jajnika
- mierne – marskość wątroby, - żółtaczka, - zapalenie wątroby
- ciąża – maksymalne stężenie w 32Hbd

CEA – antygen karcinoembrionalny

1965 Gold, Friedman
Glikoproteina
Beta globulina
Półokres rozpadu 2-8 dni
Fizjologiczna produkcja

- przewód pokarmowy – trzustka płodu, po narodzinach produkcja ulega znacznemu

zmniejszeniu

- potem

wątroba, jelito, trzustka dorosłych – śladowa ilość

Zakres referencyjny – niepalący 0,0-3,2 ng/ml, palacze 0,0-5,8 ng/ml
Przyczyny wzrostu stężenia

- wysokie- rak jelita grubego (inne jako ciekawostka, na przykład dla żołądka brak

markerów, inne narządy mogą lecz nie muszą wydzielać CEA), - odbytnicy, - odbytu

- rzadziej – rak żołądka, - trzustki, - gruczolak, - rak płuc
- miernego – ciąża, - marskość wątroby, - zapalenie wątroby, - jelit, - płuc

Czułość wykrycia raka jelita grubego późna – u palaczy do 30%, u niepalących – powyżej

80%

Były to trzy najważniejsze markery, których normy obowiązują, pozostałe mają mniejszą
przydatność i są rzadziej oznaczane.

CA 19.9 – antygen towarzyszący nowotworom przewodu pokarmowego

Glikolipid, m.cz.36
Hapten grupy krwi Lewisa (nie ma go w grupie Lewisa ab)
Półokres trwania 7 godzin
Fizjologiczna produkcja

- nabłonek przewodu pokarmowego płodu
- u

dorosłego – gruczoły ślinowe, - oskrzela, - trzustka, - drogi żółciowe, - nabłonek

przewodu pokarmowego – ilości śladowe

Zakres referencyjny 0,0-37,0 mU/ml
Wzrost stężenia

- wysoki – nowotwory przewodu pokarmowego, - trzustki, - inne
- mierny – zapalenie trzustki, - wątroby, - dróg żółciowych, - marskość wątroby

CA 15.3 – antygen raka sutka

Mucynopodobna glikoproteina o zmiennym składzie
Nabłonek wydzielający przewodu sutkowego
Stężenie 0,0-30,0/40,0 mU/ml, sprawdzić normę dla laboratorium, gdyż istnieją różne

epitopy i różne dla nich zestawy, ponadto wartości zależą od płci , palenia papierosów.

Wzrost stężenia

- wysoki – zaawansowany rak sutka, - inne nowotwory (bardzo rzadko)
- mierny – ciąża, - niezłośliwe nowotwory sutka(kazuistyka)

CA 125 – antygen raka jajnika

Glikoproteina
Półokres trwania 2-6 dni
Produkcja

- nabłonek jam ciała, - dróg oddechowych płodu i dorosłych
- nabłonek jajowodu, trzonu i szyjki macicy

Stężenie 0,0-35,0 mU/ml lub 0,0-65,0 mU/ml
Wzrost stężenia

- wysoki – rak jajnika
- mierny – ciąża, - menstruacja, -endometrioza, - nienowotworowe choroby układy

rodnego, - marskość wątroby, - zapalenie trzustki

CA 72.4 – mucynopodobny antygen towarzyszący nowotworom

Glikoproteina
Stężenie 0,0-3,0 UI/ml
Wzrost stężenia

- nowotwory

żołądka , - rak jajnika, - niedrobnokomórkowy rak płuc (może być wzrost, ale

nie musi)

SCC – antygen ca planoepitheliale

Glikoproteina
Półokres trwania 20minut
Produkowany w dojrzałych komórkach płaskonabłonkowych
Stężenie 0,0-2,0 ng/ml
Wzrost stężenia

- raki

płaskonabłonkowe - szyjki macicy, - płuc, - głowy, - szyi

- metabolizm i usuwanie markera wpływa na jego stężenie – choroby nerek (upośledzenie

wydalania), - zapalenie płuc, - uszkodzenie wątroby (może ale nie musi)

N SE – swoista enolaza neuronowa

Enzym, dimer, m.cz.87kD
Produkcja

- komórki

nerwowe

- komórki

neuroendokrynne

- erytrocyty
- trombocyty

Stężenie 0,0-20,0 ng/ml
Wzrost stężenia

- nowotwory

układu nerwowego

- nowotwory

APUD

- rak drobnokomórkowy płuc (marker nowotworowy – nazwa)
- nienowotworowe zapalenie płuc – przewlekła niewydolność oddechowa, - wstrząs

septyczny

CYFRA 21-1 – rozpuszczalny fragment cytokeratyny 19 (kwaśne białko filamentarne)

W wielu tkankach – niespecyficzny
Stężenie 0,0-3,3 ng/ml
Wzrost stężenia

- rak

płaskonabłonkowy płuc

- nowotwory

głowy i szyi

- rak

pęcherza moczowego (po raz pierwszy)

- niewydolność nerek (spadek wydalania)
- niezłośliwe choroby płuc i wątroby

HCG – gonadotropina kosmówkowa

Glikoproteina, m.cz. 38kD
2 podjednostki α i β
Półokres trwania 12-36 godzin
Stężenie 0,0-10,0 mU/ml
Wzrost stężenia

- ciąża (maxymalnie 10-12 tygodnia)
- nowotwory zarodkowe jądra i jajnika (utkanie trofoblastu)
- chorionepithelioma
- zaśniad groniasty

Zastosowanie markerów nowotworowych

1.) Wykrywanie nowotworów
2.) Rozpoznanie nowotworów
3.) Ocena zawansowania – słabo
4.) Monitorowanie leczenia – najważniejsze

Adn.1.)

Znaczenie niewielkie, ponieważ duża część nowotworów nie wydziela markerów.

Stężenie wzrasta zazwyczaj dopiero wtedy, gdy nowotwór jest już w bardzo zaawansowanej
fazie, a wtedy znamy już wywiad, badanie fizykalne, diagnozę.

Badania przesiewowe

• Wzrost stężenia, gdy nowotwór jest już zaawansowany
• Gdy jest niejasny pacjent

•  Grupa podwyższonego ryzyka

Adn.2.) Badania pomocnicze
•  Szukanie punktu wyjścia
•  Nowotwory produkujące hormony

Adn.3.) Stężenie markera we krwi nie koreluje ze stopniem zaawansowania nowotworu – nie
jest przydatne

Adn.1.)

Badania przesiewowe w grupach wysokiego ryzyka

PSA

• M.>50

• M.>40 przy udokumentowanej predyspozycji rodzinnej

• Przed rozpoczęciem hormonalnej terapii zastępczej
• Nie zapominać o badaniu per rectum

AFP

• Zagrożenie rakiem wątroby
- osoby HBs Ag (+), (po przebyciu zakażenia HBV i HCV z długą antygenemią),

przetrwałe zapalenie wątroby

- osoby z marskością wątroby

HCG

• U K po usunięciu zaśniadu groniastego

Kalcytonina

• Oznaczanie u osób z zaawansowanym rakiem rdzeniastym tarczycy, u członków rodziny

– kalcytonina to nie jest stricte marker

Rozpoznawanie

•  PSA, PAP (izoenzym sterczowej fosfatazy kwaśnej), stężenie lub aktywność
- rak stercza
•  AFP
-  pierwotny rak wątroby
-  nowotwory zarodkowe jądra i jajnika (+HCG)
•  CA 125
- rak jajnika
•  Kalcytonina
- rak rdzeniasty tarczycy
•  Tyreoglobulina
- rak

zróżnicowany tarczycy

Kalcytonina i tyreoglobulina nie spełniają warunków markerów nowotworowych.

Dotyczą leczenia radykalnego, nie paliatywnego.

Adn.4.) Monitorowanie leczenia

Wykrycie wznowy po zabiegu operacyjnym
Ocena skuteczności operacji, chemioterapii i radioterapii
Wysoka dodatnia wartość predykcyjna dla wznowy lub przerzutów
Wzrost stężenia markera nawet rok przed manifestacja kliniczną

Ocena skuteczności leczenia

Oznaczanie przed rozpoczęciem leczenia
Regularne oznaczanie po leczeniu (radykalnym nawet przez 5 lat, późne wznowy)
Uwzględnienie półokresu rozpadu (stężenie najwcześniej po 1 T1/2)
Inny punkt odcięcia – dokładna diagnostyka, gdy zaczyna się wzrost stężenia (mimo

ciągłej normy)

Oznaczać też markery, które były przed leczeniem podwyższone

Lokalizacja nowotworowa a markery – markery do monitorowania muszą być

charakterystyczne dla konkretnych nowotworów
♦  Rak jelita grubego
- CEA
-  CEA + CA 19.9(?)
♦  Rak żołądka (brak markerów)
-  CA 72.4, CA 19.9 (norma w 1/3 do1/4 przypadków raka żołądka)

-  ewentualnie CA 72.4 + CEA
♦  Rak trzustki
- CA 19.9 (rośnie tylko w małym % raków)
♦  Rak wątroby pierwotny
-  AFP (90% raków – z komórek miąższu wątroby – ca hepatocellulare, hepatoma)
-  CA 19.9 (10% raków z komórek nabłonka przewodów wewnątrzwątrobowych dróg

żółciowych)

-  AFP + CEA (różnicowanie pomiędzy pierwotnym nowotworem a przerzutem)
-  Rak jelita grubego wykrywamy często po przerzucie w wątrobie – najczęstszy przerzut)
♦  Rak drobnokomórkowy płuca
- NSE 24-30%
♦  Rak płaskonabłonkowy płuca
- SCC 20-30%
♦  Gruczolakorak płuca
- CEA
♦  Niedrobnokomórkowy rak płuca
- CYFRA

21-1

- CEA?
- SCC?
♦  Nowotwory głowy i szyi
-  SCC – z nabłonka płaskiego
-  CEA – z nabłonka wydzielniczego, gruczołu
-  SCC + CEA (postulat)
♦  Rak sutka
-  CA 15.3 (zaawansowany)
-  CA 15.3 + CEA
♦  Rak jajnika
- CA 125

♦  Rak szyjki macicy
- SCC
-  SCC + CEA(postulat)
♦  Nowotwory zarodkowe jądra
-  AFP (ca zarodkowe, potworniaki)
- HCG

(nasieniak)

- PLAP

(łożyskopodobna FA, alkaliczna, nasieniaki)

- CEA (potworniaki z elementami gruczołowymi, niewielki wzrost do 20ng/ml, rak jelita

grubego – 3 cyfrowe)

♦ Rak stercza
- PSA

BIOCHEMIA

BIOCHEMICZNE PODSTAWY TOKSYKOLOGII. DIAGNOSTYKA LABOLATORYJNA

OSTRYCH ZATRUĆ.

Podział toksykologii

Toksykologia teoretyczna

- ogólna

- szczegółowa
- doświadczalna

Toksykologia stosowana (praktyczna)

- kliniczna
- sądowo-lekarska

Analityka toksykologiczna

Zabezpieczenie analityczne badań doświadczalnych
Diagnostyka chemiczno-toksykologiczna zatruć
Kontrola higieniczno-toksykologiczna

Trucizna – substancja, która po wprowadzeniu do organizmu wywołuje w nim

uszkodzenia, zaburzenia czynności i fizjologiczną śmierć.

Działanie toksyczne substancji zależy od dawki.

Podział dawek
• Dawka graniczna/progowa (dosis minima, DM) – ilość substancji wywołująca uchwytne

skutki biologiczne

• Dawka lecznicza (dosis therapeutica, curativa, DC) – dawka substancji wykazująca

działanie lecznicze

• Dawka toksyczna (dosis toxica, DT) – dawka wywołująca objawy zatrucia i odwracalne

zaburzenia czynności organizmu

• Dawka śmiertelna (dosis letalis, DL) – dawka wywołująca nieodwracalne uszkodzenia i w

efekcie śmierć organizmu, trudna do oceny, zmienność osobnicza

DL 50 – dawka substancji toksycznej powodująca śmierć połowy zwierząt doświadczalnych,
zmienność międzygatunkowa – ostrożnie z ocenami

Wielkość dawki – masa substancji wprowadzonej do organizmu lub masa substancji
przypadająca na jednostkę masy ciała, zazwyczaj nie wiemy jaka była dawka przyjęta,
zmienność osobnicza, tolerancja

Podział zatruć ze względu na dynamikę
• Zatrucia ostre – leki, zatrucia jatrogenne

• Zatrucia podostre

• Zatrucia przewlekłe

W zatruciach ostrych i przewlekłych – substancje kumulujące się, głównie sole metali

ciężkich.

Podział zatruć ze względu na przyczynę

• Rozmyślne – samobójcze (65%) zwykle TLPD, mordercze – łatwe do wykrycia

• Przypadkowe (32%), około 1/3, głównie leki

• Zawodowe (3%) – ciężkie przypadki, głównie zbiorowe

Substancje najczęściej wywołujące ostre zatrucia

• Leki - najczęściej

• Tlenek węgla

• Alkohol etylowy
• Pestycydy

• Rozpuszczalniki

• Substancje żrące
• Glikol

• Muchomory - najrzadziej

• Metale ciężkie - najrzadziej
• Alkohol metylowy - najrzadziej

Czynniki warunkujące toksyczność trucizn

Rozpuszczalność

- związki toxyczne są zazwyczaj bardzo dobrze rozpuszczalne w wodzie lub lipidach
- nierozpuszczalne formy substancji toksycznych są nieszkodliwe (np.PbS, BaSO4) –

podawanie soli helatujących przy zatruciu metalami ciężkimi jako leczenie

Współczynnik podziału

- określa drogi wchłaniania się substancji, gdzie głównie gromadzi się toksyna, gdzie ją
oznaczać, np., gdy głownie w lipidach – nie ma sensu oznaczać lub bez znaczenia jest
oznaczanie w osoczu

Stopień dysocjacji w roztworze

- wartość pKa substancji toksycznych warunkuje ich przemieszczanie przez błony

biologiczne, wchłanianie i wydalanie z organizmu

- formy niezjonizowane łatwiej się wchłaniają – np. niezjonizowane w żołądku –

wchłonięcie przez śluzówkę. W większym pH – forma zjonizowana – zmniejszone
wchłanianie nawet z krwi. Analogicznie w moczu – zakwaszenie – zmniejszenie resorpcji,
a nawet wydzielania

Osocze pH 7,4

Bariera lipidowa

Sok żołądkowy pH 1-2

Niezdysocjowane kwasy,
zasady

Zdysocjowane sole

Niezdysocjowane

kwasy,

zasady

Zdysocjowane sole

Właściwości fizykochemiczne

- temperatura wrzenia i parowania
- wielkość cząsteczek – substancja przechodząca przez skórę, drogi oddechowe – np.

benzyna (strażacy, ratownicy, lekarze). Duże cząstki zatrzymują się na rzęskach dróg
oddechowych – zmniejszone wchłanianie w płucach

- budowa chemiczna związku

zdolność do wiązania się z określonymi receptorami
podstawniki zmieniające wartość stałej Km i zmieniające toksyczność (np. grupy COOH-

zmniejsza, SO3H – zielone, SH – zmniejsza, OH – żółte, CH3 – czerwone, NH2, NO2,
NO, CN-, F). Hydroksylowanie – wzrost toksyczności związku, a w alkoholu – mniejsza
toksyczność a duża liczba grup OH.

obecność wiązań nienasyconych (zwiększenie hydrofilności i reaktywności)
czynniki biologiczne (wiek, płeć, stan zdrowia i odżywienia)

Wiek – bardzo wrażliwe na zatrucia są noworodki i osoby w podeszłym wieku,

podstawową rolę odgrywa tu sprawność narządów (wątroba, nerka)
- brak lub niska aktywność enzymów: glukuronylotransferazy, transferazy glutationowej,
monooksydaz, dehydrogenazy alkoholowej, cytochromu P450, hydroksylazy aniliny, N-
demetylazy etylomorfiny
- brak wystarczającej ilości substratów: zredukowanej formy glutationu, glicyny
- jedyne sprawne drogi metaboliczne u noworodków to acetylacja i sprzęganie z
siarczanami

Płeć – u mężczyzn szybszy jest metabolizm ksenobiontyków

- szybsza hydroksylacja heksobarbitalu, N-demetylacja aminofenazonu, tworzenie

glukuronidów o-aminofenolu, sprzęganie pochodnych arylowych z kwasem
glukuronowym – procesy zależne od aktywności enzymów mikrosomalnych
indukowanych między innymi androgenami

- brak

różnic np. w hydroksylacji aniliny i oksazolaminy

Stan hormonalny organizmu

- hormony tarczycy – podwyższony poziom zwiększa aktywność mikrosomalnej

dehydrogenazy i reduktazy NADPH, zmniejsza zawartość cytochromu P450, zmniejsza
zdolność do acetylacji kwasu p-aminobenzoesowego

- hormony nadnerczy – ich niedobór zmniejsza aktywność wątrobowych enzymów

mikrosomalnych zmniejszając metabolizm np. aminofenazonu i heksobarbitalu

Czynniki genetyczne

- są odpowiedzialne za swoistą toksyczność substancji u danego osobnika np. brak lub

mutacja genu pseudocholinoesterazy, niedobór reduktazy glutationowej, niedobór
glukozo-6-fosfatazy – 2 ostatnie - nasilona hemoliza krwinek po np. sulfonamidach

- ostra porfiria polekowa – wzrost ekspresji u osób wrażliwych syntetazy δ-

aminolewulinianowej po stosowaniu barbituranów i pochodnych sulfonowych

Methemoglobinemia polekowa

Acetanilid fenylohydroksylamina

Reduktaza MetHb oxyHb

Kompleks nitrobenzen + Hb + H2O2
Hb

Reduktaza MetHb

MetHb

H2O

Niedokrwistość hemolityczna

Acetanilid to produkt metabolizmu NLPZ. Problem powstaje, gdy następuje spadek

stężenia reduktazy MetHb – kumulacja MetHb – hemoliza i toksyczne działanie uwalnianej
Hb.

Wrażliwość osobnicza

- Ciąża – dla płodu jest toksyczne także to co nie jest toksyczne dla dorosłego
- choroby

wątroby – zmniejszenie biotransformacji wszystkich ksenobiontyków

ostre wirusowe zapalenie wątroby
żółtaczka zastoinowa
marskość wątroby
nowotwory wątroby

- choroby nerek – retencja toksyn i ich metabolitów na skutek upośledzenia zdolności
wydzielniczych, dobór dawki leku w oparciu o klirens kreatyniny

Metabolizm toksyn w organizmie

Absorbcja Rozmieszczenie (dystrybucja) Wydalanie

Osocze Płyn tkankowy Komórki - nerki
- płuca T R RT - płuca
-  skóra + T + - skóra
-  przewód pokarmowy B T - przewód p.

TB
Kumulacja,
Biotransformacja
T-CP

TB – substancja związana z białkami osocza – neutralna. Hemodializa – gdy

substancja znajduje się w dużej części w stanie wolnym. Stosowanie związków
konkurujących z toksyna o związanie z białkami – wzrost toksyczności. Na przykład –

kompetycja o wiązanie z białkami – wypieranie bilirubiny – groźne dla noworodków –
kernictherus.

Wchłanianie trucizn
• Skóra

• Układ pokarmowy

• Przewód pokarmowy
• Inne

Wiązanie ksenobiontyków przez białka osocza

• Albuminy – odgrywają największą rolę ze względu na:
- duże powinowactwo
- nieswoistość wiązania
- duże stężenie w osoczu

Z albuminami wiążą się: barbiturany, salicylany, sulfonamidy, streptomycyna,

tetracykliny, imipramina.
• Alfa i beta lipoproteiny – wiążą głównie substancje silnie lipofilne takie polichlorowe

insektycydy

Ksenobiontyki wiążą się z białkami zazwyczaj w sposób odwracalny przy udziale

wiązań jonowych, wodorowych i sił van der Waalsa, z wyjątkiem związków
fosforoorganicznych i alkilujących wiążących się nieodwracalnie za pomocą wiązań
kowalencyjnych.

Kompetycja o miejsce wiązania na albuminach

• Substancje o charakterze kwaśnym (salicylany, sulfonamidy, witamina K) wypierają

bilirubinę zwiększając jej stężenie w osoczu

• Substancje silniej wiążące się z albuminami wypierają substancje wiążące się słabiej np.
- sulfonamidy

wypierają tolbutamid – śpiączka hipoglikemiczna

- fenylobutazon wypiera warfarynę – zwiększenie działania przeciwzakrzepowego
- salicylany i sulfonamidy wypierają metotreksat co może spowodować nasilenie działania

toksycznego

Wydalanie toksyn

• Wydalanie z moczem
- w ten sposób wydalane są substancje dobrze rozpuszczalne w wodzie, o małej masie

cząsteczkowej: leki, związki fosforoorganiczne, fluorki, metale ciężkie

- wchłanianie zwrotne ksenobiontyków zachodzi głównie w kanaliku dalszym

alkalizacja moczu sprzyja wydalaniu substancji kwaśnych – np. zmiana pH z 6,4 do 8,0

zwiększa 4-6 razy wydalanie kwasu salicylowego

zakwaszenie moczu sprzyja wydalaniu substancji zasadowych

- wydzielanie kanalikowe (transport ten nie jest w pełni wykształcony u wcześniaków i

niemowląt)

anionów: salicylany, fenylobutazon, sulfonamidy, dinitrofenol
kationów: chinina, dihydromorfina

Wydalane są tylko zjonizowane substancje – substancje zasadowe np.LSD,

amfetamina – zmiana pH z 6,4-8,0 zwiększa nawet o 100 razy wydalanie. Wiąże się to z tym,
że zmiana pH w złą stronę powoduje zatrzymanie wydalania.

• Wydalanie z żółcią
- głównie substancje o wyższej m.cz. (300-500)
- wielopierścieniowe węglowodory aromatyczne, amitryptylina, morfina, chlorotiazyd,

strychnina, metale: mangan, organiczne połączenia rtęci, ołów, arsen

- część wydalonych w ten sposób substancji może być ponownie wchłonięta w jelitach –

można temu zapobiec stosując żywice

• Wydalanie przez płuca –głównie substancje lotne, trzeba wiedzieć, że w ten sposób

może też się substancja wchłonąć. Nie można zwiększyć wydalania. Uwaga dla lekarza –
może dojść do zatrucia wziewnego podczas udzielania pomocy.

Postępowanie przy udzielaniu pomocy

1.) Stabilizacja stanu pacjenta
- udrożnienie dróg oddechowych
- zapewnienie

wentylacji

- wydolność układu krążenia
- dokładny i częsty pomiar funkcji życiowych (temperatura, akcja serca, oddech, ciśnienie
2.) Trzeba zwrócić uwagę na zabezpieczenie personelu udzielającego pomocy – związki

fosforoorganiczne, insektycydy karbaminowe

3.) Postępowanie z pacjentem nieprzytomnym
- tlen
- 50%

dekstran

- naloxon – 2 mg lub 0,2-0,4 mg, jeśli nie istnieje wskazanie życiowe, ma on krótki

półokres trwania, dlatego należy często go podawać

-  zatrucie alkoholowe – tiamina 100mg i.v. lub i.m.
4.)  Pacjent z drgawkami
-  diazepam i.v. lub per rectum
-  TLPD – kwasica nasila ich kardiotoksyczność
-  hipoglikemia – podać glukozę
- indukowane

teofiliną – zwykle wymaga znieczulenia ogólnego

- po

zażyciu substancji paraliżujących należy zrobić EEG

-  izoniazyd – ustępuje tylko po podaniu pirydoksyny
5.) Temperatura
-  hipotermia jest często wywoływana przez barbiturany
-  hipertermia - po przedawkowaniu kokainy, amfetaminy – aspiryna, piracetam
6.) Utrzymanie prawidłowego ciśnienia i perfuzji tkanek przez wlewy krystaloidów, krwi,

substancji o działaniu presyjnym

Wykrywanie substancji wywołującej zatrucie

• W przypadku, kiedy pacjent jest przytomny – wywiad, rzadko można uzyskać przydatne

informacje

• Wywiad z rodziną i znajomymi zatrutego
- poprzednie

przedawkowania

- leki i chemikalia dostępne dla pacjenta
- przeszukanie domu, garażu w kierunku pojemników po toksycznych substancjach,

opakowania po lekach

• Kontakt z lekarzem prowadzącym pacjenta – jakie pacjent zażywał leki?
• Dokładne badanie fizykalne – daje najwięcej cennych informacji
- poszukiwanie

urazów

- badanie neurologiczne – poszukiwanie przyczyn nie związanych z zatruciem, ogniskowe

objawy neurologiczne związane np. z krwiakiem podtwardówkowym, zapalenie opon

- choroby metaboliczne i zaburzenia elektrolitowe
- poszukiwanie

śladów po wkłuciach

• Badanie fizykalne – zapach z ust
- owocowy – charakterystyczny dla ketonów i ketokwasów (zatrucie etanolem i

izopropanolem)

- benzyny
-  czosnku – arszenik, związki fosforoorganiczne
- migdałów – cyjanki
-  zepsutych jaj – disulfiram, siarkowodór
-  kleju – pochodne toluenu
•  Badania dodatkowe
-  EKG – diagnostyka zatrucia lekami wywołującymi zaburzenia rytmu, TLPD
- zdjęcia przeglądowe klatki piersiowej – obrzęk płuc
- poziom

elektrolitów

- pH krwi – kwasica metaboliczna: salicylany, metanol, glikol etylenowy, tlenek węgla,

cyjanki, siarkowodór, toluen, wypicie kwasu

Diagnostykę w/w należy przeprowadzić dopiero po zabezpieczeniu życia pacjenta.

Trzeba wiedzieć, iż zatrucie może maskować zaburzenia neurologiczne.

Laboratoryjna diagnostyka toksykologiczna

• Stosuje się w przypadku poważniejszych zatruć

• Nie jest pomocna w zatruciach ostrych ze względu na długi czas oczekiwania na wyniki

(3-8 godzin)

• Często występuje brak korelacji pomiędzy stężeniem substancji toksycznej a efektem

biologicznym

• Ryzyko wyników FD – zatrucie kilkoma substancjami, FU – pominiemy coś z dużego

panela toksyn

•  Rzadko wynik badania wpływa na zmianę decyzji klinicznej
•  Do badania należy zabezpieczyć
-  mocz w lodówce w kierunku powszechnie występujących zatruć, od razu należy go

pobrać a nie po naszych działaniach leczniczych, można zamrozić 50-100ml

- surowicę – pomiar stężeń najczęściej występujących leków, aby ją uzyskać należy pobrać

krew na skrzep

- skrzep

też jest przydatny, ponieważ część toksyn znajduje się w dużym stężeniu w

erytrocytach (substancje cytofilne)

- popłuczyny żołądkowe – nie pobierać specjalnie, ale tylko przy okazji płukania ze

wskazań leczniczych, a poza tym i tak substancje są szybko w nim wchłaniane

- należy zabezpieczyć próbki do czasu, kiedy będzie wiadomo jakie ukierunkowane badania

należy wykonać

- największe znaczenie ma diagnostyka laboratoryjna zatruć wywołanych: paracetamolem,

lekami przeciwdrgawkowymi, aspiryną, digoxyną, etanolem, glikolem etylenowym,
żelazem, izopropanolem, litem, metanolem, teofiliną

Zatrucie alkoholami

Zatrucie metanolem

Wchłanianie

- przewód

pokarmowy

- skóra
- układ pokarmowy

Zatrucie

- kumulacja mrówczanów w tkankach, głównie w oku (degeneracja siatkówki)
- ciężka kwasica metaboliczna, musi być wyrównana, aby pacjent przeżył
- formaldehyd powoduje zwyrodnienie wątroby, nerek i serca
- bóle

głowy, zmęczenie, zaburzenia widzenia

- nudności, wymioty, depresja OUN
- szybki i płytki oddech (Kusmaulla)
- spadek

ciśnienia krwi, rozszerzenie źrenic, śpiączka, obrzęk tarczy nerwu wzrokowego

- niewydolność oddechowa
- niedobór zasad <20 mmol/l

Leczenie

- etanol

początkowo wypiera 10 ml/kg 10% roztworu, następnie 0,15 ml/kg/h, tak aby

poziom etanolu w osoczu wynosił 100mg/dl (1 promil)

- dializa

Zatrucie glikolem etylenowym

Wchłanianie

- pary i aerozole z układu oddechowego
- skóra
- przewód

pokarmowy

Zatrucie

- działanie narkotyczne na OUN
- ciężka kwasica metaboliczna
- nefropatia z powodu kumulacji szczawianów
- utrata

świadomości, śpiączka

- niewydolność oddechowa, obrzęk płuc
- brak

reakcji

źrenic na światło

- zniesienie czucia bólu
- przyspieszony

oddech

- tachykardia
- leukocytoza
- oliguria, anuria, mocznica
- drgawki
- hipokalcemia na wskutek wiązania wapnia z kwasem szczawiowym

Leczenie

- takie jak w zatruciu metanolem

Zatrucie glikozydami nasercowymi

U osób z hipokaliemią <5 mmol/l podajemy potas
Zaburzenia rytmu – lidokaina, fenytoina
Przeciwciała przeciwko digoksynie, liczba ampułek 1,7x ilość mg digoksyny lub 10-20

ampułek

Zatrucie lekami antyarytmicznymi

Chinidin, disopiramid, prokainamid, amiodaron
Trudna diagnostyka
Objawy – nudności, spadek ciśnienia krwi, ból, zawroty głowy, niewydolność krążenia
Leczenie – objawowe

Zatrucie β-adrenolitykami

Zaburzenia przewodnictwa, niewydolność serca, blok A-V, spadek ciśnienia tętniczego,

zaburzenia krążenia

Odtrutka – glukagon 5-10 mg, aż do poprawienia stanu

Zatrucie blokerami kanałów wapniowych

Amlodypina
Podawanie chlorka wapniowego, trzeba jednak to zatrucie różnicować z zatruciem

digoksyną, kiedy to CaCl2 może mieć toksyczne działanie

Zatrucie diazepamem

Na początku pacjent śpi
Gorsze są późne objawy – zwyrodnienie wątroby, nerek
W lżejszych zatruciach antagonistą jest flumazenil, w cięższych – leczenie objawowe

Zatrucie związkami cyjanowymi (CN-)

Występowanie

- cyjanokobalamina
- z

cystyną

- cyjanowodory
- rodanki

ulegające szybkiemu wysyceniu, pod wpływem siarkotransferazy tiosiarczanowej

do rodanków

- przejście cystyny w kwas iminotiazoidynokarboksylowy

Działanie toksyczne

- odwracalne hamowanie oksydazy cytochromowej, główne znaczenie toksyczne
- hamowanie

aktywności innych enzymów i Hb (cyjanoHb), nie ma takiego znaczenia

Leczenie

- tlen

- leki – 2x12,5 mg tiosiarczan sodu, 2x300mg azotyn sodu, 12 amp.azotyn amylu ( ten

ostatni - wziewnie, i.v., silnie wywołuje MetHb, która ma działanie detoksykacyjne –
związanie CN i nie wiąże się on wtedy z oksydazą), hydroksykobalamina – nie jest
dostępna w Polsce, bardzo droga

BIOCHEMIA

DIAGNOSTYKA MOLEKULARNA

Metody biologii molekularnej umożliwiają poznawanie i diagnozowanie defektów

metabolicznych oraz innych schorzeń, w tym także chorób nowotworowych. Badania
molekularne opierają się o analizę DNA, które uzyskać można z każdej komórki posiadającej
jądro.

Materiały najczęściej wykorzystywane to

• krew pełna obwodowa (leukocyty)

• komórki płynu owodniowego i kosmówki

• hodowla komórek (fibroblasty, komórki nabłonka)
• cebulki włosowe

Rzadziej wykorzystuje się

• plamy krwi

• plamy nasienia
• fragmenty tkanek pobrane metodą BAC (biopsja aspiracyjna cienkoigłowa) – bioptaty

tkankowe

• szpik kostny

Wystarczy pobrać

• 0,3-1 ml krwi pełnej obwodowej na wersenian (EDTA), heparyna interferuje z

endonukleazami restrykcyjnymi

• pobiera się 2cm krwi – podciśnieniowe systemy pobierania – Vacutainer, Monoretta

• 20-30 mg tkanki

• 10 ml płynu owodniowego
• popłuczyny z jamy ustnej (10ml 4% roztworu), choroby uwarunkowane genetycznie

• 100 cząsteczek wirusa/ml³ wystarczy do PCR

Pobieranie materiału genetycznego

• DNA wyizolować bezpośrednio po pobraniu materiału genetycznego
• Przechowywanie - 4ºC – kilka miesięcy, -20ºC – wiele lat

• Jeśli szybkie wyizolowanie DNA nie jest możliwe, materiał należy zamrozić w

temperaturze -20ºC

Izolowanie DNA

• Izolowanie DNA wolnego od białek i niebiałkowych inhibitorów enzymów

•  Komercyjne zestawy (np. Master Pure)
•  Badanie stężenia i czystości próbki DNA
-  metody spektrofotometryczne (np. Gene Quant)
- metody

elektrofotometryczne

Amplifikacja

• technika PCR

• Nested PCR – gniazdowa, 2 pary primerów – większa czułość. 1 primer – powielanie

szerszego fragmentu genu, drugi – węższego.

• PCR – ASA

• RT-PCR

• PCR in situ

Przed wynalezieniem PCR – technika hybrydyzacji (N,S,W-blott). Wymagało to

obecności sond o wysokiej specyficzności. Powielanie całego genu. W PCR specyficzny jest
starter i powielany jest tylko wybrany gen 1 lub 10 milionów razy.

Powielanie uzyskanego DNA osiąga się za pomocą techniki reakcji łańcuchowej

polimerazy (PCR).

Kolejne etapy w technice PCR

pobranie materiału – krew obwodowa (na antykoagulant)
izolacja DNA
denaturacja DNA (t = 92-94 ˚C)
wiązanie starterów (fragmenty 20-nukleotydowe komplementarne do końca 3’ DNA dla

polimerazy DNA termostabilnej) w temp. 40-60 ˚C

synteza DNA (t = 72 ˚C)
sprawdzanie „czystości” uzyskanych sekwencji (elektroforeza, spektrofotometria przy

długości fali 260-280nm)

czynność 3,4,5 – cyklicznie 20-25x

Technika PCR jest wyłącznie techniką amplifikacji DNA. Nie jest ona techniką

diagnostyczną dla określenia nowych mutacji punktowych. Może ona jednak stanowić metodę
diagnostyczną np. w przypadku dużych delecji 200-300 p.z. w połączeniu z elektroforezą.

Oprócz przesiewowego (tzn. jest mutacja, ale nie znamy jej struktury) zastosowania do

wykrywania mutacji w DNA, PCR jest także techniką wstępną w sekwencjonowaniu DNA
restryktazami. Jest to wariant PCR – PCR-RFLP. Enzymy restrykcyjne rozpoznają podwójnie
symetryczne sekwencje palindromowe. Dobieramy swoiste enzymy restrykcyjne – taki
enzym, który nie rozpoznaje miejsca restrykcyjnego w dzikim genie, ale dopiero w
zmutowanym lub na odwrót.

Technika PCR-RFLP – etapy
PCR

Dwuniciowe DNA genów homologicznych

Trawienie endonukleazami restrykcyjnymi

Mapy restrykcyjne

W przypadku powstania mutacji dochodzi do zmian miejsc restrykcji w DNA, a tym

samym do zmian wzoru restrykcyjnego (np. powstanie nowych lub usunięcia wcześniej
istniejących miejsc restrykcji).

Używane w tej technice nukleazy to egzo- i endonukleazy oraz restryktazy wraz ze

swoistymi metylazami DNA. Uzyskiwane są z bakterii i sinic. Rozpoznają i przecinają
charakterystyczne dla poszczególnych fragmentów sekwencje DNA zwane sekwencjami
palindromowymi, powstają fragmenty DNA z tzw. lepkimi bądź tępymi końcami.

Przeniesienie DNA na błonę nitrocelulozową odbywa się techniką Southern blotting. Inne
techniki blottingu – Northern (użycie RNA), Western (białka).
Zastosowanie

badanie zmian struktury genu (delecje, insercje, rearanżacje)
polimorfizm restrykcyjny
badanie ekspresji genów i RNA
wykrywanie genów nie ulegających ekspresji

Etapy

Uzyskanie materiału

Izolacja DNA

Trawienie nukleazami restrykcyjnymi (mapa restrykcyjna całego dostępnego, uzyskanego od
pacjenta DNA)

Elektroforeza

Denaturacja

Blotting (transfer na nitrocelulozę)

Hybrydyzacja ze znakowaną sonda molekularną (np. izotop promieniotwórczy P)

Uwidocznienie prążków DNA po odpłukaniu nie związanego DNA

analiza

W metodzie Western blott używa się znakowanych przeciwciał zamiast sondy DNA.

Wymienione wyżej metody mają zastosowanie wtedy, gdy znamy miejsce mutacji

oraz dysponujemy odpowiednimi starterami i enzymami restrykcyjnymi. Do wykrywania
nowych mutacji służą warianty (inne) metody PCR.

1.) PCR-SSCP (polimorfizm konformacji jednoniciowego DNA)

PCR

Denaturacja DNA

DNA jednoniciowe

Elektroforeza (20˚C)

DNA przybiera określona konformację i z charakterystyczną szybkością migruje

Konformacja oraz szybkość wędrówki fragmentów DNA zależy od masy i struktury

przestrzennej tychże fragmentów. Każda mutacja zmienia szybkość wędrówki i konformację.

2.) PCR-HD (heterodupleksy DNA)

PCR

DNA dwuniciowe

Denaturacja

Hybrydyzacja przypadkowa

Elektroforeza

Brak

parowania

świadczący o wystąpieniu mutacji w DNA zmienia strukturę

cząsteczek. Powstają heterodupleksy wędrujące z inną szybkością podczas elektroforezy niż
homodupleksy.

3.) PCR-DGGE (elektroforeza w gradiencie żelu denaturującego)
PCR

Elektroforeza w gradiencie czynnika denaturującego

Wzrost gradientu czynnika denaturującego

A. im silniejsze wiązanie obu nici DNA, tym dalej wędruje w żelu denaturacyjnym
(prawidłowe, dzikie DNA)
B. mutacja w obu allelach (najszybsza denaturacja, najbardziej zmienione)
C. mutacja w jednym allelu

Inne warianty PCR

1.) ASA-PCR
- wykorzystanie starterów do reakcji PCR charakterystycznych dla DNA dzikiego lub
zmutowanego; możliwa wybiórcza amplifikacja określonego fragmentu DNA, amplifikacja
specyficzna zależna od allelu. Jeśli mamy allel zmutowany choć jednym nukleotydem to
reakcja zajdzie z allelem do zmutowanego genu, nie do dzikiego.
2.) PCR-ASO
- rozróżnienie alleli odbywa się przy użyciu sond (komplementarnych do „dzikiego” lub
„zmutowanego” produktu reakcji PCR)
3.) Odwrócone PCR
- amplifikacja fragmentu DNA o nieznanej sekwencji
4.) Wewnętrzny PCR
- wykorzystanie dwóch par starterów; druga para umieszczona wewnętrznie w stosunku do
pierwszej
5.) RT-PCR – do badania RNA, poprzedzone odwrotną transkrypcją
6.) PCR in situ – pobrać bioptat narządu, zrobić szkiełko, dodać odczynników, które

zwiększają przepuszczalność, połączenie z reakcją barwną

mRNA

rewertaza

DNA RNA kompleks

CDNA

PCR

Elektroforeza
• umożliwia uwidocznienie produktu reakcji PCR
• struktury palindromowe (wędrują do anody)

•  szybkość wędrówki zależy od
- wielkości i kształtu cząstek (zmiany przy mutacji)
- stężenia i struktury żelu
•  wzorce masy (na przykład DNA faga lambda)
•  znakowanie izotopami pierwiastków – odchodzi się od tego

• podłoża – uwidocznienie prążków
- żel agarozowy

bromek etydyny
fluorescencja w promieniach UV
ilości nanogramowe

- żel poliakrylamidowy

azotan srebra
nie wymaga UV
większa czułość 1-10 pg DNA/mm³

Zastosowanie metody PCR

I. Diagnostyka

zakażeń wirusowych, bakteryjnych, pasożytniczych

Pobieramy krew lub fragment narządu. Przeprowadzamy amplifikację z primerami

rozpoznającymi jakiś gen mikroba (np. białko otoczkowe), jeśli uzyskamy prążek –
zamplifikował się.

A. zakażenia wirusowe

• HBV; HCV; HTLV-1, 2; EBV; HDV; HEV; HSV; HIV; CMV; HPV; wścieklizna

• Najważniejsze jest zastosowanie PCR w diagnostyce, rokowaniu, proponowaniu leczenia

w przypadku zakażeń HBV, HCV.

• Diagnostyka WZWB jest przede wszystkim immunologiczna. Można jednak posłużyć się

metodą PCR.

• W przypadku zakażeń WZWC diagnostyka immunologiczna nie jest użyteczna, ponieważ

brak informacji o dynamice choroby oraz o czasie utrzymywania się przeciwciał. Wirus
ten jest RNA, stąd stosuje się RT-PCR. Dokonuje się oznaczania jakościowego (jak
HBV), ilościowego (ilość kopii wirusa na jednostkę krwi). Dokładne badanie genotypu
HCV pozwala na odpowiednie wdrożenie leczenia. Stosowanie INFα daje wyleczenie u
14-40% chorych. Niski efekt terapeutyczny związany jest ze swoistą „odpornością”
wirusa, a właściwie jego genotypów 1a i 1b na terapię INF. Pobudza on kinazę białkową
indukowaną przez RNA, w konsekwencji fosforylowane są białka przeciwwirusowe i
hamowane jest powstanie białek wirusa (tzn. białko otoczkowe E2). Wirus jest
niewrażliwy na leczenie INF ze względu na większe powinowactwo do kinazy PRK
patologicznych białek wirusów o genotypie 1a i 1b, niż białek przeciwwirusowych. Stąd
waga wykazania genotypu wirusa.

WZW B,C i D

♦ Wykrywanie wirusowego RNA (WZW C) lub DNA (WZW B i D)

♦ Monitorowanie liczby kopii RNA wirusa (WZW C), PCR ilościowe

♦ Genotypowanie wirusa (WZW C), ponieważ różnie reagują na INF α
♦ Jeżeli WZW ma przebieg objawowy, proste rozpoznanie

♦ WZW B i C – marskość, rak pierwotny wątroby, postacie bezobjawowe

♦ WZW C – największe zastosowanie, często postać bezobjawowa, można oznaczać

przeciwciała przeciwko HCV (długo pozostają), PCR

HIV

♦ Po pierwsze – wykrycie przeciwciał

♦ Potwierdzenie – Western blotting

♦ Monitorowanie leczenia, diagnostyka zakażenia – RT-PCR
♦ Wykrywanie prowirusa w komórkach jednojądrzastych krwi obwodowej metodą PCR (1

kopia /10000 do100000 komórek – diagnostyka zakażenia)

CMV – wirus cytomegalii

♦ Zakażenie wrodzone noworodków

♦ Zapalenie wątroby, zapalenie płuc, siatkówki, jelit, mózgu u chorych z AIDS lub

leczonych immunosupresją

♦ Wykrywanie DNA wirusa we krwi i PMR

B. zakażenia bakteryjne
Wykrywanie sekwencji genów bakteryjnych.

• gruźlica (gen białka MTB-64)

• borelioza

• zakażenia Clostridium difficile
• zakażenia Chlamydia trachomatis – hybrydyzacja RNA-DNA, wykrywanie DNA

patogenu we krwi i moczu metodą PCR i LCR

• zapalenie płuc – Legionella pneumophila, Mycoplasma pneumoniae, wykrywanie DNA

metodą PCR, PCR-ASO

C. pasożyty

• zakażenia Pneumocystis carini
• toxoplasmosa (Toxoplasma gondi)

• malaria (Plasmodium falciparum)

• mikrosporidioza
• rzęsistkowica (Trichomonas vaginalis)

• lamblioza (Gardia lamblia)

• czerwonka pełzakowata
• leiszmanioza
II.

Choroby o podłożu dziedzicznym – wykrywanie

A. choroby uwarunkowane genetycznie

• mukowiscydoza

• niedobór α 1-inhibitora proteaz (rozedma płuc, marskość wątroby w młodym wieku,

elastaza)

• anemia sierpowata

• rodzinna hipercholesterolemia (FH) – rozpoznanie z wywiadu i wysokości stężenia Ch

• hemofilia A i B
• hemoglobinopatie

• pląsawica Huntingtona

• dystrofia mięśniowa Duchenn’a (DMD)
• fenyloketonuria (PKU) – test Gutriego, nie ma sensu badanie molekularne

• rdzeniowa dystrofia mięśniowa

• fragile X syndrome

Ocena wzrokowa prążków.

W przypadku mukowiscydozy, choroby dziedziczonej autosomalnie recesywnie, mają

miejsce liczne mutacje (ponad 600), stąd istnieje prawdopodobieństwo uzyskania wyniku FU.
Mutacjom tym typu nonsens, przesuniecie ramki odczytu, podlega fragment chromosomu 7 (z
genem dla białka CFTR). Zaburzone może też być składanie RNA oraz składanie białka
CFTR w transporcie. Najczęstsza jest mutacja w pozycji 508 (70%), Phe 508 delecja (wypada
fenyloalanina w pozycji 508). Do wykrywania tych mutacji służy PCR-multiplex
(wykrywanie panelu mutacji). Uzyskanie wyniku + wiąże się z dużym prawdopodobieństwem
potwierdzenia choroby, wyniku – z dużym prawdopodobieństwem wykluczenia choroby.
Trzeba jednak pamiętać, iż nie wykrycie mutacji nie wyklucza choroby.

1.) Phe 508 del PCR, 98 p.z., fragment egzonu, diagnoza u 50% pacjentów

2.) PCR multiplex (np. Johnson & Johnson CF (4) m. kit)

3.) 5 najczęstszych mutacji – 75-80% rozpoznań

Podobnie postępuje się w DMD.

B. Nowotwory

•  zwłaszcza w hematologii (typ nowotworu, leczenie, rokowanie)
-  chromosom Philadelphia w przewlekłej białaczce szpikowej (PBS)
-  gen myc (tzn. mutacje w tym genie), w chłoniaku Burkitta
•  nowotwory z predyspozycją rodzinną
-  gen p-53 („strażnik genomu”)
-  gen APC – rak gruczołowy jelita grubego, polipowatość rodzinna jelita grubego
-  gen Rb – retinoblastoma
-  gen WT-1 – guz Wilmsa (nephroblastoma)
-  geny NF-1,2 – neurofibromatosis, guzy mózgu
-  gen p-16 – melanoma (postać rodzinna)
-  gen protoonkogenowy c-ret – MEN2 – mnogie endokrynne nowotwory (ryzyko

wystąpienia raka rdzeniastego tarczycy, pheochromocytoma, przerost lub gruczolak
przytarczyc)

- inne – gen BRCA-1– rak sutka, BRCA-2 - rak jajnika, - zespół Li-Fraumeni (mięsaki, rak

sutka, rak jelita grubego (p-53), - zespół von Hippol-Lindou (gen VHC), - rak prostaty –
BRCA-2

Podatność na choroby

Cały czas trzeba mieć na uwadze, że oprócz uwarunkowań genetycznych, obecne też
są uwarunkowania środowiskowe. Obecność genu nie daje 100% pewności wystąpienia
choroby. Trzeba mieć pewność, że jest to choroba dziedziczna (np. rak sutka – tylko w 5%
występuje rodzinnie, w reszcie przypadków to mutacja spontaniczna.

Wiele chorób (cukrzyca, nadciśnienie) – wielogenowość, praktycznie nie jest możliwa

diagnostyka molekularna. Cukrzyca – zmora genetyków.

Onkohematologia

Diagnostyka – wykrywanie wielu typów białaczek
Wykrywanie choroby resztkowej (MRD) – czy jeszcze po przeszczepie szpiku

zmutowane komórki

Prognozowanie

Choroba Translokacja

Gen/onkogen

Chłoniak Burkitta

t (8;14)

Myc

CML

t(9;22);chromosom

Philadelphia

chimeryczny gen BCR-ABL;
większa ekspresja – produkt –
kinaza tyrozynowa (komórka
odpowiada tak jakby cały
czas była stymulowana
czynnikiem wzrostu)

AML, ostra białaczka
szpikowa

t(3;21)

AML1, EAP, EV11

Ostra białaczka limfatyczna
T-cell

t(1,7)

LCK, TCRB

CLL

t(14;19)

BCL3, IgH

BCR-ABL – też ostre białaczki, jeśli ten gen jest – gorsza odpowiedź na leczenie.

III. Ustalanie

ojcostwa

• prawdopodobieństwo

• wykrycie polimorfizmu poza obszarem transkrypcyjnie czynnym w tzw. mikro, mini

satelitach (sekwencje VNTR); polimorfizm restrykcyjny w VNTR jest dziedziczony
zgodnie z prawami Mendla

matka dziecko ojciec

krew obwodowa

izolacja DNA

PCR

restrykcja DNA

mapy restrykcyjne

analiza – porównanie map restrykcyjnych

IV.

Identyfikacja osobnicza – tzw. DNA fingerprint

• krew

• sperma
V.

Wykrywanie chorób genetycznych uwarunkowanych wielogenowo i środowiskowo (np.
choroby układu krążenia,insulinooporność, nadciśnienie; określenie predyspozycji do
zachorowania)

A. choroby układu sercowo-naczyniowego – oznaczanie polimorfizmu dla:

• poligenowe, zależne od czynników środowiskowych – taki pacjent nie jest w zasadzie

kandydatem do diagnostyki molekularnej

• genu enzymu konwertującego (polimorfizm dotyczy tu intronu 16, a nie eksonu); możliwe

genotypy to: DD, II, ID (I – insercja, D – delecja). Konsekwencje posiadania genotypu
DD, to wzrost stężenia i aktywności ACE w surowicy. Ponadto: nadciśnienie tętnicze (I),
zawał (D), CHD (D), przerost lewej komory serca(D), kardiomiopatia przerostowa i
rozstrzeniowa (D).

• polimorfizm genu receptora AT1 (A1166CAT1R); konsekwencje kliniczne to wystąpienie

nadciśnienia u osób starych, zawał mięśnia sercowego, skurcz naczyń wieńcowych,
większa odpowiedź hipotensyjna na perindopril

• genu angiotensynogenu
• genu reniny (nadciśnienie tętnicze)

• genu syntetazy NO ( a zasadzie powtórzenie 27-nukleotydowe i polimorfizm

mikrosatelitów) – CHD, zawał, nadciśnienie tętnicze, przerost lewej komory

• E-selektyny (CHD, miażdżyca)

• genu striomielizyny 1 (CHD)

• genu apo-E – E2 hiperlipidemia typ III, E4 hiper Ch, CHD, udar mózgu, choroba

Alzheimera

• genu apo-B – hiper Ch, CHD
• genu apo(a) – (a właściwie polimorfizm dla struktur obwarzankowych), CHD

• genu LPL – hiper TG, miażdżyca tętnic

• genu reduktazy tetrahydrofolianowej – hiperhomocysteinemia (gen MTHFR, Ala 677),

CHD

• genu neuropeptydu Y – hiper Ch

• genu receptora adrenergicznego β3 – otyłość trzewna, insulinooporność

• genu receptora insulinowego (mikrosatelity) – nadciśnienie tętnicze
• genu haptoglobiny – miażdżyca tętnic, zawał, krótsze przeżycie po CABG

• genu SOD (dysmutazy ponadtlenkowej) – hiper Ch, CHD

Polimorfizm Patologia
Insercyjno-delecyjny ACE (różnice pomiędzy
populacjami)

nadciśnienie tętnicze, CHD, zawał serca,
przerost lewej komory, nasilenie zmian
miażdżycowych

Angiotensynogenu (M.(t?,czy 1)74, T235

nadciśnienie tętnicze, CHD, zawał serca,
retinopatia cukrzycowa

Apolipoproteina E (populacja fińska)

ApoE2 hiperlipidemia typu III, ApoE4 –
hipercholesterolemia

Czynnik V (czynnik V Leiden)

zakrzepica żylna, zatorowość płucna

gen reduktazy metylenotetrahydrofolianowej Hyperhomocysteinemia, CHD

Metoda bio-chip – na szkiełko podstawowe nanosi się sondy molekularne do

hybrydyzacji. Z kropli krwi można badać 7-12 tysięcy zmienności genetycznych, odczyt
laserowy. Można badać kto jest bardziej narażony – przyszłość badań nad chorobami
wielogenowymi.

B. układ krzepnięcia – polimorfizm

• genu czynnika V (Aro 506 – Glu), zakrzepica żylna, zatorowość płucna
• genu czynnika VII – wzrost jego aktywności, hiper TG, zawał serca

• fibrynogenu – G 455-A, hiperfibrynogenemia, zawał serca, udar mózgu, progresja CHD

• tromboduliny – zawał serca
• Gp III a – zawał serca, zwiększenie stenozy naczyń wieńcowych

• PAI-1 – wzrost stężenia PAI-1 – pogorszenie CHD, udar mózgu

BIOCHEMIA

TERAPIA GENOWA

Pierwsza próba kliniczna terapii genowej – Anderson, Rosenberg i wsp., 14.09.1990 –

gen ADA, (Severe Combined Immunodeficiency – SCJD).

Metoda polega na modyfikacji genetycznej komórek somatycznych, wprowadzenie

genu terapeutycznego (transgenu).

Terapia genowa ma zastosowanie w leczeniu nowotworów, infekcji wirusowych,

tworzeniu szczepionek DNA, leczeniu chorób uwarunkowanych genetycznie (na przykład
niedobór enzymu).

Korekcja mutacji

• metoda in vivo (gdy nie można usunąć komórek z organizmu, neurony)

• metoda ex vivo (komórki szpiku, skóry)

Pobranie komórki → hodowla→ podanie genu X→ komórka o niedoborze X→gen

podejmuje swoją funkcję (30%)→ prawidłowe białko jest syntezowane

Metody transferu genu terapeutycznego

• fizyczne i chemiczne
- precypitacja

CaPO4

- elektropolacja (wypalanie prądem dziurek w błonie komórkowej)
- metody biobalistyczne – kulki złota opłaszczone DNA i rozpędzone różnica potencjałów

„wstrzelane” do komórki

• wektory

wirusowe

- retrowirusy
- adenowirusy
- defektywne parwowirusy (wirusy adenosatelitarne – AAV)

niewirusowe

- liposomy anionowe i kationowe
- koniugaty

molekularne

- nagie

DNA

Retrowirusy

W terapii genowej stosowane są wirus HIV i białaczki mysiej (MnLV – gen białaczki

mysiej).
• duże prawdopodobieństwo wprowadzenia genów terapeutycznych do odpowiednich

komórek

• trwała ekspresja wprowadzonego genu (integracja z genomem)

• możliwość wyleczenia

• duża wydajność
• zależność ekspresji od podziału komórkowego (z wyjątkiem HIV)

• mała pojemność (7 k p.z.)

• mała immunogenność

• trudności techniczne – mała ilość kopii wirusa

• podstawowe niebezpieczeństwo – możliwość wystąpienia mutagenezy insercyjnej

(aktywacja protoonkogenu, inaktywacja antyonkogenu)

LTR – gen terapeutyczny, marker transkrypcji, schemat wektora retrowirusowego.

Sekwencja ta zostaje wprowadzona do genomu, gen terapeutyczny ulega ekspresji, co podlega
kontroli dzięki produktowi genu markera transkrypcji.

LTR – gag – env – pol – LTR

LTR – gen terapeutyczny (markerowy) – LTR

Powoli stwierdza się czy gen „wszedł”, zadziałał

Adenowirusy (HSV, Vaccinia)

• pozwalają na wprowadzenie genu terapeutycznego do komórki
• brak integracji z genomem (bo jest to DNA episomalny)

• ekspresja niezależna od podziału komórki

• krótkotrwała ekspresja wprowadzonego genu (CF – około 4 tygodni, złuszczony nabłonek

oskrzeli)

• małe niebezpieczeństwo transformacji

• duża immunogenność

• większa pojemność (powyżej 30 p.z.)
• duża wydajność transdukcji

• naturalne powinowactwo do nabłonka dróg oddechowych i przewodu pokarmowego

• łatwa hodowla

HSV

• tropizm do komórek nerwowych
• pojemność powyżej 20 k p.z.

• brak integracji z genomem

Defektywne parwowirusy

• wymagana koinfekcja adenowirusa
• integracja w 19q

• trwała integracja

• mała pojemność (4 k p.z.)
• brak genów wirusowych

• odwrócona powtórzona sekwencja LTR

• często – niespecyficzna integracja genu terapeutycznego

Liposomy

• tworzymy w laboratoriach

• podwójna błona lipidowa

• nadajemy im ładunek – kationowe lub anionowe
• dowolna, nieograniczona pojemność

• krótka ekspresja

• gen nie integruje z chromosomem
• brak toksyczności

• niska immunogenność

• możliwość zwiększenia specyficzności (gen dochodzi tam gdzie chcemy, a nie

przypadkowo) poprzez sprzęganie z

- przeciwciałami
- hormonami
- czynnikiem

wzrostu

- białkiem fuzjogennym F wirusa SENDAI
• kationowe wprowadzają gen terapeutyczny do makrofagów wątroby, szpiku kostnego,

śledziony

• anionowe mają dodatek gangliozydu

Koniugaty molekularne
Mają formę: plazmid – polikation (np. polilizyna) – ligand (np. przeciwciało)

Działania niepożądane w terapii genowej

• Mogą mieć związek z wektorem, z produktem genu terapeutycznego, z terapią antysensu

• Wektory retrowirusowe mogą powodować mutagenezę insercyjną, reakcje

immunologiczne (przeciw wirionom i zakażonym komórkom; wirus białaczki mysiej jest
inaktywowany przez układ dopełniacza).

• Liposomy kationowe mogą być toksyczne.

• Wirus wprowadzony z genem terapeutycznym może nabrać zdolności samodzielnej

replikacji.

• Przeciwnowotworowe działanie cytokin, zwłaszcza IL-2, której gen wprowadza się do

organizmu może być powikłane ogólnoustrojową toksycznością i reakcją zapalną.

• W terapii antysensownej może dojść do paradoksalnej aktywności genu docelowego.

Obecnie selektywnośc terapii genowej nie jest zbyt wysoka, można podnieść jej

wybiórczość przez zastosowanie

specyficznych dla różnych komórek ligandów, np. przeciwciał monoklonalnych

sprzęgniętych z genem terapeutycznym

przez zastosowanie metod chemicznych
przez wybiórczą transkrypcję genów terapeutycznych

• promotorów tkankowo-specyficznych, gen połączony ze specyficznym promotorem

aktywowanym tylko w komórkach określonej tkanki, np.

- wątroba – promotor dla albuminy
- melanocyty – tyrozynaza
- ca hepatocellulare – α fetoproteina
- rak

sutka,

żołądka, jelita grubego i cienkiego – ERBB2

- rak jelita grubego, płuca, żołądka – CEA
• promotory indukowane
- aktywowanie kwasem retinowym

wykorzystuje się też naturalne powinowactwo wirusa HIV do komórek posiadających

CD4

Korekty można dokonać w

chorobach uwarunkowanych genetycznie, są tu jednak pewne warunki

- choroba uwarunkowana jest jednogenowo, dziedziczenie recesywne
- mutacja „loss of function”
- ograniczenie

ilości komórek, których naprawa prowadzi do efektu klinicznego

- szeroki

przedział terapeutyczny

- wielkość kodującego DNA
- dostępność komórek
- brak

konieczności regulacji ekspresji genu terapeutycznego

- szeroki

przedział terapeutyczny

- ważna są także typy schorzenia – w chorobie uwarunkowanej recesywnie – wzmożenie

ekspresji genu bez eliminacji zmutowanego allelu, uwarunkowanej dominująco –
usunięcie allelu terapią antysensu

-  u heterozygot 40-50% aktywności genu wystarczy dla zachowania jego funkcji
•  mukowiscydozie
-  uzyskanie ekspresji genu CFTR w nabłonku oskrzeli
-  wziewne podawanie wektora wirusowego z genem dla CFTR
-  ekspresja w 20% komórek
- krótkotrwały efekt terapeutyczny (obrót komórkowy)
•  SCID (gen dla ADA – dezaminazy adeninowej)

• rodzinnej hipercholesterolemii – gen receptora LDL
• hemofilia A, B – gen czynników krzepnięcia

• choroba Gauchera – gen glukocerebrydazy

• DMD – gen dystrofiny
• Fenyloketonuria – gen hydroksylazy Phe

• choroby spichrzeniowe (glikogenozy, lipidozy)

nowotworach

• wprowadzenie genów samobójczych (in vivo do guza)
- wszystko polega na tym, iż do komórek nowotworowych wprowadzamy gen enzymu,

którego komórki te nie mają, następnie podajemy prolek (na przykład gancyklowir), który
jest przerabiany przez nie na cytostatyk

- metoda wprowadzania – stereotaksja, z wykorzystaniem TK
- gen kinazy tymidynowej HSV (fosforylacja acyklowiru, gancyklowiru do mono-P-

acyklowiru – gancyklowiru, następnie do tri-P-acyklowiru – gancyklowiru), wysoka
miejscowa toksyczność, niszczenie komórek nowotworowych (glejaki), także tych, do
których nie dostał się gen terapeutyczny, wpływ komórki transfekowanej na sąsiednie
(Bystender Killing Effect);

- gen dezaminazy cytozynowej (DC); 5-fluorocytozyna (nietoksyczny prolek)→CD→5-

fluorouracyl (toksyczny cytostatyk), brak BKE

- gen cytochromu p-450; cyklofosfamid, ifosfamid (nietoksyczne proleki)→p-

450→toksyczne metabolity, silny BKE, zastosowanie w białaczkach, chłoniakach

• naprawa genetyczna nowotworu
- geny

supresorowe

-  hamowanie onkogenów z użyciem terapii antysensu
•  immunomodulacja - pobudzanie odpowiedzi limfocytów Tc
-  wyizolowanie limfocytów naciekających guz, wprowadzenie ex vivo genów dla TNFα,

IL-2, ponowne wprowadzenie do organizmu – silniejszy atak

• szczepionki nowotworowe
- pobranie komórek guza→ wprowadzenie genu IL-6, sIL-6R (receptor)→naświetlanie
RTG→ wprowadzenie do organizmu
- wprowadzenie genów MHC (bardzo immunogenne)

- niektóre nowotwory mają białka odporności na cytostatyki (białka ABC) – wyrzucanie

cytostatyku poza komórki; ochrona komórek szpiku w czasie terapii cytostatykami -
wprowadzenie genu odporności wielolekowej (MDR) do komórek macierzystych szpiku,
podanie cytostatyku w większej dawce

• immunoterapia lub spadek aktywności onkogenu
- melanoma malignum – immunoterapia, terapia antysensu (HLA B7; IL-2, 4, 7, 12; INF γ;

GM-CSF; TNF;

- rak nerki (IL-2, IFN γ, MDR1)

Terapia genowa AIDS

Podstawową trudność stanowi niestabilność genetyczna HIV, co niesie za sobą
powstanie wirusów opornych. W terapii genowej AIDS stosuje się:

kompetencyjne sensowne RNA, tzw. pułapki RNA

• oligonukleotyd wiążący RNA – nie dochodzi do syntezy białek wirusa: wprowadzenie

sensownego RNA dla genów TAR i RRE, wiązanie białek Tat i Rev odpowiedzialnych za
regulacje replikacji, brak replikacji

• sensowne RNA z sygnałem pakowania (fałszywe RNA sygnalizuje przedwczesne

pakowanie, powstają wiriony defektywne)

strategia antysensu

• gen kodujący rybozym (wiązanie produktów ekspresji prowirusa, niszczenie RNA wirusa

wprowadzonego podczas infekcji)

• białka Tat i Rev - sekwencje TAR i RRE

produkcja wewnątrzkomórkowych białek przeciwwirusowych

• mutanty transdominujące hamują replikację

• wprowadzenie do komórki genu kodującego receptor CD4, wydzielanie do krwi sCD4,

wiązanie Gp 120

• wewnątrzkomórkowe jednołańcuchowe przeciwciała (specyficzne dla glikoproteiny 160,

powstają wiriony nieinfekcyjne, bez oddziaływania z CD4, bądź specyficzne dla Rev)

• eliminacja zainfekowanej komórki (gen samobójczy pod kontrolą promotora wirusowego)

• szczepionki genetyczne

Szczepionki genetyczne

szczepionki DNA
klasyczne – nie zawsze skuteczne
genetyczna modyfikacja antygenu
genetyczna modyfikacja patogenu zakaźnego
wprowadzamy gen terapeutyczny (gen patogenu) na przykład do mięśni poprzecznie

prążkowanych, antygen ten jest wychwytywany przez komórki prezentujące antygen,
następuje degradacja w lizosomach i antygen wraca na powierzchnię komórki; dłuższa
odporność i skuteczność

szczepionki klasyczne – prezentacja z MHC klasy II (prezentacja komórkom CD4)
szczepionki genowe – prezentacja z MHC klasy I (prezentacja komórkom CD8), lepsza

prezentacja m.in. w infekcjach wirusowych

Szczepionki DNA – zastosowanie praktyczne

•  infekcje
-  WZW B, C - próby
-  AIDS (Gp-120, Gp-160, Rev, Nef) - próby
-  opryszczka - próby
- grypa

(wewnętrzna nukleoproteina) - próby

- wścieklizna
-  malaria - próby
- leiszmanioza
- gruźlica (białko szoku termicznego)
•  choroby autoimmunologiczne
- SM (sclerosis multiplex), MBP (myelin basic protein, zasadowe białko mieliny)
•  nowotwory
- czerniak

złośliwy – MHC I

- rak

okrężnicy

- rak sutka - onkogen Nev

Wektory w szczepionkach DNA to układ plazmid – gen terapeutyczny – promotor;

DNA podawane jest
• i.m., s.c. w roztworach soli fizjologicznej
• kompleksy z lipidami

• kulki złota opłaszczone DNA

• aerozol donosowy

Donaczyniowy transfer genów – leczenie chorób układu krążenia

metody transferu

-  hodowle komórkowe (miocyty, śródbłonek)
-  ex vivo (przeszczepy żylne, tętnicze, śródbłonek, przydanka)
-  in vivo (cewnik z podwójnym balonem, mikroiniekcja, stenty pokryte śródbłonkiem,

polimery biodegradowane)

wektory

- retrowirusy
- adenowirusy
- AAV
- liposomy z białkami wirusa SENDAI
- kompleksy

liposom-adenowirus

- kompleks

DNA-liposom

- DNA-białko

zastosowanie w terapii

• miażdżyca tętnic, geny dla:
- VEGF – poprawa krążenia u pacjentów z miażdżycą naczyń obwodowych (tworzenie

naczyń, wzrost komórek śródbłonka)

- eNOS (syntetaza tlenku azotu), COX (cyklooksygenaza) – poprawa reaktywności

śródbłonka, wzrost syntezy PGI i NO

- gen receptora LDL
- apo-A1
- TIMP-1
- t-PA
- hamowanie

NKkβ (nuclear factor kappa-beta)

•  niedokrwienie mięśnia sercowego (gdy inne metody terapeutyczne zawiodły, CCS 4)
-  nagie DNA, igłą do mięśnia lewej komory, u 80% pacjentów z CCS 4 – CCS 2
-  VEGF (mitogen komórek śródbłonka), wzrost krążenia obocznego
-  FGF, wzrost ilości naczyń włosowatych i perfuzji mięśnia sercowego
•  restenoza

♦ hamowanie proliferacji miocytów
- HSV-tk (kinaza tymidynowa z HSV), podawanie gancyklowiru

- Rb
-  p-21 (hamowanie CPK)
-  H-ras DN (transdukcja sygnałów mitogennych – hamowanie)
-  deaminaza cytozynowa (5-fluorocytozyna)
-  oligonukleotydy antysensowne (dla czynników wzrostowych, transkrypcyjnych)
- pułapki RNA dla Nk kappa-beta
- pułapki RNA (receptor czynników wzrostowych NK kappa-beta)
♦  hamowanie procesów zakrzepowych
-  TIMP-1 (inhibitor tkankowych metaloproteinaz)
-  eNOS (wzrost syntezy NO)
-  COX (wzrost syntezy PGI)
-  rekombinowana hirudyna (inhibitor trombiny)

Leki oligonukleotydowe

20 p.z.
produkowane sztucznie
oligonukleotydy antysensowne

• oporność na działanie nukleaz: zamiana atomu 0 na atom S (tiolacja),podstawienie atomu

Se, C, N

•  transport do komórki
•  hybrydyzacja z RNA, DNA lub z białkami
- wiązanie z DNA – struktura III-o rzędowa
- wiązanie z RNA – blokada transkrypcji
- wiązanie z białkiem – zahamowanie transportu dobłonowego i dezaktywacja
-  hamowanie ekspresji genów

oligonukleotydy katalityczne

• degradacja RNA przez syntetyczne rybozymy („enzymy” zbudowane z RNA)

• zapalenie wątroby B, C – rybozymy degradujące regiony końcowe genomu

• terapia nowotworów (c-fas, BCR-ABL, H-ras)

aptamery

• wiązanie z białkami i hamowanie ich funkcji

• selektyny

• integraza HIV

Leki oligonukleotydowe – zasada doboru

oporność na działanie nukleaz: zamiana atomu O na S lub grupę metylową
optymalna długość 15-25 nukleotydów
sekwencje zależne od sekwencji docelowego mRNA (często zawierające kodon AUG)
stabilność termodynamiczna hybrydy
transport przezbłonowy

• pęcherzyki endosomalne

• liponektyna

• związki polikationowe (np. polilizyna)
• modyfikowane, ułatwiające transport 4 związki lipofilne (cholesterol, heptodekanol,

mentol)