Biochemia Żywności
BIOTECHNOLOGIA
Ćwiczenie 6
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
1
Ćwiczenie 5
Temat: CIEMNIENIE NIEENZYMATYCZNE, REAKCJA MAILLARDA.
Część teoretyczna
Podczas termicznego przetwarzania żywności, a także podczas jej długotrwałego
przechowywania zachodzą reakcje Maillarda, zwane również ciemnieniem nieenzymatycznym. Jest
to szereg złożonych przemian chemicznych zapoczątkowanych bezpośrednią reakcją pomiędzy
grupą karbonylową cukrów redukujących a grupą aminową aminokwasów lub peptydów. Proces te
prowadzi do powstawania związków odpowiedzialnych za smak, zapach oraz atrakcyjność
produktów spożywczych.
Charakter reagującego cukru, jego budowa, a także czynniki decydujące w jakiej formie
(łańcuchowej, pierścieniowej) cukry te będą występować wpływają na przebieg reakcji Maillarda i
produkty końcowe.
W latach 50-tych XX-wieku roku opracowano hipotetyczny model reakcji ciemnienia
nieenzymatycznego, składający się z trzech następujących po sobie etapów: wczesnego,
zaawansowanego i końcowego, w którym powstają melanoidyny.
Etap wczesny
związki bezbarwne, nie pochłaniające światła z zakresu nadfioletu (ok. 280 nm)
N-podstawione glukozyloaminy Produkty przegrupowania Amadori (PPA)
fruktozolizyna
laktozolizyna
fruktozoarginina
Etap zaawansowany
związki fluorescencyjne, bezbarwne bądź żółte, pochłaniające światło z zakresu ultrafioletu
związki α-dikarbonylowe AGEs (Advanced Glycation End- Products)
karboksymetylo lizyna
pentozydyna
pirralina
PPA
furfural, hydroksymetylofurfural
4-hydroksy-5-metylo-2,3-dihydrofuran-3-on
Etap końcowy
związki barwne
melanoidyny
Biochemia Żywności
BIOTECHNOLOGIA
Ćwiczenie 6
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
2
We wczesnym etapie reakcji cukier redukujący (a także różne inne aldehydy i ketony) reaguje
łatwo ze związkiem zawierającym wolną grupę aminową (aminokwas, peptyd, białko). Powstają
zasady Schiffa, a następnie N-podstawione glukozyloaminy (aldozoamina lub ketozoamina) (rys.1).
C
H
C
H
CH
C
H
C
H
C
H
2
O
OH
O
H
OH
OH
OH
CH
C
H
CH
C
H
C
H
C
H
2
O
H
OH
O
H
OH
OH
OH
NH R
C
H
C
H
CH
C
H
C
H
C
H
2
N R
OH
O
H
OH
OH
OH
R- NH
2
- H
2
O
CH
O
CH
CH
CH
C
H
NH
O
H
OH
OH
C
H
2
OH
R
aldoza
zasada Schiffa
N-podstawiona glukozyloamina
Rysunek 1.
N-podstawione glukozyloaminy ulegają przegrupowaniu Amadori tworząc produkty
przegrupowania Amadori (PPA- 1-amino-1-deoksyketoza) (rys.2) lub, w przypadku ketoz,
przegrupowaniu Heynsa dając 2-amino-2-deoksyaldozę (rys.3)
C
H
C
H
CH
C
H
C
H
C
H
2
NH
+
R
OH
O
H
OH
OH
OH
C
H
C
CH
C
H
C
H
C
H
2
OH
O
H
OH
OH
OH
NH R
C
H
2
C
CH
C
H
C
H
C
H
2
O
O
H
OH
OH
OH
NH R
CH
O
CH
CH
CH
C
H
NH
O
H
OH
OH
C
H
2
OH
R
H
+
- H
+
N-podstawiona glukozyloamina
1-amino-1-deoksyketoza
Rysunek 2.
C
H
2
C
CH
C
H
C
H
C
H
2
NH
+
O
H
OH
OH
OH
R
OH
C
H
C
CH
C
H
C
H
C
H
2
NH
O
H
OH
OH
OH
OH
R
C
H
C
H
CH
C
H
C
H
C
H
2
NH
O
H
OH
OH
OH
O
R
N-podstawiona fruktozyloamina
2-amino-2-deoksyaldoza
- H
+
H
+
O
H
O
H
OH
H
H
O
H
OH
N
H
R
Rysunek 3.
Produkt Amadori może podlegać enolizacji 1,2 lub 2,3. Enolizacja 1,2 zachodzi głównie w
warunkach łagodnych, jakie przeważają w produktach żywnościowych (rys.4)
C
H
2
C
CH
C
H
C
H
C
H
2
O
O
H
OH
OH
OH
NH R
C
H
C
CH
C
H
C
H
C
H
2
O
H
OH
OH
OH
NH R
OH
C
H
C
CH
C
H
C
H
C
H
2
OH
OH
OH
N
R
OH
C
H
C
CH
2
C
H
C
H
C
H
2
O
O
OH
OH
OH
-H
2
O
1-amino-1deoksyketoza
zasada Schiffa
-
NH
2
R
3-deoksy-2-ozuloza
+ H
2
O
Rysunek 4.
Biochemia Żywności
BIOTECHNOLOGIA
Ćwiczenie 6
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
3
Powstała 3-deoksy-2-ozuloza jest względnie stabilna w środowisku obojętnym, ulega dalszym
przemianom w środowisku zasadowym jak również kwaśnym. W środowisku kwaśnym, w wyniku
odwodnienia przechodzi w furfural (pochodna pentoz) lub hydroksymetylofurfural (pochodna
heksoz) (rys.5). 3- deoksyozuloza może tez ulegać reakcji fragmentacji. Dalsze odwodnienie
powstałego związku prowadzi do wytworzenia furanów i piroli (rys.6). 3- deoksyozulozy,
szczególnie pochodne pentozy, a także główne produkty ich degradacji są kluczowymi związkami
pośrednimi w formowaniu niskocząsteczkowych związków barwnych.
C
C
CH
2
C
H
C
H
C
H
2
O
O
OH
OH
OH
H
C
H
C
CH
CH
C
H
C
H
2
O
O
OH
OH
O
O
O
H
3-deoksy-2-ozuloza
hydroksymetylofurfural
- H
2
O
-H
2
O
Rysunek 5.
C
H
C
CH
2
C
H
C
H
C
H
2
O
O
OH
OH
OH
C
H
CH
2
C
H
C
H
C
H
2
O
OH
OH
OH
C
H
CH
CH
C
H
C
H
2
O
OH
OH
O
OH
N
R
OH
fragmentacja
dikarbonyli
-H
2
O
-H
2
O
+RNH
2
3-deoksy-2-ozuloza
2-hydroksymetylofuran
hydroksymetylopirol
-H
2
O
Rysunek 6.
2,3-enolizacja produktu Amadori prowadzi do utworzenia 1-deoksy-2,3-diulozy lub 1-amino-
1,4-dideoksy-2,3-diulozy (rys.7). Ten drugi produkt powstaje w wyniku degradacji przede
wszystkim disacharydów.
C
H
2
C
CH
C
H
C
H
C
H
2
O
O
H
OH
OH
OH
NH R
C
H
2
C
C
C
H
C
H
C
H
2
OH
OH
OH
NH R
OH
OH
CH
3
C
C
C
H
C
H
C
H
2
O
OH
OH
OH
O
C
H
2
C
C
CH
C
H
C
H
2
O
O
H
OH
OH
NH R
C
H
2
C
C
CH
2
C
H
C
H
2
O
OH
OH
NH R
O
-RNH
2
-H
2
O
1-amino-1-deoksyketoza
1-deoksy-2,3-diuloza
1- amino -1,4-dideoksy-2,3-diuloza
Rysunek 7.
Biochemia Żywności
BIOTECHNOLOGIA
Ćwiczenie 6
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
4
1-deoksy-2,3-diulozy są bardzo reaktywne. Ich dalsza degradacja prowadzi do wytworzenia
furanonów (rys.8), które są związkami zapachowymi, a ponadto prekursorami związków barwnych.
Odwodnienie 1-deoksy-2,3- diulozy w pozycji C6 prowadzi do utworzenia acetyloformoiny
(wysoce reaktywna, prekursor związków zapachowych, smakowych i barwnych). Ponadto 1-
deoksy-2,3-diulozy ulegają łatwo procesom fragmentacji, w wyniku których powstają reaktywne
związki takie jak metyloglioksal, aldehyd glicerynowy, diacetyl.
O
O
H
O
OH
O
O
H
O
O
O
H
O
H
O
O
O
H
5-metylo-4-hydroksy-2-hydroksymetylo-3 (2H)-furanon
5-metylo-4-hydroksy-3 (2H)-furanon
izomaltol
maltol
O
O
H
O
OH
acetyloformoina
Rysunek 8.
Cyklizacja i odwodnienie 1-amino-1,4-dideoksy-2,3-diulozy prowadzi do wytworzenia
aminoacetylofuranów, których przedstawicielem jest furozyna (rys.9). Aminoacetylofurany łatwo
wchodzą w reakcje oksydacji i kondensacji.
Degradacja Streckera aminokwasów (rys. 10) jest ważną przemianą prowadzącą do powstania
związków zapachowych. Podczas tej reakcji α-dikarbonyle powodują oksydacyjną dekarboksylację
aminokwasów, co prowadzi do powstania aldehydu krótszego od wyjściowego aminokwasu o jeden
atom węgla (aldehyd Streckera). Aldehydy te, szczególnie pochodne metioniny, tryptofanu,
fenyloalaniny i leucyny mają bardzo niskie progi wyczuwalności. α- dikarbonyle są przekształcane
do α- aminokarbonyli, które mogą uwalniać amoniak albo kondensować do wielu związków
heterocyklicznych, takich jak pirazyny i pirole.
O
NH
R
O
O
NH
O
NH
2
O
OH
aminoacetylofuran
furozyna
Rysunek 9.
CH
C
N
H
2
R
O
OH
C
H
C
R
1
O
O
C
H
C
R
1
O
N
CH C
O
OH
R
C
H
C
R
1
OH
N
CH
R
C
H
C
R
1
OH
NH CH OH
R
R
CHO
C
H
2
C
R
1
O
NH
2
-CO
2
-H
2
O
+H
2
O
+
+
Rysunek 10.
Biochemia Żywności
BIOTECHNOLOGIA
Ćwiczenie 6
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
5
Końcowy etap reakcji Maillarda obejmuje wiele zachodzących po sobie reakcji: cyklizację,
dehydratację i kondensację. W wyniku tego powstają barwne związki. W zależności od masy
cząsteczkowej, dzieli się je na związki niskocząsteczkowe oraz melanoidyny (o masie do 100 kDa).
Melanoidyny występują powszechnie w produktach żywnościowych, poddanych obróbce
termicznej. W dużych ilościach występują w ziarnach kawy, kakao, chlebie i miodzie. W zależności
od wyjściowych substratów mogą być związkami zbudowanymi głównie ze szkieletu
węglowodanowego z kilkoma pierścieniami nienasyconymi i związkiem azotowym lub z białka
połączonego z chromoforem. Struktura chemiczna barwników melanoidynowych nie została do
końca poznana.
(na podstawie: Michalska A., Zieliński H. (2007). Produkty reakcji Maillarda w żywności. Zywność. Nauka.
Technologia. Jakość, 2: 5-16)
Część praktyczna
Odczynniki:
0,5 M glukoza
0,5 M fruktoza
0,5 M sacharoza
0,5 M laktoza
0,5 M glicyna
0,5 M glicyna + 0,5 M glukoza
0,5 M glicyna + 0,5 M fruktoza
0,5 M glicyna + 0,5 M sacharoza
0,5 M glicyna + 0,5 M laktoza
wszystkie roztwory w buforze fosforanowym 1/15M pH 8
2M HCl
0,2M HCl
2M NaOH
0,2M NaOH
Wykonanie:
10 cm
3
0,5M roztworu glukozy w buforze fosforanowym przelać do zlewki na 25 cm
3
(zlewkę opisać). Doprowadzić pH roztworu do wartości 8,0 za pomocą 2M i 0,2M NaOH. Po
ustaleniu pH, roztwór przelać do probówki Falcona i dopełnić wodą destylowaną do 20 cm
3
,
zamieszać. Przeczytać pH otrzymanego roztworu. 10 cm
3
roztworu pobrać pipetą i wlać do opisanej
probówki.
Kolejne 10 cm
3
wyjściowego roztworu glukozy przelać do zlewki na 25 cm
3
. Doprowadzić
pH do wartości 5,0 za pomocą 2M i 0,5M HCl. Pozostałe czynności powtórzyć tak jak poprzednio.
W taki sam sposób postąpić z pozostałymi roztworami cukrów i glicyny oraz mieszaninami
cukrów z glicyną.
Uwaga:
Nie dopuścić do zanieczyszczenia danego roztworu innym roztworem. Cylinder po każdym
dopełnieniu wodą destylowaną i przelaniu roztworu do zlewki dokładnie opłukać pod bieżącą i
destylowaną wodą. Dokładnie przemywać elektrodę po każdym pomiarze pH.
Przygotowane probówki wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 30 minut. Po tym czasie
probówki wyjąć z łaźni i schłodzić.
Czytać absorbancję każdego roztworu na spektrofotometrze przy długości fali 430 nm wobec
wody destylowanej. Bardzo ciemne roztwory należy uprzednio rozcieńczyć wodą destylowaną, aby
Biochemia Żywności
BIOTECHNOLOGIA
Ćwiczenie 6
Uniwersytet Rolniczy w Krakowie
Katedra Biotechnologii Żywności
6
odczyt mieścił się w zakresie 0,1-0,8. W takich przypadkach odczytaną absorbancję należy
pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia.
Ćwiczenie 6
Założenie doświadczenia:
Marchew umyć i wysuszyć powierzchniowo (ręcznik papierowy, lignina). Odkroić koniec i
główkę korzenia, pozostałą część pokroić poprzecznie na plasterki o grubości 1- 2 mm. Plasterki
opłukać pod bieżącą wodą i osuszyć powierzchniowo. Dno pojemnika przykryć podwójną bibułą
filtracyjną, dobrze ją nawilżyć i ułożyć na niej plasterki. Warstwę plasterków przykryć bibułą
(podwójną), dobrze nawilżyć. Ułożyć w ten sposób dwie warstwy plasterków marchwi. Cały
pojemnik zapakować w folię aluminiową i opisać.