Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 6

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

1

Ćwiczenie 5

Temat: CIEMNIENIE NIEENZYMATYCZNE, REAKCJA MAILLARDA.

Część teoretyczna

Podczas termicznego przetwarzania żywności, a także podczas jej długotrwałego

przechowywania zachodzą reakcje Maillarda, zwane również ciemnieniem nieenzymatycznym. Jest
to szereg złożonych przemian chemicznych zapoczątkowanych bezpośrednią reakcją pomiędzy
grupą karbonylową cukrów redukujących a grupą aminową aminokwasów lub peptydów. Proces te
prowadzi do powstawania związków odpowiedzialnych za smak, zapach oraz atrakcyjność
produktów spożywczych.

Charakter reagującego cukru, jego budowa, a także czynniki decydujące w jakiej formie

(łańcuchowej, pierścieniowej) cukry te będą występować wpływają na przebieg reakcji Maillarda i
produkty końcowe.

W latach 50-tych XX-wieku roku opracowano hipotetyczny model reakcji ciemnienia

nieenzymatycznego, składający się z trzech następujących po sobie etapów: wczesnego,
zaawansowanego i końcowego, w którym powstają melanoidyny.

Etap wczesny

związki bezbarwne, nie pochłaniające światła z zakresu nadfioletu (ok. 280 nm)

N-podstawione glukozyloaminy Produkty przegrupowania Amadori (PPA)

fruktozolizyna

laktozolizyna

fruktozoarginina

Etap zaawansowany

związki fluorescencyjne, bezbarwne bądź żółte, pochłaniające światło z zakresu ultrafioletu

związki α-dikarbonylowe AGEs (Advanced Glycation End- Products)

karboksymetylo lizyna

pentozydyna

pirralina

PPA

furfural, hydroksymetylofurfural

4-hydroksy-5-metylo-2,3-dihydrofuran-3-on

Etap końcowy

związki barwne

melanoidyny

Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 6

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

2

We wczesnym etapie reakcji cukier redukujący (a także różne inne aldehydy i ketony) reaguje

łatwo ze związkiem zawierającym wolną grupę aminową (aminokwas, peptyd, białko). Powstają
zasady Schiffa, a następnie N-podstawione glukozyloaminy (aldozoamina lub ketozoamina) (rys.1).

C

H

C

H

CH

C

H

C

H

C

H

2

O

OH

O

H

OH

OH

OH

CH
C

H

CH

C

H

C

H

C

H

2

O

H

OH

O

H

OH

OH

OH

NH R

C

H

C

H

CH

C

H

C

H

C

H

2

N R

OH

O

H

OH

OH

OH

R- NH

2

- H

2

O

CH

O

CH

CH

CH

C

H

NH

O

H

OH

OH

C

H

2

OH

R

aldoza

zasada Schiffa

N-podstawiona glukozyloamina

Rysunek 1.

N-podstawione glukozyloaminy ulegają przegrupowaniu Amadori tworząc produkty

przegrupowania Amadori (PPA- 1-amino-1-deoksyketoza) (rys.2) lub, w przypadku ketoz,
przegrupowaniu Heynsa dając 2-amino-2-deoksyaldozę (rys.3)

C

H

C

H

CH

C

H

C

H

C

H

2

NH

+

R

OH

O

H

OH

OH

OH

C

H

C

CH

C

H

C

H

C

H

2

OH

O

H

OH

OH

OH

NH R

C

H

2

C

CH

C

H

C

H

C

H

2

O

O

H

OH

OH

OH

NH R

CH

O

CH

CH

CH

C

H

NH

O

H

OH

OH

C

H

2

OH

R

H

+

- H

+

N-podstawiona glukozyloamina

1-amino-1-deoksyketoza

Rysunek 2.

C

H

2

C

CH

C

H

C

H

C

H

2

NH

+

O

H

OH

OH

OH

R

OH

C

H

C

CH

C

H

C

H

C

H

2

NH

O

H

OH

OH

OH

OH

R

C

H

C

H

CH

C

H

C

H

C

H

2

NH

O

H

OH

OH

OH

O

R

N-podstawiona fruktozyloamina

2-amino-2-deoksyaldoza

- H

+

H

+

O

H

O

H

OH

H

H

O

H

OH

N

H

R

Rysunek 3.

Produkt Amadori może podlegać enolizacji 1,2 lub 2,3. Enolizacja 1,2 zachodzi głównie w

warunkach łagodnych, jakie przeważają w produktach żywnościowych (rys.4)

C

H

2

C

CH

C

H

C

H

C

H

2

O

O

H

OH

OH

OH

NH R

C

H

C

CH

C

H

C

H

C

H

2

O

H

OH

OH

OH

NH R

OH

C

H

C

CH

C

H

C

H

C

H

2

OH

OH

OH

N

R

OH

C

H

C

CH

2

C

H

C

H

C

H

2

O

O

OH

OH

OH

-H

2

O

1-amino-1deoksyketoza

zasada Schiffa

-

NH

2

R

3-deoksy-2-ozuloza

+ H

2

O

Rysunek 4.

Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 6

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

3

Powstała 3-deoksy-2-ozuloza jest względnie stabilna w środowisku obojętnym, ulega dalszym

przemianom w środowisku zasadowym jak również kwaśnym. W środowisku kwaśnym, w wyniku
odwodnienia przechodzi w furfural (pochodna pentoz) lub hydroksymetylofurfural (pochodna
heksoz) (rys.5). 3- deoksyozuloza może tez ulegać reakcji fragmentacji. Dalsze odwodnienie
powstałego związku prowadzi do wytworzenia furanów i piroli (rys.6). 3- deoksyozulozy,
szczególnie pochodne pentozy, a także główne produkty ich degradacji są kluczowymi związkami
pośrednimi w formowaniu niskocząsteczkowych związków barwnych.

C

C

CH

2

C

H

C

H

C

H

2

O

O

OH

OH

OH

H

C

H

C

CH

CH

C

H

C

H

2

O

O

OH

OH

O

O

O

H

3-deoksy-2-ozuloza



hydroksymetylofurfural

- H

2

O

-H

2

O

Rysunek 5.

C

H

C

CH

2

C

H

C

H

C

H

2

O

O

OH

OH

OH

C

H

CH

2

C

H

C

H

C

H

2

O

OH

OH

OH

C

H

CH

CH

C

H

C

H

2

O

OH

OH

O

OH

N

R

OH



fragmentacja

dikarbonyli

-H

2

O

-H

2

O

+RNH

2

3-deoksy-2-ozuloza

2-hydroksymetylofuran

hydroksymetylopirol

-H

2

O

Rysunek 6.

2,3-enolizacja produktu Amadori prowadzi do utworzenia 1-deoksy-2,3-diulozy lub 1-amino-

1,4-dideoksy-2,3-diulozy (rys.7). Ten drugi produkt powstaje w wyniku degradacji przede
wszystkim disacharydów.

C

H

2

C

CH

C

H

C

H

C

H

2

O

O

H

OH

OH

OH

NH R

C

H

2

C

C

C

H

C

H

C

H

2

OH

OH

OH

NH R

OH

OH

CH

3

C

C

C

H

C

H

C

H

2

O

OH

OH

OH

O

C

H

2

C

C

CH

C

H

C

H

2

O

O

H

OH

OH

NH R

C

H

2

C

C

CH

2

C

H

C

H

2

O

OH

OH

NH R

O

-RNH

2

-H

2

O

1-amino-1-deoksyketoza

1-deoksy-2,3-diuloza

1- amino -1,4-dideoksy-2,3-diuloza

Rysunek 7.

Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 6

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

4

1-deoksy-2,3-diulozy są bardzo reaktywne. Ich dalsza degradacja prowadzi do wytworzenia

furanonów (rys.8), które są związkami zapachowymi, a ponadto prekursorami związków barwnych.
Odwodnienie 1-deoksy-2,3- diulozy w pozycji C6 prowadzi do utworzenia acetyloformoiny
(wysoce reaktywna, prekursor związków zapachowych, smakowych i barwnych). Ponadto 1-
deoksy-2,3-diulozy ulegają łatwo procesom fragmentacji, w wyniku których powstają reaktywne
związki takie jak metyloglioksal, aldehyd glicerynowy, diacetyl.

O

O

H

O

OH

O

O

H

O

O

O

H

O

H

O

O

O

H

5-metylo-4-hydroksy-2-hydroksymetylo-3 (2H)-furanon

5-metylo-4-hydroksy-3 (2H)-furanon

izomaltol

maltol

O

O

H

O

OH

acetyloformoina

Rysunek 8.

Cyklizacja i odwodnienie 1-amino-1,4-dideoksy-2,3-diulozy prowadzi do wytworzenia

aminoacetylofuranów, których przedstawicielem jest furozyna (rys.9). Aminoacetylofurany łatwo
wchodzą w reakcje oksydacji i kondensacji.

Degradacja Streckera aminokwasów (rys. 10) jest ważną przemianą prowadzącą do powstania

związków zapachowych. Podczas tej reakcji α-dikarbonyle powodują oksydacyjną dekarboksylację
aminokwasów, co prowadzi do powstania aldehydu krótszego od wyjściowego aminokwasu o jeden
atom węgla (aldehyd Streckera). Aldehydy te, szczególnie pochodne metioniny, tryptofanu,
fenyloalaniny i leucyny mają bardzo niskie progi wyczuwalności. α- dikarbonyle są przekształcane
do α- aminokarbonyli, które mogą uwalniać amoniak albo kondensować do wielu związków
heterocyklicznych, takich jak pirazyny i pirole.

O

NH

R

O

O

NH

O

NH

2

O

OH

aminoacetylofuran

furozyna

Rysunek 9.

CH

C

N

H

2

R

O

OH

C

H

C

R

1

O

O

C

H

C

R

1

O

N

CH C

O

OH

R

C

H

C

R

1

OH

N

CH

R

C

H

C

R

1

OH

NH CH OH

R

R

CHO

C

H

2

C
R

1

O

NH

2

-CO

2

-H

2

O

+H

2

O

+

+

Rysunek 10.

Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 6

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

5

Końcowy etap reakcji Maillarda obejmuje wiele zachodzących po sobie reakcji: cyklizację,

dehydratację i kondensację. W wyniku tego powstają barwne związki. W zależności od masy
cząsteczkowej, dzieli się je na związki niskocząsteczkowe oraz melanoidyny (o masie do 100 kDa).

Melanoidyny występują powszechnie w produktach żywnościowych, poddanych obróbce

termicznej. W dużych ilościach występują w ziarnach kawy, kakao, chlebie i miodzie. W zależności
od wyjściowych substratów mogą być związkami zbudowanymi głównie ze szkieletu
węglowodanowego z kilkoma pierścieniami nienasyconymi i związkiem azotowym lub z białka
połączonego z chromoforem. Struktura chemiczna barwników melanoidynowych nie została do
końca poznana.

(na podstawie: Michalska A., Zieliński H. (2007). Produkty reakcji Maillarda w żywności. Zywność. Nauka.
Technologia. Jakość, 2: 5-16)

Część praktyczna

Odczynniki:
0,5 M glukoza
0,5 M fruktoza
0,5 M sacharoza
0,5 M laktoza
0,5 M glicyna

0,5 M glicyna + 0,5 M glukoza
0,5 M glicyna + 0,5 M fruktoza
0,5 M glicyna + 0,5 M sacharoza
0,5 M glicyna + 0,5 M laktoza
wszystkie roztwory w buforze fosforanowym 1/15M pH 8

2M HCl
0,2M HCl
2M NaOH
0,2M NaOH

Wykonanie:

10 cm

3

0,5M roztworu glukozy w buforze fosforanowym przelać do zlewki na 25 cm

3

(zlewkę opisać). Doprowadzić pH roztworu do wartości 8,0 za pomocą 2M i 0,2M NaOH. Po
ustaleniu pH, roztwór przelać do probówki Falcona i dopełnić wodą destylowaną do 20 cm

3

,

zamieszać. Przeczytać pH otrzymanego roztworu. 10 cm

3

roztworu pobrać pipetą i wlać do opisanej

probówki.

Kolejne 10 cm

3

wyjściowego roztworu glukozy przelać do zlewki na 25 cm

3

. Doprowadzić

pH do wartości 5,0 za pomocą 2M i 0,5M HCl. Pozostałe czynności powtórzyć tak jak poprzednio.

W taki sam sposób postąpić z pozostałymi roztworami cukrów i glicyny oraz mieszaninami

cukrów z glicyną.

Uwaga:

Nie dopuścić do zanieczyszczenia danego roztworu innym roztworem. Cylinder po każdym

dopełnieniu wodą destylowaną i przelaniu roztworu do zlewki dokładnie opłukać pod bieżącą i
destylowaną wodą. Dokładnie przemywać elektrodę po każdym pomiarze pH.

Przygotowane probówki wstawić do wrzącej łaźni wodnej na 30 minut. Po tym czasie

probówki wyjąć z łaźni i schłodzić.

Czytać absorbancję każdego roztworu na spektrofotometrze przy długości fali 430 nm wobec

wody destylowanej. Bardzo ciemne roztwory należy uprzednio rozcieńczyć wodą destylowaną, aby

Biochemia Żywności

BIOTECHNOLOGIA

Ćwiczenie 6

Uniwersytet Rolniczy w Krakowie

Katedra Biotechnologii Żywności

6

odczyt mieścił się w zakresie 0,1-0,8. W takich przypadkach odczytaną absorbancję należy
pomnożyć przez współczynnik rozcieńczenia.

Ćwiczenie 6

Założenie doświadczenia:

Marchew umyć i wysuszyć powierzchniowo (ręcznik papierowy, lignina). Odkroić koniec i

główkę korzenia, pozostałą część pokroić poprzecznie na plasterki o grubości 1- 2 mm. Plasterki
opłukać pod bieżącą wodą i osuszyć powierzchniowo. Dno pojemnika przykryć podwójną bibułą
filtracyjną, dobrze ją nawilżyć i ułożyć na niej plasterki. Warstwę plasterków przykryć bibułą
(podwójną), dobrze nawilżyć. Ułożyć w ten sposób dwie warstwy plasterków marchwi. Cały
pojemnik zapakować w folię aluminiową i opisać.