Blood Mini

zestaw do izolacji DNA z krwi

Protokół

v.0911

numery katalogowe 022-50, 022-250

01

A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, 81-451 Gdynia, Poland
tel [phone], fax [phone], www.aabiot.com, [e-mail]

Wstęp
Zestaw opiera się na zdolności wiązania się DNA do złóż krzemionkowych w wysokich

stężeniach soli chaotropowych.Krew lizowana jest w odpowiednim buforze lizującym, który

zawiera sole chaotropowe i detergenty niejonowe (bufor LT). Dodatkowo w procesie lizy
uczestniczy silna proteaza (Proteinaza K). W tych warunkach dochodzi do lizy komórek
i degradacji wszelkich białek. Następnie mieszanina nanoszona jest na minikolumnę

ze specjalnym złożem krzemionkowym. DNA przechodząc przez złoże osiada na nim,
podczas gdy zanieczyszczenia przechodzą nie zwiazane. Po wypłukaniu z kolumny resztek
zanieczyszczeń, oczyszczone DNA wymywane jest z niej niskojonowymi buforami lub wodą i
nadaje się do bezpośredniego wykorzystania bez konieczności precypitacji.

Uwagi

1. Zestaw przeznaczony jest do izolacji DNA z 0.1-1 ml krwi świeżej lub mrożonej.

Pojemność minikolumny do oczyszczania DNA wynosi 20 μg.

2. Proteinaza K znajdująca si∏ w zestawie jest roztworem gotowym do użycia, który, należy

przetrzymywać w temperaturze 2-8°C. Data ważności znajduje si∏ na etykietce.

3. Jezeli roztwór LT zawiera precypitat należy go podgrzać do temperatury 40°C w celu

całkowitego rozpuszczenia osadu przed użyciem.

Przygotowanie materiału

A. 100 μl krwi świeżej lub mrożonej

1. Pobrać do probówki 100 μl krwi świeżej lub mrożonej. W przypadku mniejszych

objętości krwi dodać buforu Tris do całkowitej objętości 100 μl .

2. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA.

B. 0.2-1 ml krwi świeżej lub mrożonej

1. Pobrać do probówki odpowiednią ilość krwi i dodać połowę objętości roztworu

lizującego erytrocyty LE (np. do 500 μl krwi dodać 250 μl roztworu LE)

2. Całość wymieszać przez odwracanie probówki, aż roztwór z mętnego zmieni się w

szkarłatnie przezroczysty.

3. Próbkę wirować trzy minuty przy 10-15 tys. RPM

4. Po wirowaniu usunąć pipetą supernatant, a do osadu stanowiącego frakcję białych

krwinek dodać 100 μl buforu Tris i dokładnie zawiesić go przez pipetowanie.

5. Przejść do punktu 1 protokołu izolacji DNA

Uwaga!

Metodę A przygotowania materiału stosować można tylko do próbek krwi świeżej i mrożonej do

odjętości 100 μl. . Do próbek krwi świeżej i mrożonej do odjętości do 1 ml należy stosować metodę B. W

przypadku większych objętości próbek krwi zalecamy zastosowanie odrębnych zestawów A&A Biotechnology:

Dla próbek o objętości 1-2 ml - Genomic Midi AX (nr. kat 895-20) zaś dla próbek 2-5 ml, Genomic Maxi AX (nr.

kat 995-10)

Protokół

v.0911

02

A&A BIOTECHNOLOGY, Aleja Zwycięstwa 96/98, 81-451 Gdynia, Poland
tel [phone], fax [phone], www.aabiot.com, [e-mail]

Protokół izolacji DNA
1. Dodać 200 μl uniwersalnego buforu lizującego LT i 20 μl Proteinazy K. Całość

wymieszać i inkubować 20 min. w temperaturze 37° C

2. Próbkę intensywnie worteksować 20 sek. i nanieść na minikolumnę do oczyszczania

genomowego DNA.

3. Wirować 1 min. przy 10-15 tys. RPM.
4. Wyjąć minikolumnę wraz z probówką i dodać 500 μl roztworu płuczącego A1.
5. Wirować 1 min. przy 10-15 tys. RPM.
6. Przenieść minikolumnę do nowej probówki 2 ml (w zestawie) i dodać do kolumny 400

μl roztworu płuczącego A1.

7. Wirować 2 min. przy 10-15 tys. RPM.
8. Osuszoną minikolumn∏ umieścić w nowej probówce 1.5 ml i dodać do niej 100 lub 200 μl

buforu Tris (10mM TRIS.HCl pH 8.5).

Uwaga!

W przypadku izolacji DNA ze 100 μl krwi należy dodać 100 μl buforu elucyjnego (Tris), Natomiast

w przypadku izolacji z większej objętości należy dodać 200 μl buforu elucyjnego.

9. Inkubować próbkę 5 min. w temperaturze pokojowej
10. Wirować 1 min. przy 10-15 tys. RPM.
11. Minikolumnę usunąć, a oczyszczone DNA znajdujące się w probówce przetrzymywać

w lodówce do czasu dalszych analiz.