24

ÂWIAT NAUKI GRUDZIE¡ 2004

ANIT

A

K

UNZ

UpoÊledzajàc prawid∏owe, synchroniczne skurcze mi´Ênia
sercowego, wzmaga równie˝ napi´cie jego zdrowych cz´Êci
i powoduje dalszà martwic´ komórek i deformacj´ Êciany ser-
ca. Ta spirala zdarzeƒ mo˝e w ciàgu zaledwie kilku miesi´cy
doprowadziç do podwojenia rozmiarów uszkodzenia.

Interwencje medyczne pomagajà coraz wi´kszej liczbie lu-

dzi prze˝yç krytyczny moment zawa∏u. Ale co najmniej jedna
trzecia z nich doÊwiadczy póêniej sta∏ego pogarszania si´
funkcji uszkodzonego mi´Ênia, co nazywamy niewydolnoÊcià
serca. Dla tych pacjentów jedynym ratunkiem jest obecnie
przeszczep – skomplikowana, droga procedura, limitowana
ogromnym niedoborem dawców. W ubieg∏ym roku na przy-
k∏ad w Stanach Zjednoczonych zdiagnozowano ponad 550 tys.
przypadków niewydolnoÊci serca, ale przeprowadzono tylko
2 tys. transplantacji. Perspektywy pozosta∏ych pacjentów sà
marne: jakoÊç ich ˝ycia stopniowo si´ pogarsza i tylko nie-
ca∏e 40% prze˝yje pi´ç lat od pierwszego ataku serca.

Gdyby lekarze umieli naprawiç zawa∏ serca lub przynaj-

mniej zatrzymaç jego ekspansj´, odmieni∏oby to ˝ycie milio-
nów ludzi. Tak wi´c skonstruowanie ∏atki z ˝ywego mi´Ênia
sercowego sta∏o si´ jednym z pilniejszych zadaƒ in˝ynierii
tkankowej. I jednym z najbardziej ambitnych. W∏ókna mi´-
Ênia sercowego muszà u∏o˝yç si´ równolegle wzgl´dem sie-
bie oraz wytworzyç po∏àczenia mechaniczne i nerwowe, aby
przewodziç sygna∏y elektryczne, które umo˝liwià im syn-
chroniczne skurcze. Skóra i chrzàstka sà mniej z∏o˝one, a
ich hodowla w laboratorium tak˝e jest prostsza, bo tkanki
te nie wymagajà wewn´trznego unaczynienia. Tymczasem
dla grubszych struktur takich jak mi´sieƒ sercowy g∏ównà
przeszkodà pozostaje znalezienie sposobu na wbudowanie
niezb´dnego uk∏adu zaopatrzenia w krew do trójwymiaro-
wego fragmentu tkanki.

Jeszcze 15 lat temu budowa jakiejkolwiek ˝ywej tkanki po-

za organizmem uwa˝ana by∏a za coÊ nieosiàgalnego. Od te-

GRUDZIE¡ 2004 ÂWIAT NAUKI

25

KLINIKA
ZNISZCZONYCH
SERC

SpecjaliÊci w dziedzinie in˝ynierii tkankowej

sà o krok od skonstruowania opatrunku

leczàcego ˝ywe ludzkie serce

Smadar Cohen i Jonathan Leor

Czas leczy serce z∏amane przez nieszcz´Êliwà mi∏oÊç, lecz uszkodzenie mi´Ênia sercowego
spowodowane zawa∏em z up∏ywem czasu zazwyczaj si´ nasila. W przeciwieƒstwie do wàtroby
czy skóry tkanka serca si´ nie regeneruje, tak wi´c blizna po zawale serca pozostaje na zawsze.

go czasu jednak biolodzy i in˝ynierowie materia∏owi poczy-
nili znaczne post´py dzi´ki zdobyczom wiedzy i nowym tech-
nikom ze swoich dyscyplin. Na przyk∏ad w naszym laborato-
rium podstawy in˝ynierii odegra∏y kluczowà rol´ w
wytworzeniu pod∏o˝a, które zach´ca komórki serca i naczy-
nia krwionoÊne do wzrostu nawet w martwej strefie zawa∏u.

Podstawy problemu

ZAWA

¸ SERCA

, potocznie zwany atakiem serca, zdarza si´ zwy-

kle, gdy g∏ówne naczynie krwionoÊne zaopatrujàce lewà ko-
mor´ serca nagle zostaje zablokowane na przyk∏ad przez za-
krzep. Cz´Êç mi´Ênia sercowego traci wtedy zaopatrzenie w
krew, a przez to równie˝ w tlen, co zabija kurczliwe komór-
ki mi´Êniowe (zwane kardiomiocytami) i pozostawia obszar
martwej tkanki. Rozmiar strefy zawa∏u zale˝y od wielkoÊci
obszaru od˝ywianego przez zatkane naczynie krwionoÊne.

Poniewa˝ komórki mi´Êniowe rzadko si´ dzielà, ocala∏e kar-

diomiocyty nie mogà namno˝yç si´ w liczbie wystarczajàcej
do zasiedlenia obszaru martwicy. Miejscowe komórki macierzy-
ste, które w innych tkankach zachowujà si´ jak komórki prekur-
sorowe, czyli wytwarzajà nowe komórki przez podzia∏, trudno
znaleêç w sercu i najwidoczniej nie potrafià same naprawiç
szkody. W konsekwencji martwe kardiomiocyty sà zast´powa-
ne przez niekurczàce si´ komórki tkanki ∏àcznej. Zdrowe mio-
cyty sàsiadujàce z zawa∏em tak˝e mogà umieraç, poszerzajàc
w ten sposób stref´ uszkodzenia. W miar´ post´pu tego pro-
cesu, zwanego przebudowà, Êciana komory serca w strefie za-
wa∏u staje si´ cieƒsza, w koƒcu si´ rozciàga [ramka na nast´p-
nej stronie] lub nawet p´ka.

W ostatnich latach naukowcy próbowali odbudowaç tkan-

k´ serca w strefie zawa∏u, przeszczepiajàc do tego obszaru
komórki macierzyste pochodzàce z innych tkanek, na przyk∏ad
szpiku kostnego czy mi´Êni szkieletowych. Nadziej´ pok∏a-
dali w tym, ˝e komórki te albo zaadaptujà si´ do otoczenia i
zacznà produkowaç nowe kardiomiocyty, albo przynajmniej
pobudzà jakàÊ naturalnà zdolnoÊç serca do regeneracji. Nie-
stety, badania kliniczne zakoƒczy∏y si´ niepowodzeniem.
Okaza∏o si´, ˝e wi´kszoÊç komórek macierzystych nie prze˝y-
wa transplantacji. Te, które prze˝ywajà, majà sk∏onnoÊç do
gromadzenia si´ na brzegach strefy zawa∏u, ale nie udaje im
si´ nawiàzaç fizycznego kontaktu z przylegajàcà zdrowà tkan-

kà ani przewodziç sygna∏u elektrycznego, który pozwala ko-
mórkom serca zsynchronizowaç skurcze.

Przeszczepione komórki nie mogà si´ rozwijaç w bliênie

pozawa∏owej, poniewa˝ zniszczony obszar pozbawiony jest
niezb´dnej naturalnej infrastruktury, która normalnie stano-
wi pod∏o˝e dla ˝yjàcych tam komórek. W zdrowej tkance ta
substancja zewnàtrzkomórkowa z∏o˝ona jest z bia∏ek struktu-
ralnych takich jak kolagen i czàsteczek z∏o˝onych cukrów
(wielocukrów) takich jak siarczan heparanu. Substancja ze-
wnàtrzkomórkowa wytwarza czynniki wzrostu

1

i stanowi fi-

zycznà podpor´ dla komórek.

In˝ynierowie tkankowi, Êwiadomi roli macierzy zewnàtrz-

komórkowej, d∏ugo poszukiwali idealnego substytutu, któ-
ry móg∏by byç rusztowaniem dla rosnàcej ˝ywej tkanki. Ta-
ki materia∏ tworzy∏by pod∏o˝e wspierajàce komórki, pozwa-
lajàc im si´ rozwijaç, dzieliç i organizowaç w trójwymiaro-

wà tkank´, podobnie jak w naturze. Rozwiàza∏oby to problem
ucieczki przeszczepianych komórek ze zbliznowaconego ob-
szaru. Ale po osiedleniu si´ i rozpocz´ciu przez te komórki
produkcji w∏asnej macierzy zewnàtrzkomórkowej, pod∏o-
˝e-rusztowanie powinno si´ roz∏o˝yç, pozostawiajàc tylko
zdrowà tkank´. Najwa˝niejsze by∏oby zaÊ, aby pod∏o˝e umo˝-
liwia∏o, a nawet pobudza∏o szybkie unaczynienie si´ nowej
tkanki. Naczynia krwionoÊne dostarczajàce tlen do komó-
rek i odprowadzajàce produkty ich przemiany materii sà wa-
runkiem przetrwania komórek po przeszczepieniu do ˝yjàce-
go gospodarza.

Pod koniec lat osiemdziesiàtych jedno z nas (Cohen) mia-

∏o przyjemnoÊç pracowaç z Robertem Langerem, pionierem
in˝ynierii tkankowej [patrz: Robert S. Langer i Joseph P.
Vacanti „Przysz∏oÊç in˝ynierii tkankowej”; Âwiat Nauki, czer-
wiec 1999], w jego laboratorium w Massachusetts Institute
of Technology. W tamtych czasach ju˝ sam pomys∏ zbudo-
wania ˝ywej tkanki wielu odrzuca∏o jako mrzonk´. Ponadto
komórki zawsze by∏y domenà biologów, a my jesteÊmy in˝y-
nierami chemikami. Ale by∏ to czas prze∏omu w obu dyscy-
plinach: biolodzy zdobywali wiedz´ o interakcjach mi´dzy
komórkami i materia∏ami, podczas gdy chemicy uczyli si´
wytwarzaç polimery nowych typów. Przez nast´pne 20 lat
in˝ynierowie tkankowi wypróbowali wiele materia∏ów, za-
równo syntetycznych, jak i naturalnych, aby stworzyç opty-
malnà platform´ wzrostu ˝ywych komórek i ich rozwoju w
funkcjonujàcà tkank´.

Najbardziej popularnymi syntetykami ulegajàcymi degra-

dacji sta∏y si´ polilaktyd – poliester cyklicznego dimeru kwa-
su mlekowego, poliglikolid – poliester dimeru kwasu gli-
kolowego

2

oraz poliester obu tych dimerów. Chocia˝ materia∏y

te okaza∏y si´ generalnie bezpieczne dla cz∏owieka, majà kilka
wad. Wi´kszoÊç z nich jest hydrofobowa, a zatem ˝ywe ko-
mórki nie mogà dobrze do nich przylegaç. Pod∏o˝e wykonane z
tych polimerów ma raczej tendencj´ do kruszenia si´ ni˝ do
powolnego rozk∏adu. KwaÊne produkty degradacji mogà wy-
wo∏ywaç miejscowy stan zapalny tkanki, jak równie˝ wp∏ywaç
na ˝ywotnoÊç przeszczepionych komórek. Wi´kszoÊci tych

26

ÂWIAT NAUKI GRUDZIE¡ 2004

n

Bliznowacenie mi´Ênia sercowego prowadzi do niewydolnoÊci

krà˝enia u milionów pacjentów po zawale, jeÊli uszkodzony
obszar nie zostanie naprawiony lub zastàpiony nowà tkankà.

n

Budowanie ˝yjàcej tkanki wymaga biologicznego rozumienia

zachowaƒ komórek i in˝ynieryjnego mistrzostwa w chemii
materia∏owej.

n

In˝ynierowie tkankowi nauczyli si´ ju˝ pobudzaç regeneracj´

mi´Ênia sercowego in vivo i czynià z tej wiedzy u˝ytek podczas
budowania sprawnego czynnoÊciowo mi´Ênia sercowego
w laboratorium.

Przeglàd /

Naprawianie serc

WSZCZEPIONE KOMÓRKI

nie mogà si´ rozwijaç w bliênie pozawa∏owej,

poniewa˝ jest ona pozbawiona niezb´dnej

NATURALNEJ INFRASTRUKTURY

.

wad nie majà nowsze syntetyczne hydro˝ele, których struktu-
ra bardzo przypomina naturalnà substancj´ zewnàtrzkomór-
kowà. Niemniej hydro˝ele pozbawione sà chemicznych
w∏aÊciwoÊci typowych dla bia∏ek naturalnej macierzy ze-
wnàtrzkomórkowej, takich jak kolagen, które dostarczajà
komórkom wa˝nych sygna∏ów dotyczàcych funkcjonowania.

Dlatego sam kolagen, a tak˝e inne bia∏ka macierzy, na przy-

k∏ad fibronektyna, by∏y testowane jako materia∏ do wytwa-
rzania pod∏o˝y. Bia∏ka te zawierajà aminokwasy, do których
˝yjàce komórki ∏atwo przylegajà, pod wzgl´dem mechanicz-
nym nie stanowià jednak wystarczajàcej podpory dla du˝ej
ich liczby, a poza tym kolagen jest wyjàtkowo szybko trawio-
ny przez enzymy wydzielane przez organizm. Dodatkowo
bia∏ka, w zale˝noÊci od pochodzenia, mogà wywo∏aç reakcj´
immunologicznà i zostaç przez organizm odrzucone. Narazi-

∏oby to pacjentów na dodatkowe niebezpieczeƒstwo i jeszcze
bardziej pogorszy∏o jakoÊç ich ˝ycia.

Z tego wzgl´du zdecydowaliÊmy si´ zbudowaç pod∏o˝e z∏o-

˝one z innego naturalnego polimeru: wielocukru zwanego
kwasem alginowym, otrzymywanego z alg

3

. Alginian jest bio-

kompatybilny, a wi´c nie wywo∏uje reakcji immunologicz-
nych. Kiedy specjalny rodzaj alginianu rozpuÊcimy w wodzie,
a nast´pnie poddamy dzia∏aniu dodatnio na∏adowanych jo-
nów wapnia, jego czàstki po∏àczà si´ krzy˝owo, przekszta∏ca-
jàc si´ w zawierajàcy 98% wody hydro˝el o galaretowatej
konsystencji i spr´˝ystych w∏aÊciwoÊciach, podobny do na-
turalnej substancji zewnàtrzkomórkowej.

Zanim u˝yliÊmy tego hydro˝elowego alginianu jako pod-

∏o˝a, musieliÊmy nadaç mu kszta∏t i wewn´trznà struktur´
oraz zwi´kszyç wytrzyma∏oÊç mechanicznà, aby bez defor-

GRUDZIE¡ 2004 ÂWIAT NAUKI

27

TERESE WINSL

OW

OD ZAWA¸U DO NIEWYDOLNOÂCI SERCA

PRZEBUDOWA KOMORY

Skurcze serca z bliznà stajà si´ nierówne jak chód cz∏owieka
z nogà w gipsie. Pozosta∏y zdrowy mi´sieƒ, aby sprostaç wzrostowi
obcià˝enia, poczàtkowo mo˝e zgrubieç. Ostatecznie jednak
przecià˝enie powoduje, ˝e obumierajà kolejne komórki serca
i ca∏a lewa komora poszerza si´, a rozciàgana Êciana serca
staje si´ coraz cieƒsza. S∏abe serce coraz gorzej radzi sobie
z pompowaniem wystarczajàcej iloÊci krwi do ca∏ego cia∏a.

FORMOWANIE SI¢ BLIZNY

W ciàgu kilku godzin lub dni enzymy w strefie zawa∏u zaczynajà
rozk∏adaç macierz zewnàtrzkomórkowà, a nap∏ywajàce makrofagi
poch∏aniajà martwe miocyty. Ich miejsce zajmujà komórki tkanki
∏àcznej. Âciana komory, poprzednio gruba i umi´Êniona, staje si´
cienka i sztywna. W miar´ jak umierajà nast´pne miocyty na granicy
uszkodzonego obszaru, zawa∏ mo˝e si´ powi´kszaç, w ciàgu
kilku miesi´cy podwajajàc swój rozmiar.

OSTRA FAZA ZAWA¸U SERCA

Kiedy naczynie krwionoÊne zaopatrujàce mi´sieƒ sercowy zostaje
zablokowane, miocyty umierajà z powodu niedostatku tlenu.
Powstajàcy obszar martwej tkanki mi´Êniowej zwany jest zawa∏em.

ZDROWE SERCE

Lewa komora serca pompuje Êwie˝o utlenowanà krew do reszty cia∏a,
a jej Êciany sà grube, zbudowane z w∏ókien mi´Êniowych zwanych
miocytami.

POZAWA¸OWA NIEWYDOLNOÂå SERCA mo˝e byç wynikiem masywnej martwicy tkanki w czasie
zawa∏u, ale cz´Êciej jest spowodowana stopniowà przebudowà Êciany narzàdu.

P∏aszczyzna przekroju poprzecznego

Lewa komora serca

Zawa∏

Fibroblast

Zdrowe
w∏ókna mi´Êniowe

Makrofag

W∏ókna kolagenowe

Poszerzona komora

28

ÂWIAT NAUKI GRUDZIE¡ 2004

LILIA SHAPIRO I SMADAR COHEN

Uniwersytet Ben Guriona

(na gór

ze z lewej

); MICHAL SHACHAR

, RONIT BASHER I SMADAR COHEN

Uniwersytet Ben Guriona

(na gór

ze z prawej

); S. ZMORA I IN.;

Biomaterials

, tom 23, 2002 rok,

OPUBLIK

OW

ANO ZA ZGODÑ ELSEVIER

, SHARON ZMORY I SMADAR COHEN

Uniwersytet Ben Guriona

(tr

zy zdj´cia z lewej

); SIGALIT AMIT

A

Y

-SHAPRUT I SMADAR COHEN

Uniwersytet Ben Guriona

(na dole z prawej)

POD¸O˚A sà dla ˝yjàcych komórek fizycznà pod-
porà i informacjà, jak organizowaç si´ w tkank´.
Najlepiej, jeÊli sk∏adajà si´ z bardzo g´sto po-
∏àczonych porów o rozmiarach co najmniej
200

µm (Êrednia wielkoÊç krwionoÊnego naczynia

w∏osowatego), aby umo˝liwiç wrastanie naczyƒ
krwionoÊnych i interakcje mi´dzy komórkami.

Na materia∏ pod∏o˝a wybraliÊmy alginian, sub-

stancj´ otrzymanà z alg, ze wzgl´du na jej che-
miczne podobieƒstwo do naturalnej macierzy
zewnàtrzkomórkowej. Ale musieliÊmy znaleêç
sposób, aby kleisty wodny roztwór alginianu prze-
kszta∏ciç w pod∏o˝e sta∏e, którego kszta∏t (blisko
z prawej) i wewn´trzna architektura (dalej z pra-
wej) mog∏yby byç dok∏adnie kontrolowane.

Wiedzàc, ˝e woda obecna w naszym alginianowym hydro˝elu uformowa∏aby podczas mro˝enia kryszta∏ki lodu i ˝e ró˝ne

metody ch∏odzenia mogà zasadniczo wp∏ywaç na kszta∏t kryszta∏ów, eksperymentowaliÊmy z ró˝nymi technikami mro˝enia-su-
szenia. Tak jak si´ spodziewaliÊmy, mro˝enie hydro˝elu powodowa∏o, ˝e tworzy∏ on struktur´ podobnà do gàbki, z kryszta∏ka-
mi lodu oddzielonymi od siebie cienkimi Êciankami alginianu. Po sublimacji kryszta∏ów lodu pozosta∏y pory o ró˝nych kszta∏-
tach, rozmiarach i po∏o˝eniu, odzwierciedlajàce szybkoÊç i kierunek wzrostu kryszta∏ów, w miar´ jak roztwór alginianu ulega∏
sch∏adzaniu (na dole).

KONSTRUOWANIE POD¸O˚A DLA TKANKI

ARCHITEKTURA PORÓW

Nasza zdolnoÊç do planowania
i kontrolowania architektury pod∏o˝a
technikami mro˝enia jest tak wa˝na,
poniewa˝ struktura porów ma zasadniczy
wp∏yw na funkcj´ formujàcej si´ tkanki.
Na przyk∏ad wyd∏u˝one pory mogà sprzyjaç
tworzeniu si´ naczyƒ krwionoÊnych. Kiedy
u˝yliÊmy ciek∏ego azotu, aby wytworzyç
pod∏o˝e z d∏ugimi wewn´trznymi kana∏ami,
a nast´pnie zasiedliliÊmy je komórkami
Êródb∏onka naczyniowego, znaczonymi
znacznikiem fluorescencyjnym (zielony
poni˝ej), komórki te w ciàgu dwóch tygodni
same u∏o˝y∏y si´ w struktury
przypominajàce naczynia w∏osowate.

METODY MRO˚ENIA

W ∏aêni olejowej przy –35°C lód
formuje si´ najszybciej na spodzie
próbki, tworzàc drobne, g´sto
upakowane, po∏àczone wzajemnie
pory. Wi´ksze i wyd∏u˝one pory
powy˝ej tworzà si´ zgodnie
z gradientem temperatury.

W ciek∏ym azocie przy –196°C
podobny gradient temperatury
pojawia si´ mi´dzy dnem a szczytem.
Z∏o˝one kszta∏ty porów i ich kierunki
przy szczycie próbki mogà wynikaç
z du˝ej lotnoÊci azotu, który
rozchodzàc si´, wytwarza
wielokierunkowy zimny front
w miejscach, gdzie napotyka alginian.

W zamra˝arce przy –20°C roztwór
alginianu najpierw ozi´bi∏ si´
do –10°C, potem ogrza∏ do –2°C
i ostatecznie powoli sch∏odzi∏ do
–20°C. PrzejÊciowy wzrost
temperatury mo˝e Êwiadczyç,
˝e woda uwolni∏a ciep∏o i zacz´∏a
krystalizowaç równoczeÊnie w ca∏ej
próbce, co odzwierciedlajà
jednolite, po∏àczone ze sobà pory.

macji utrzyma∏ ci´˝ar hodowanych na nim komórek. W tym
celu wymyÊliliÊmy nowà technik´ ˝elowania alginianu, opartà
na podstawowych zasadach in˝ynierii.

Zacz´liÊmy od umieszczania roztworu alginianu w ró˝nych

formach, a nast´pnie mroziliÊmy go, u˝ywajàc trzech ró˝-
nych metod sch∏adzania. Ka˝da z nich pozwala∏a uzyskaç in-
ny gradient temperatury w mro˝onym roztworze. Struktur´
wszystkich zamro˝onych próbek tworzy∏y kryszta∏ki lodu po-
rozdzielane cienkimi Êciankami z alginianu. Kiedy usun´li-
Êmy te kryszta∏ki przez liofilizacj´ (wykorzystujàc zjawisko
sublimacji), uzyskaliÊmy pod∏o˝e przypominajàce gàbk´, któ-
rego drobniutkie pory by∏y odzwierciedleniem kszta∏tu krysz-
ta∏ków lodu. Tak jak podejrzewaliÊmy, okaza∏o si´, ˝e stosu-
jàc ró˝ne metody mro˝enia, mo˝na wp∏ywaç na g´stoÊç porów,
ich rozmiar i kierunek oraz liczb´ po∏àczeƒ mi´dzy nimi [ram-
ka na poprzedniej stronie].

Po∏àczenia mi´dzy porami sà szczególnie wa˝ne dla ˝y-

wych komórek, które – posiane na takim pod∏o˝u – mogà bez
przeszkód zasiedlaç go w ca∏ej obj´toÊci. Swobodny i ciàg∏y
przep∏yw substancji od˝ywczych i produktów przemiany ma-
terii z i do komórek podczas inkubacji ma bardzo du˝e zna-
czenie i decyduje o ich prze˝yciu. DowiedzieliÊmy si´ tak˝e,
˝e g´stoÊç po∏àczeƒ mi´dzy porami determinuje mo˝liwoÊç
wrastania nowych naczyƒ krwionoÊnych w g∏àb formujàcej si´
tkanki po jej wszczepieniu do organizmu biorcy. Unikatowa
budowa wewn´trzna pod∏o˝y, przypominajàca pian´ lub pla-
ster miodu, zwi´ksza ich wytrzyma∏oÊç mechanicznà – na-
wet jeÊli pory stanowià ponad 95% ca∏ej obj´toÊci, pod∏o˝e
mo˝e wytrzymaç znaczne ciÊnienie zewn´trzne.

Tak wi´c opanowaliÊmy zdolnoÊç tworzenia pod∏o˝a o po-

˝àdanym kszta∏cie i budowie wewn´trznej, wykonanego z na-
turalnego materia∏u niezawierajàcego toksycznych zwiàzków

chemicznych, niepobudzajàcego uk∏adu odpornoÊciowego i
majàcego dobrà wytrzyma∏oÊç mechanicznà. W dodatku po
wszczepieniu do organizmu rozk∏ada si´ ono w odpowied-
nim czasie. Jednak ciàgle nale˝a∏o wyjaÊniç, czy nasze pod-
∏o˝e b´dzie dla ˝ywych komórek odpowiednim substytutem
macierzy zewnàtrzkomórkowej utraconej w czasie zawa∏u.

Budowanie tkanki

PRZED WSZCZEPIENIEM

naszego pod∏o˝a zwierz´tom laborato-

ryjnym chcieliÊmy sprawdziç, jak komórki serca zareagujà
na alginian in vitro, tzn. poza organizmem. U˝yliÊmy do tego
celu komórek serca ze szczurzych zarodków, które to komór-
ki – w przeciwieƒstwie do dojrza∏ych kardiomiocytów – zdol-
ne sà do podzia∏ów. ZawiesiliÊmy je w p∏ynnej po˝ywce zawie-
rajàcej zwiàzki od˝ywcze i wstrzykn´liÊmy w pod∏o˝e
uformowane w p∏aski walec o Êrednicy 6 mm i wysokoÊci
1 mm. Pod wp∏ywem dzia∏ania niewielkiej si∏y odÊrodkowej
komórki szybko przenikn´∏y przez pory, równomiernie zasie-
dlajàc pod∏o˝e w czasie nieca∏ych 30 min.

SzybkoÊç jest bardzo istotna dla utrzymania ˝ywotnoÊci

komórek, które sà niezwykle wra˝liwe na niedobór tlenu; jed-
norodna dystrybucja zaÊ pozwala na umieszczenie w pod∏o-

˝u bardzo du˝ej ich liczby. W naszym pod∏o˝u uzyskaliÊmy
g´stoÊç 10

8

komórek na centymetr szeÊcienny – zbli˝onà do

naturalnej g´stoÊci komórek w mi´Êniu sercowym.

Nast´pnie przenieÊliÊmy nasze zasiedlone komórkami pod-

∏o˝a do specjalnego inkubatora, zwanego bioreaktorem, któ-

ry utrzymuje idealnà wilgotnoÊç i st´˝enie gazów oraz gwaran-
tuje ciàg∏y przep∏yw po˝ywki przez pod∏o˝e. MonitorowaliÊmy
dok∏adnie metabolizm komórek i ju˝ po 48 godz. wykryliÊmy
pierwsze kurczàce si´ miocyty. Po siedmiu dniach nadszed∏
czas na wszczepienie pod∏o˝a do ˝ywego serca.

W tym celu operowaliÊmy znieczulone doros∏e szczury, któ-

re przeby∏y zawa∏ lewej komory serca siedem dni wczeÊniej.
Wykrycie zawa∏u nie stanowi∏o problemu: blade, niekurczà-
ce si´ blizny by∏y wyraênie widoczne w sercach wszystkich
zwierzàt. UmieÊciliÊmy nasze zasiedlone komórkami pod∏o-

GRUDZIE¡ 2004 ÂWIAT NAUKI

29

J. LEOR I IN.

Cir

culation

, tom 102, nr 19, 2000 rok; ©

AHA/L

W

W

POD¸O˚E ZASIEDLONE PRZEZ KOMÓRKI dwa miesiàce po wszcze-
pieniu do serca szczura zintegrowa∏o si´ ze strefà zawa∏u. Miejscowe
naczynia krwionoÊne mocno wnikn´∏y w przeszczep, podtrzymujàc przy
˝yciu dojrza∏e komórki mi´Ênia sercowego w obr´bie pod∏o˝a i chroniàc
przed poszerzaniem si´ strefy zawa∏u.

Osiàgn´liÊmy

WST¢PNY CEL

– potrafimy chroniç serce, które

ucierpia∏o w czasie zawa∏u, i

ZAPOBIEGAå

jego dalszej degeneracji.

SMADAR COHEN i JONATHAN LEOR od szeÊciu lat pracujà wspól-
nie nad stworzeniem opatrunku dla uszkodzonego serca. Cohen,
profesor biotechnologii Uniwersytetu Ben Guriona w Izraelu, bada
wp∏yw sygna∏ów zewn´trznych na komórki. Projektuje tak˝e i wy-
twarza polimery do celów in˝ynierii tkankowej i do tworzenia szkie-
letów leków o kontrolowanym uwalnianiu. Leor jest kardiologiem z
Shelba Medical Center i dyrektorem Instytutu Kardiologicznego Neu-
felda w Uniwersytecie w Tel Awiwie. Jego zainteresowanie powi-
k∏aniami zawa∏u serca doprowadzi∏o go do badaƒ nad regeneracjà
mi´Ênia sercowego za pomocà transplantowanych komórek, in˝ynie-
rii tkankowej i terapii genowej.

O

AUTORACH

Przeszczep

˝a bezpoÊrednio w miejscach zawa∏u. Nast´pnie zamkn´li-
Êmy chirurgiczne naci´cie i czekaliÊmy.

Po dwóch miesiàcach ods∏oniliÊmy serca szczurów ponownie.

ByliÊmy ogromnie zaskoczeni, widzàc obfity wzrost nowych
naczyƒ krwionoÊnych ze zdrowej tkanki serca w g∏àb implan-
towanego przeszczepu [ilustracja na poprzedniej stronie]. Prze-
szczepione fragmenty skonstruowanej tkanki dobrze wbudo-
wa∏y si´ w blizn´, a pod∏o˝e z alginianu zacz´∏o si´ rozpuszczaç
i by∏o zast´powane przez rozwijajàcà si´ naturalnà substancj´
zewnàtrzkomórkowà. Zarodkowe komórki mi´Ênia sercowego
przekszta∏ci∏y si´ w dojrza∏e w∏ókna mi´Êniowe, a cz´Êç z nich
u∏o˝y∏a si´ równolegle wzgl´dem siebie, tak jak to robià w∏ók-
na w zdrowym sercu. Po∏àczenia mechaniczne i synapsy elek-
tryczne, niezb´dne do kurczenia si´ i przewodzenia impulsów
nerwowych, równie˝ by∏y obecne pomi´dzy w∏óknami.

Przed dokonaniem przeszczepów zmierzyliÊmy za pomocà

echokardiografii wydolnoÊç szczurzych serc. To samo zrobi-
liÊmy równie˝ w grupie kontrolnej: szczurów z zawa∏em, któ-
re mia∏y przejÊç transplantacj´ pozorowanà – operacj´ bez
wszczepienia tkanki. Dwa miesiàce póêniej znowu badaliÊmy
wszystkie szczury echokardiografem. W grupie kontrolnej
obserwowaliÊmy typowy scenariusz degeneracji serca: znacz-
ne poszerzenie lewej komory i istotny spadek wydolnoÊci na-
rzàdu. Wyniki grupy, która otrzyma∏a przeszczep, by∏y od-
mienne: rozmiar lewej komory, gruboÊç jej Êcian i wydolnoÊç
by∏y mniej wi´cej takie same, jak zaraz po zawale.

Osiàgn´liÊmy wst´pny cel naszych badaƒ – ochron´ serca

uszkodzonego w czasie zawa∏u i powstrzymanie dalszej dege-
neracji, która prowadzi do jego niewydolnoÊci. Jednak wiele
pytaƒ pozosta∏o bez odpowiedzi. Mechanizm, dzi´ki któremu
ten rodzaj terapii chroni mi´sieƒ sercowy, jest nadal niejasny,
poniewa˝ przeszczepiony fragment tkanki nie bierze udzia∏u
w skurczach serca. Wydaje si´, ˝e przez ograniczenie dalszego
powi´kszania si´ zawa∏u i pogrubienie Êciany serca w miejscu
uszkodzenia (wynikajàce ze wstawienia nowej tkanki) prze-
szczep móg∏ zapobiec typowej przebudowie komory.

Wierzymy, ˝e wrastanie nowych naczyƒ krwionoÊnych w ob-

szar zawa∏u równie˝ istotnie spowalnia proces zwyrodnienia
tkanki mi´Êniowej. Nowe naczynia krwionoÊne najlepiej i naj-
liczniej rozwija∏y si´ w przeszczepach zasiedlonych komórka-
mi. Jednak ku naszemu zdziwieniu równie˝ pod∏o˝a bez ko-
mórek umo˝liwia∏y wzrost naczyƒ krwionoÊnych w obszarze
zawa∏u. Byç mo˝e pod∏o˝e alginianowe jest dla nowych na-
czyƒ po prostu dobrà mechanicznà podporà. Podejrzewamy
równie˝, ˝e materia∏ pod∏o˝a mo˝e sprzyjaç rekrutacji komó-
rek macierzystych, które uczestniczà w regeneracji tkanki, ja-
ko ˝e chemiczna struktura alginianu jest podobna do struktu-
ry siarczanu heparanu, wa˝nego wielocukru wyst´pujàcego w
naturalnej macierzy zewnàtrzkomórkowej. Aby sprawdziç to za-
∏o˝enie, spróbowaliÊmy niedawno wstrzyknàç hydro˝el algi-
nianu bezpoÊrednio w stref´ zawa∏u serca szczura. Alginian
nawet w postaci hydro˝elu ochroni∏ struktur´ i funkcj´ komo-
ry, prawdopodobnie stanowiàc substytut macierzy zewnàtrz-
komórkowej i w ten sposób wspomagajàc angiogenez´.

OczywiÊcie, podobnie jak inni badacze tej dziedziny, poszu-

kujemy równie˝ êróde∏ komórek serca do przeszczepiania
cz∏owiekowi. Dojrza∏e komórki serca cz∏owieka nie wchodzà
w gr´, poniewa˝ si´ nie dzielà. Do komórek, które mog∏yby
staç si´ kardiomiocytami nale˝à zarodkowe komórki macierzy-
ste i komórki macierzyste ze szpiku kostnego lub z krwi p´-
powinowej. Jednak wszystkie komórki pochodzàce od innych
dawców rozpoznane zosta∏yby przez uk∏ad odpornoÊciowy
pacjenta jako obce i wymaga∏y zastosowania leków immuno-
supresyjnych. Najlepszym sposobem unikni´cia odrzucenia
przeszczepu by∏by przeszczep komórek w∏asnych (autologicz-
nych). Mog∏yby nimi byç komórki macierzyste i komórki pre-
kursorowe pochodzàce ze szpiku kostnego, mi´Êni lub tkanki
t∏uszczowej oraz zarodkowe komórki macierzyste uzyskane
przez tzw. klonowanie terapeutyczne. Byç mo˝e uda si´ tak˝e
wyizolowaç lokalne komórki macierzyste z serca.

Drogi odbudowy

POD

¸O˚A ALGINIANOWE

, jak wskazujà wyniki naszej pracy, mo-

gà byç na wiele sposobów stosowane do ochrony i regenera-
cji ludzkiego serca uszkodzonego przez zawa∏. JesteÊmy prze-
konani, ˝e za trzy lata b´dziemy gotowi do testowania
niezasiedlonego komórkami pod∏o˝a alginianowego u ludzi,
którzy przebyli zawa∏ serca. Nasze ostatnie eksperymenty na
Êwiniach potwierdzi∏y to, co zaobserwowaliÊmy u szczurów:
pod∏o˝e alginianowe niezawierajàce komórek samo z siebie
wydaje si´ zapobiegaç powi´kszaniu si´ zawa∏u i przebudo-
wie Êciany komory. Mog∏oby wi´c byç szczególnie przydatne
do zapobiegania rozwojowi niewydolnoÊci serca od samego
poczàtku u pacjentów, których serca nie przesz∏y jeszcze
znacznej przebudowy.

Zaobserwowana zdolnoÊç alginianu do pobudzania angio-

genezy sk∏ania do prób zwi´kszenia prze˝ywalnoÊci prze-
szczepianych komórek przez implantowanie samego pod∏o-
˝a, odczekanie na jego unaczynienie, a nast´pnie zasiedlenie
go komórkami. PróbowaliÊmy ju˝ takiej metody formowania
tkanki in vivo u szczurów i wyniki by∏y obiecujàce. Unaczy-
nienie pod∏o˝a uda∏o nam si´ zwi´kszyç jeszcze bardziej, kie-
dy w pod∏o˝e wprowadziliÊmy mikrokapsu∏ki zawierajàce po-
woli uwalniane czynniki wzrostu [ilustracja powy˝ej]. Niestety,
okaza∏o si´, ˝e wczeÊniejsze unaczynienie pod∏o˝a zmniejsza
przestrzeƒ dost´pnà dla przeszczepianych komórek.

30

ÂWIAT NAUKI GRUDZIE¡ 2004

ANA

T PERETS I SMADAR COHEN

Uniwersytet Ben Guriona

MIKROKAPSU¸KI mogà zostaç wprowadzone do pod∏o˝a poprzez roz-
prowadzenie ich w roztworze alginianu przed zamro˝eniem. Stopniowo
uwalniajàc czynniki wzrostu, przyÊpieszajà formowanie si´ naczyƒ krwio-
noÊnych, a dzi´ki Êrednicy zaledwie 3

µµm nie wchodzà im w drog´.

Obecnie pracujemy wi´c nad regulowaniem przebiegu an-

giogenezy za pomocà ró˝nych czynników wzrostu. Najwi´k-
szy wp∏yw na kszta∏t, struktur´ i funkcj´ tkanki dajà jednak
prace in vitro. Ponadto u pacjentów, u których zawa∏ spowo-
dowa∏ p´kni´cie Êciany serca, potrzebna jest ca∏kowita wy-
miana jej fragmentu. Powsta∏à dziur´ musimy wype∏niç praw-
dziwà tkankà, implantacja niezasiedlonego komórkami
pod∏o˝a nie przynios∏aby w tym wypadku korzyÊci. Powstaje
zatem problem utrzymania przy ˝yciu transplantowanych ko-
mórek do czasu wytworzenia si´ odpowiedniego unaczynie-
nia miejscowego. Opierajàc si´ na zdobytym doÊwiadczeniu,
badamy obecnie mo˝liwoÊç wytworzenia przeszczepu za-
wczasu unaczynionego.

W tym celu wysialiÊmy komórki Êródb∏onka naczyniowego,

które w normalnych warunkach wyÊcie∏ajà Êciany naczyƒ krwio-
noÊnych, do pod∏o˝a alginianowego i hodowaliÊmy je w bio-
reaktorze. ZbudowaliÊmy w ten sposób w∏oÊniczkowe ∏o˝e na-
czyniowe in vitro. Planujemy inkubowaç komórki Êródb∏onka
razem z kardiomiocytami na tym pod∏o˝u, aby spróbowaç ufor-
mowaç kapilary naczyƒ w∏osowatych wewnàtrz fragmentu
tkanki mi´Ênia sercowego. JeÊli nam si´ uda, b´dziemy musie-
li jeszcze stwierdziç, czy powsta∏a sieç naczyƒ w∏osowatych
zacznie funkcjonowaç po przeszczepieniu do organizmu, a je-
Êli tak, to jak szybko to si´ stanie. JeÊli po∏àczenia z lokalnym
uk∏adem naczyniowym pojawià si´ w nied∏ugim czasie, szan-
se na prze˝ycie przeszczepionej tkanki powinny byç du˝e.

Wielu naukowców, u˝ywajàc bogatego arsena∏u Êrodków,

pracuje nad rozwiàzaniem problemu wytworzenia unaczy-
nionej tkanki in vitro [patrz: „In˝ynieria ˝ycia”

PANORAMA

;

Âwiat Nauki, czerwiec 2004]. Liczymy na to, ˝e nie jeste-
Êmy osamotnieni w swych próbach rekonstrukcji tkanki ser-
ca. JeÊli uda si´ wykorzystaç zalety ka˝dej z metod, to wszy-
scy si´ czegoÊ nauczymy i w ca∏ej dziedzinie dokona si´
post´p. Choç zbudowanie ˝yjàcego fragmentu ludzkiego ser-
ca mo˝e zajàç jeszcze nast´pne 15 lat, to z pewnoÊcià nie
jest ju˝ mrzonkà.

n

1

Chodzi zapewne o przekszta∏canie prekursorów czynników wzrostu w ich

aktywne postacie.

2

Od 1960 roku stosowany jest do wyrobu ca∏kowicie wch∏anialnych nici chi-

rurgicznych.

3

Kwas alginowy oraz jego sole: alginian sodowy, potasowy, amonowy i wap-

niowy, sà stosowane m.in. jako zag´szczajàce dodatki E400, E401, E402, E403
i E404 do produktów spo˝ywczych i kosmetyków oraz w protetyce stomatolo-
gicznej do wykonywania wycisków.

GRUDZIE¡ 2004 ÂWIAT NAUKI

31

NABIL DIB

Arizona Heart Institute

I JONA

THAN DINSMORE

GenV

ec, Inc.

(wstr

zykiwanie komór

ek

); T

. SHIMIZU I IN.

Cir

culation R

esear

ch

, tom 90, nr 3 str

. e40, 2002 rok, ©

AHA/L

WW (

hodowla tkanki

); MICHAL SHACHAR

,

RONIT BASHER I SMADAR COHEN

Uniwersytet Ben Guriona

(por

owate pod∏o˝a

); B. TEFFT

, ZA ZGODÑ T

. BOL

ANDA

Clemson University

(ucho

); K. ST

A

UB, ZA ZGODÑ K. J. L. BURGA

Clemson University

(wstr

zykiwane pod∏o˝a

)

Tissue Engineering: Current State and Perspectives. Erin Lavik i Robert

Langer; Applied Microbiology and Biotechnology, tom 65, nr 1, s. 1-8;
VII/2004.

Myocardial Tissue Engineering: Creating a Muscle Patch for a Woun-

ded Heart. Jonathan Leor i Smadar Cohen; Annals of the New York Aca-
demy of Sciences, tom 1015, s. 312-319; V/2004.

Tailoring the Pore Architecture in 3-D Alginate Scaffolds by Controlling

the Freezing Regime during Fabrication. Sharon Zmora, Rachel Glickis
i Smadar Cohen; Biomaterials, tom 23, s. 4087-4094; X/2002.

JEÂLI CHCESZ WIEDZIEå WI¢CEJ

Sposoby naprawiania mi´Ênia sercowego

IN˚YNIEROWIE TKANKOWI badajà ró˝ne podobne do siebie metody naprawy ludzkiego mi´Ênia sercowego. Ka˝da technika
ma pewne zalety, a doÊwiadczenie zdobyte dzi´ki nim pomaga posuwaç si´ naprzód.

TECHNIKA

ZALETY

WADY

Wstrzykiwanie komórek

n

¸atwe podanie

n

Niskie prze˝ycie komórek

Komórki macierzyste lub prekursorowe

n

Wstrzykiwane komórki mogà

n

Komórki nie produkujà nowych,

wstrzykiwane sà w mi´sieƒ sercowy

indukowaç formowanie si´

funkcjonujàcych miocytów

przez cewnik lub bezpoÊrednio

macierzy zewnàtrzkomórkowej

w mi´sieƒ

i naczyƒ krwionoÊnych

Hodowla tkanki

n

DoÊç ∏atwe do hodowli

n

P∏ytka nie ma unaczynienia,

Kardiomiocyty wzrastajà na cienkich

w laboratorium

mo˝liwe wi´c sà tylko

p∏ytkach, u∏o˝one tak, aby tworzy∏y

n

Bardziej stabilne ni˝ wstrzykni´cie

cienkie konstrukcje

„∏atk´” i sà chirurgicznie implantowane

rozdzielonych komórek

n

Bardzo delikatne

Porowate pod∏o˝a

n

Struktura pod∏o˝a podtrzymuje

n

Odst´p mi´dzy implantacjà

Trójwymiarowe pod∏o˝a, wytworzone

uk∏ad komórek i sprzyja

a unaczynieniem tkanki

z naturalnych lub syntetycznych

ich unaczynieniu

powoduje Êmierç komórek

polimerów, zasiedlane sà komórkami,

n

Zastosowane materia∏y mogà

inkubowane w bioreaktorach, a nast´pnie

pobudzaç tworzenie si´ naczyƒ

implantowane chirurgicznie

Trójwymiarowe uk∏adanie komórek

n

Ró˝ne typy komórek mogà

n

Pierwsze stadium badaƒ,

Urzàdzenie podobne do drukarki

byç dok∏adnie umiejscowione

niepotwierdzona funkcjonalnoÊç

atramentowej uk∏ada warstwy komórek

n

Komórki majà swobod´

in vivo

zawieszone w hydro˝elu w potrzebne

przemieszczania si´

kszta∏ty; konstrukcje takie sà hodowane

i organizowania

i nast´pnie chirurgicznie implantowane

Wstrzykiwane pod∏o˝a

n

¸atwe podanie

n

Ograniczona kontrola

Hydro˝ele z polimerów, same lub

n

Mo˝e pobudzaç regeneracj´,

nad formowaniem si´ nowej

zawierajàce zawiesin´ komórek,

b´dàc tymczasowym

tkanki

wstrzykiwane sà w serce bezpoÊrednio

substytutem macierzy

lub przez cewnik naczyniowy

zewnàtrzkomórkowej