etologia ODPOWIEDZ ORGANIZMOW N Nieznany

SESJA 10

ODPOWIEDŹ ORGANIZMÓW NA

CZYNNIKI BIOTYCZNE

I ABIOTYCZNE

PLAKATY

P10-01

SIARKOTRANSFERAZA TIOSIARCZANOWA I SYNTAZA -CYJANOALANINOWA MSZYC

Anna Urbańska, Bogumił Leszczyński, Henryk Matok, Aneta Kwiatkowska, Dagmara Sudoł, Robert

Krzyżanowski

Katedra Biochemii, Akademia Podlaska w Siedlcach, Siedlce

Cyjanowodór (HCN) jest wysoce toksyczny ze względu na inhibicję żelazo- i miedzioprotein, zwłaszcza hemoglo-

biny i cytochromu aa

. W tkankach roślin prekursorem HCN jest grupa nitrylowa (-CN) glikozydów cyjanogen-

nych. Proces cyjanogenezy tj. uwalniania gazowego cyjanowodoru najintensywniej przebiega w młodych orga-

nach roślin i może być indukowany przez uszkodzenia mechaniczne lub powodowane żerowaniem roślinożer-

ców. Dlatego roślinożerne owady narażone na kontakt z HCN wykształciły mechanizmy biochemicznych adapta-

cji, które umożliwiają neutralizacjętego wysoce toksycznego metabolitu. W prezentowanej pracy zbadano ak-

tywność siarkotransferazy tiosiarczanowej (rodanazy) [E.C. 2.8.1.1] i syntazy -cyjanoalaninowej ( -CAS) [E.C.

4.4.1.9] w tkankach morf mszycy czeremchowo-zbożowej (Rhopalosiphum padi L.), żerujących na cyjanogen-

nych liściach czeremchy zwyczajnej (Prunus padus L.). Aktywność -CAS układała sięw następująco: fundatrix >

fundatrigeniae > migrantes; a rodanazy: migrantes > fundatrix > fundatrigeniae. Poziom aktywności -CAS w

tkankach fundatrix i fundatrigeniae, które żerują wyłącznie na cyjanogennych liściach czeremchy był skorelowa-

ny (r = 0.968; p Ł 0.05) z ilością uwalnianego HCN. Aktywność -CAS w tkankach fundatrix, które były narażone

na względnie wysokie stężenie HCN (25–30 mg/g ś.m.), była 10-krotnie wyższa niż w tkankach migrantes przela-

tujących z czeremchy na trawy. Natomiast w tkankach fundatrigeniae, które są narażone na względnie niskie stę-

żenie HCN (0.02–0.08 mg/g ś.m.) i w tkankach migrantes aktywność rodanazy była wyższa od aktywności -CAS,

kolejno 4-krotnie i 8-krotnie. Uzyskane wyniki wskazują, że w detoksykacji HCN przez R.padi istotnym enzymem

jest -CAS.

P10-02

WPŁYW DOŚWIADCZALNEJ HYPERTYREOZY NA PRZEMIANĘ MINERALNĄ

Sławomir Puczkowski

, Maria Kopff

, Edward Kowalczyk

, Magdalena Rudnicka

, Magdalena

Kozłowska

, Marek Czarnecki

, Marek Strzelczyk

, Anna Kopff

, Andrzej Kaszuba

A: Wojskowa Akademia Medyczna Zakład Biochemii i Chemii, Łódź

B: Wojskowa Akademia Medyczna Zakład Farmakologii

C: Wojskowa Akademia Medyczna Klinika Dermatologii

D: ZOZ Łódź – Widzew

Wśród oddziaływań hormonów tarczycy na metabolizm organizmu jest także przemiana mineralna. Wiele pier-

wiastków bierze udział w regulacji wzrostu tkanek i ich przemianach biochemicznych. Istnieją jednak sprzeczne

doniesienia o nadczynności tarczycy, a zawartości poszczególnych pierwiastków we krwi. W celu wyjaśnienia

tych korelacji podjęto badania określające wpływ L-tyroksyny, (Preparat Eltoxim – Polfa) podawanej królikom

dożołądkowo w dawce 100 g/kg wagi ciała przez 21 dni, na metabolizm pierwiastków w osoczu i erytrocytach.

Przed podaniem leku (grupa kontrolna) we krwi oznaczono stężenie TSH (tyreotropiny), T

, T

, i cholesterolu oraz

stężenia : Na, K, Mg, Ca, Zn i Cu w surowicy i w erytrocytach. Po 21 dniach podawania Eltoximu (grupa badana)

wykonano ponownie w/w badania. Stwierdzono, że zastosowana dawka Eltoximu spowodowała obniżenie TSH

o 72% oraz podwyższenie stężenia T

trzykrotnie, a T

ponad pięciokrotnie z równoczesnym obniżeniem stężenia

cholesterolu o 35,4%. Wysokie stężenie hormonów tarczycy we krwi królików spowodowało także zmiany w stę-

żeniu pierwiastków w osoczu: wzrost stężenia Fe o 28%, Mg o 6,7% i Ca o 17,6%, natomiast spadek stężenia Cu

o 47,2% i Zn o 50,3%.

P10-03

AMINOPEPTYDAZY SIEWEK PSZENICY JAREJ (TRITICUM AESTIVUM L. VAR. ETA)

Anna Miazek, Barbara Zagdańska

Katedra Biochemii, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, Warszawa

W przypadku działania niekorzystnych czynników środowiska, wewnątrzkomórkowa degradacja białek wydaje

siębyć jednym z podstawowych mechanizmów umożliwiających roślinie funkcjonowanie w warunkach stresu

244

SESJA 10 PLAKATY

(Vierstra, Bartels 1996). Przeprowadzona charakterystyka endoproteinaz siewek pszenicy (Triticum aestivum L.)

poddanych dehydratacji wykazała, że aktywność azokazeinolityczna zwiększała się dwukrotnie w koleoptylu, zaś

w korzeniu tylko nieznacznie zmniejszała. Zmieniona aktywność azokazeinolityczna nie miała jednak wpływu na

stopień przeżywalności siewek. Dlatego celem prezentowanych doświadczeń była charakterystyka aktywności

aminopeptydaz siewek pszenicy jarej rosnących zarówno w optymalnych warunkach uwodnienia jak i podda-

nych dehydratacji. W doświadczeniach wstępnych ustalono, że optymalnymi warunkami dla oznaczania aktyw-

ności aminopeptydaz ekstrahowanych z koleoptyla i korzeni pszenicy jarej jest pH 7,5 i temperatura 37°C. Spo-

śród przebadanych kilkunastu syntetycznych aminokwasowych pochodnych -naftyloamidu, najwyższą aktyw-

ność uzyskano w obecności Ala- -NA, Arg- -NA, Gly- -NA, Leu- -NA i Phe- -NA. Wraz ze wzrostem siewki (do

ósmego dnia po imbibicji) aktywność aminopeptydaz zwiększała się w koleoptylu natomiast malała w korze-

niach. Po 96h dehydratacji, gdy deficyt wody osiągnął 85–90% w badanych organach, obniżenie aktywności ob-

serwowano tylko w ekstrakcie z korzeni w obecności Phe- -NA Wyniki uzyskane po rozdziale elektroforetycznym

na żelu poliakrylamidowym sugerują, ze w kiełkujących siewkach pszenicy występują dwie aminopeptydazy: jed-

na o szerokiej specyficzności i druga o prawie absolutnej specyficzności substratowej.

P10-04

MAGNEZ A POZIOM ANTYOKSYDANTÓW W TKANKACH SZCZURÓW INTOKSYKOWANYCH

OCHRATOKSYNĄ

Maria Szpetnar

, Kazimierz Pasternak

, Małgorzata Kiełczykowska

, Andrzej Borzęcki

A: Akademia Medyczna, Zakład Chemii Ogólnej, Lublin

B: Zakład Higieny

Ochratoksyna A jest toksyną wyizolowaną z kropidlaka (Aspergillus ochraceus). Jej toksyczność może wynikać,

miedzy innymi, z własności prooksydacyjnych. Magnez jest pierwiastkiem, od którego stężenia zależy funkcjono-

wanie wielu enzymów i szlaków metabolicznych. Z tego powodu interesującym wydał sięproblem wpływu ma-

gnezu na poziom wybranych antyoksydantów w tkankach szczurów intoksykowanych ochratoksyną A. Badania

przeprowadzono na młodych szczurach rasy Wistar. Zwierzęta (oddzielnie samce i samice) podzielono na trzy

grupy: I była kontrolną i otrzymywała wodędestylowaną, II otrzymywała codziennie dożołądkowo ochratoksynę

A w ilości 1 mg/kg masy ciała, natomiast III otrzymywała ochratoksynęA w ilości 1 mg/kg, a po 20 min. magnez

(chlorek magnezu) w ilości 5 mg/kg masy ciała. Po okresie dwóch tygodni zwierzęta poddawano dekapitacji i do

dalszych badań pobierano wątrobę, nerki i mózg. Pobrane tkanki homogenizowano a homogenaty poddawano

wirowaniu. W uzyskanym nadsączu oznaczano aktywność dysmutazy ponadtlenkowej (SOD), peroksydazy glu-

tationowej (GPx) oraz katalazy (CAT). Przeprowadzone badania wykazały, że aktywność badanych enzymów an-

tyoksydacyjnych (SOD, GPx, CAT) była mniejsza w analizowanych tkankach zwierząt poddanych działaniu ochra-

toksyny A w porównaniu z grupą kontrolną. Magnez podawany równocześnie z ochratoksyną zmniejszał możli-

wość jej toksycznego działania, co manifestowało sięwzrostem aktywności badanych enzymów w porównaniu z

grupą otrzymującą samą toksynę.

P10-05

AKTYWNOŚĆ INWERTAZY I SYNTAZY SACHAROZY W SIEWKACH PSZENICY PODDANYCH

ODWODNIENIU

Janusz Bogdan, Barbara Zagdańska

Katedra Biochemii, Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego, Warszawa

Siewki pszenicy (Triticum aestivum L. var. Eta) są odporne na dehydratacjęaż do czwartego dnia kiełkowania, po

czym gwałtownie tracą zdolność do tolerowania odwodnienia. Cukry znacznie zwiększają potencjał osmotyczny

komórki co sugeruje potencjalne znaczenie inwertazy i syntazy sacharozy (kierunek hydrolityczny) w odpowiedzi

na deficyt wody. Dlatego celem badań było prześledzenie zmian w aktywnosci tych enzymów i określenie ich

znaczenia w tolerancji odwodnienia. Doświadczenia przeprowadzono na rozwijających sięsiewkach pszenicy

poczynając od drugiego dnia od imbibicji. Aktywność kwaśnej inwertazy jest najwyższa trzeciego dnia kiełkowa-

nia zarówno w koleoptylu jak i w korzeniach po czym stopniowo zmniejsza się. Aktywność inwertazy zasadowej

początkowo jest niewielka ale od czwartego dnia kiełkowania zwiększa się. Sugeruje to, że kwaśna inwertaza od-

grywa znaczącą rolępodczas różnicowania siękomórek, kiedy to zapotrzebowanie na heksozy jest największe.

Wraz z rozwojem siewki zapotrzebowanie na heksozy maleje i zmniejsza sięaktywność kwaśnej inwertazy w po-

równaniu do zasadowej. Aktywność syntazy sacharozy zwiększa się wraz z wiekiem siewki. Reakcja siewek na

ODPOWIEDŹ ORGANIZMÓW NA CZYNNIKI BIOTYCZNE I ABIOTYCZNE

245

niedobór wody zależy od ich wieku: w 4-dniowych siewkach hydroliza sacharozy przy deficycie wody poniżej

40% zachodzi głównie w cytoplazmie. Wraz z pogłębiającym się deficytem wody zaczyna przeważać hydroliza

sacharozy w wakuoli. U siewek 6-dniowych hydroliza sacharozy niezależnie od wielkości deficytu wody koncen-

truje sięw wakuoli. Otrzymane wyniki sugerują, ża przeżywalność siewek związana jest z utrzymaniem korzyst-

niejszego bilansu energetycznego (poprzez np. hydrolizęsacharozy drogą SS), którego zachwianie prowadzi do

utraty tej cechy nawet przy rosnących zdolnościach osmoregulacyjnych.

P10-06

INDUKCJA PROTEAZ W HODOWANYCH ORGANACH ŁUBINU ŻÓŁTEGO WYWOŁANA

BRAKIEM CUKRU

Sławomir Borek

, Ewa Wiśniewska

, Wiktoria Ratajczak

, Lech Ratajczak

Uniwersytet im. A. Mickiewicza Zakład Fizjologii Roślin, Poznań

Nasiona łubinu gromadzą duże ilości białka zapasowego (do 45% suchej masy nasion). Procesy mobilizacji

związków zapasowych wymagają istnienia precyzyjnie działającego systemu regulacji. Jedna z hipotez zakłada,

że cukier pełni funkcjęmodyfikatora procesów wzrostu i rozwoju roślin poprzez regulacjęekspresji genów. Me-

chanizm takiej regulacji zwany represją kataboliczną został dokładnie opisany dla bakterii i drożdży. Postuluje się

występowanie takiego mechanizmu również u roślin. Badano aktywność egzo- i endopeptydazy alaninowej i le-

ucynowej w surowych ekstraktach z hodowanych przez 96 h in vitro izolowanych osi zarodkowych i izolowa-

nych liścieni. Organy hodowano: a) bez cukru, b) z dodatkiem 60 mM sacharozy, c) przez 72 h bez dodatku cukru

+ 24 h w obecności sacharozy. Aktywność enzymów określano spektrofotometrycznie wykorzystując odpowied-

nie substraty nitroanilidowe. Głodzenie organów pod względem sacharozy stymulowało w nich aktywność pro-

teolityczną. Różnice w pierwszym dniu kultury nie były znaczące ale nasilały sięw miaręupływu czasu kultury. W

izolowanych osiach zarodkowych osiągnęły najwyższą wartość w czwartym dniu kultury a w izolowanych liście-

niach w trzecim. Podanie sacharozy organom głodzonym powodowało znaczące przyhamowanie aktywności

enzymów aż do poziomu wyraźnie niższego niż aktywność proteaz w stale odżywionym cukrem materiale. Więk-

sza aktywność enzymów proteolitycznych w organach głodzonych pod względem sacharozy może być wyrazem

adaptacji metabolicznej. Mechanizmem molekularnym tej adaptacji może być uwolnienie spod represji katabo-

licznej powodowanej przez cukier genów odpowiedzialnych za syntezęnowej puli enzymów proteolitycznych.

Nie można wykluczyć jednak aktywacji enzymów już istniejących w tkankach.

P10-07

STĘŻENIE KADMU I CYNKU W LUDZKIM NASIENIU

Aleksandra Kasperczyk

, Sławomir Kasperczyk

, Maria Dziwisz

, Ewa Birkner

, Jolanta Zalejska-Fiolka

Urszula Błaszczyk

A: Katedra Biochemii w Zabrzu Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach, Zabrze

B: Centrum Medyczne Eco-Prof.-Med. Miasteczko Śląskie

Wpływ metali ciężkich w tym m. in. cynku i kadmu na morfologię nasienia nie jest w pełni poznany. Stwierdzono,

że u mężczyzn narażonych zawodowo na działanie kadmu i dodatkowo palących papierosy istnieje duże praw-

dopodobieństwo niepłodności. Cynk działa ochronnie na nasienie i jest niezbędny do procesu spermatogenezy.

Wykazano pozytywną korelację między stężeniem cynku a ruchliwością plemników. Celem pracy było wykazanie

wpływu w/w pierwiastków na funkcjęplemników w ludzkim nasieniu. MATERIAŁY I METODY: W badaniu uczest-

niczyło 93 pacjentów Poradni Andrologicznej, których podzielono ze względu na ilość plemników w 1ml na dwie

grupy: badaną (<40mln/ml, n=51) i kontrolną (>40mln/ml, n=42). Nasienie było badane morfologicznie (w

celu określenia objętości ejakulatu, ilości plemników w 1ml, wskaźnika form prawidłowych i nieprawidłowych

plemników, wskaźnika ruchu postępowego, wskaźnika przeżywalności plemników po 1 i po 24 godzinach). W

nasieniu oznaczano stężenie kadmu i cynku metodą spektrofotometrii atomowo absorpcyjnej. WYNIKI: Stwier-

dzono, że stężenie kadmu nie różniło się istotnie statystycznie w obydwu grupach (średnia=0,21 SD=0,39 g/l

vs 0,15 SD=0,14 g/l w grupie kontrolnej). Natomiast stężenie cynku w grupie badanej było istotnie statystycz-

nie niższe niż w grupie kontrolnej i wynosiło 104,6 SD=34,6 mg/l vs 126,9 SD=31,5 mg/l w grupie kontrolnej

(p<0,01). Stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy stężeniem cynku a ilością plemników w 1ml nasienia

(R=0,29, p<0,01) oraz ruchliwością plemników po 24 godzinach (R=0,21, p<0,05). Stwierdzono również

ujemną korelację między stężeniem kadmu i cynku (R=-0,29, p<0,01). WNIOSKI: Zaobserwowano znamiennie

wyższe stężenia cynku u osób z ilością plemników powyżej 40 mln/ml.

246

SESJA 10 PLAKATY

P10-08

AKTYWNOŚĆ PEROKSYDAZY GLUTATIONOWEJ W OŁOWICY

Aleksandra Kasperczyk

, Sławomir Kasperczyk

, Alina Ostałowska

, Maria Dziwisz

, Ewa Birkner

, Jolanta

Zalejska-Fiolka

, Urszula Błaszczyk

, Marcin Pierchała

A: Katedra Biochemii w Zabrzu Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach, Zabrze

B: Centrum Medyczne Eco-Prof.-Med. Miasteczko Śląskie

Działanie ołowiu na układ sercowo-naczyniowy wyraża siępoprzez jego wpływ na metabolizm lipidów. Katalizo-

wane przez ołów reakcje utleniania mogą być główną przyczyną toksycznych efektów działania tego metalu.

Ołów indukuje peroksydacjęlipidów. Istnieją doniesienia, że może dochodzić do modyfikacji aktywności takich

enzymów antyoksydacyjnych jak: dysmutaza ponadtlenkowa, katalaza, peroksydaza ponadtlenkowa (POX). Ce-

lem pracy jest wykazanie wpływu ołowiu na aktywność POX w erytrocytach. W badaniu wzięło udział 152 pra-

cowników Huty Cynku i Ołowiu w Miasteczku Śląskim, których kryterium podziału na grupękontrolną (73 osoby)

i badaną (79 osób) stanowił stopień narażenia na ołów (określany na podstawie stężenia ołowiu i ZPP w krwi). W

obu grupach oznaczono: ołów (Pb) w krwi metodą spektrofotometrycznej absorbcji atomowej, cynkoprotoporfi-

ryna (ZPP) w krwi metodą fluorymetryczną, kwas deltaaminolewulinowy (ALA) w moczu metodą wg. Grabeckie-

go oraz POX w erytrocytach metodą kinetyczną. W grupie badanej średnie stężenia ołowiu były 2,3-krotnie wyż-

sze (średnie stężenie 45,3 SD=7,9 g/dl vs 19,5 SD=7,5 g/dl w grupie kontrolnej), a ZPP 4,3-krotnie wyższe (7,7

SD=4,1 g/gHb vs 1,8 SD=1,2 g/gHb) i wartości te były znamiennie statystycznie wyższe w porównaniu z grupą

kontrolną (poziom istotności p<0,001). Natomiast aktywność POX w erytrocytach (IU/gHb) nie różniły sięzna-

miennie statystycznie w obu grupach (50,6 SD=54,2 IU/gHb vs 39,6 SD=28,5 IU/gHb). Wnioski: Nie znaleziono

istotnej różnicy między aktywnością POX w erytrocytach w grupie badanej i kontrolnej. Może to sugerować inny

mechanizm peroksydacji lipidów wywołanej przez ołów.

P10-09

WPŁYW HOLOKSANU NA AKTYWNOŚĆ SOD W HODOWLI RAKA PŁASKONABŁONKOWEGO

IN VITRO

Renata Polaniak

, Maria Wideł

, Brygida Beck

, Ewa Chwalińska

, Ewa Grucka-Mamczar

, Ewa Birkner

A: Katedra i Zakład Biochemii Ś.A.M. w Zabrzu, Zabrze

B: Instytut Onkologii o/Gliwice

Hodowla komórkowa in vitro jest obecnie coraz powszechniej stosowanym modelem badawczym. Nowatorskim

sposobem prowadzenia tego rodzaju hodowli jest opracowana w Instytucie Badań nad Promieniowaniem GSF w

Monachium hodowla raka płaskonabłonkowego in vitro w postaci megakolonii. Komórki nowotworowe hodo-

wane sa jako płaskie, dyskopodobne kolonie. Rosnąc w postaci wielowarstwowego nabłonka są w stałym kon-

takcie ze sobą i z podłożem. Dzięki płaskiemu charakterowi kolonii, komórki nowotworowe mają łatwy dostęp

do medium, dlatego też mogą być długo prowadzone, bez potrzeby dokonywania kolejnych pasaży. Celem pra-

cy była próba oceny wpływu holoksanu w różnych dawkach i przedziałach czasowych na aktywność SOD – czyli

dysmutazy ponadtlenkowej (E.C. 1.15.1.1) w medium kolonii raka płaskonabłonkowego. Do hodowli użyto linię

raka płaskonabłonkowego AT 478, pochodząca z myszy C3H. Jako podłoże hodowlane zastosowano Dulbeco’s z

L-glutaminą, wzbogacone wołową surowicą płodową. Hodowla prowadzona była w temperaturze 36,9°C, w at-

mosferze wzbogaconej do 6% w dwutlenek węgla. Kolonie potraktowano dwoma stężeniami holoksanu : 10

g/ml i 40 g/ml, grupękontrolną stanowiły kolonie nie zawierające w swoim podłożu holoksanu. Medium z ko-

lonii zbierano po 24; 48; i 72 godzinach od podania preparatu i oznaczano aktywności dysmutazy ponadtlenko-

wej. W wyniku przeprowadzonego eksperymentu stwierdzono, że holoksan w stężeniu 40 g/ml podawany

przez 72 godziny najintensywniej wpływa na aktywność dysmutazy ponadtlenkowej, powodując jej spadek o

ok.11% w stosunku do grupy kontrolnej. Powyższe rezultaty sugerują konieczność dalszych badań nad

wpływem holoksanu na aktywność enzymów antyoksydacyjnych w hodowli komórek nowotworowych in vitro.

ODPOWIEDŹ ORGANIZMÓW NA CZYNNIKI BIOTYCZNE I ABIOTYCZNE

247

P10-10

ZMIANY ZAWARTOŚCI ISOFLAWONOIDÓW W CZASIE AKLIMATYZACJI KORZENI SOI DO

CHŁODU

Krystyna M. Janas, Anna Pałągiewicz, Katarzyna Szafrańska

Katedra Regulacji Wzrostu Roślin, Uniwersytet Łódzki, Łódź

W warunkach naturalnych rośliny są narażone na zmiany temperatury i innych czynników środowiskowych, któ-

re mogą powodować uszkodzenia lub indukować łańcuch reakcji prowadzący do dopasowania rośliny do pa-

nujących warunków, m. in. aklimatyzacji. Rośliny syntetyzują z fenyloalaniny w reakcji katalizowanej przez amo-

niakoliazęL-fenyloalaniny (PAL, EC 4.3.1.5) wiele związków o szkielecie fenylopropanu, które syntetyzują sięw

odpowiedzi na elicytory biotyczne i abiotyczne. Celem badań było oznaczenie zmian zawartości isoflawonoidów

w czasie aklimatyzacji korzeni do niskiej temperatury. Badania wykonywano na 3-dn. korzeniach siewek soi odm.

Aldana chłodzonych (temp. 10

C) hodowanych na wodzie dest. w ciemności lub w obecności kwasu aminoin-

dan-2-fosfonowego (AIP, inhibitora PAL) przez 24 godz. Badając zawartość izoflawonoidów stwierdzono, że po-

ziom daidzeiny jest najwyższy w porównaniu z innymi związkami genisteiną i jej glikozydową pochodną, geni-

stiną. Po dobie hodowli w 10

C poziom wszystkich badanych izoflawonoidów wzrasta. Jednak, najwyższy

wzrost obserwuje sięw zawartości genisitiny. AIP hamuje aktywność PAL in vitro i powoduje jej ‘superindukcję’

oraz podwyższa ilość wolnej fenyloalaniny co wskazuje, że jest efektywnym inhibitorem PAL. Związek ten nie ha-

muje wzrostu zawartości izoflawonoidów, co może wskazywać, iż w czasie aklimatyzacji do chłodu wzrasta po-

ziom izoflawonoidów konstytutywnych. Rola izoflawonoidów będzie dyskutowana.

P10-11

CYTOTOKSYCZNOŚĆ LEKÓW PRZECIWNOWOTWOROWYCH NA KOMÓRKI HL-60

W OBECNOŚCI AMIFOSTYNY

Małgorzata Stolarska

, Wojciech Młynarski

, Marek Różalski

, Urszula Krajewska

, Łukasz Samborski

Jerzy Bodalski

A: Klinika Chorób Dzieci, Instytut Pediatrii AM w Łodzi, Łódź

B: Zakład Biochemii, Instytut Badania Środowiska i Bioanalizy AM w Łodzi

Amifostyna (WR-2721) jest prolekiem, której pochodna tiolowa (WR-1065) powstała pod wpływem fosfatazy alka-

licznej posiada wybiórcze własności cytoprotekcyjne w stosunku do komórek prawidłowych. Stosowana jest w onko-

logii jako lek osłonowy podczas chemio- i radioterapii. Mechanizm wybiórczego działania aktywnego tiolu nie jest

dotychczas dobrze poznany. Celem pracy była ocena cytotoksycznego działania cytostatyków na komórki linii ludz-

kiej białaczki szpikowej HL-60 w środowisku amifostyny. Hodowlękomórek HL-60 prowadzono na wzbogaconym

podłożu RPMI 1640 w środowisku cyklofosfamidu (CY), karboplatyny (CARBO), doksorubidomycyny (DOXO), arabi-

nozydu cytozyny (ARA-C) i etopozydu (VP-16) z dodatkiem 0,5 mL WR-2721 o stężeniu 6x10

–3

M lub 6x10

–2

M i bez.

Do hodowli dodawano egzogenną fosfatazęalkaliczną. Efekt cytotoksyczny oceniano po 24, 48 i 72 godzinach ho-

dowli w teście z błękitem trypanu. W środowisku WR-2721 (6x10

–3

) obserwowano różnice średniej wartości IC50 w

przypadku CARBO (72h)(2,18x10

–5

SD0,240 M i 4,02x10

–5

SD0,292 M; p=0,001). Przy stężeniu WR-2721 (6x10

–2

) uzy-

skano różnice średniej wartości IC50 w przypadku CARBO już w 48 h (2,59x10

–6

SD0,692 M i 6,59x10

–6

SD0,717 M;

p=0,009), jak i w przypadku DOXO (24 h)(1,36x10

–7

SD1,165 M i 5,17x10

–7

SD0,598 M; p=0,001). W przypadku CY,

ARA-C i VP-16 nie obserwowano różnic w efekcie cytotoksycznym w środowisku WR-2721 i bez. Uzyskane wyniki su-

gerują, że amifostyna nie ma działania cytoprotekcyjnego na komórki linii ludzkiej białaczki szpikowej HL-60 w środo-

wisku leków cytostatycznych. Nasze obserwacje wskazują także, że dodatek WR-2721 powoduje uwrażliwienie tych

komórek na pochodne platyny i antybiotyki antracyklinowe.

Praca finansowana w ramach badań własnych AM nr 502–11–583.

248

SESJA 10 PLAKATY

P10-12

WPŁYW SIŁY JONOWEJ ŚRODOWISKA NA AKTYWNOŚĆ POLIGALAKTURONAZY ERWINIA

CAROTOVORA

Jerzy Lewosz, Anna Pilecka

Instytut Hodowlii i Aklimatyzacji Roślin, Bonin

Wirulencja fitopatogennych bakterii Erwinia carotovora ssp. atroseptica (Eca) wiąże sięz ich zdolnością do pro-

dukcji i sekrecji do otoczenia enzymów pektynolitycznych: poligalakturonaz (PG) i liaz kwasu poligalakturonowe-

go (PL). Czynnikami indukującymi syntezęenzymów pektynolitycznych bakterii są między innymi produkty

enzymatycznej degradacji pektyn. Te same produkty degradacji pektyn są czynnikami wzbudzającymi reakcje

obronne tkanek roślinnych. Przedstawiono mechanizm biernej regulacji aktywności poligalakturonazy w otocze-

niu komórek bakteryjnych, który zmniejsza możliwość wczesnego uruchomienia reakcji obronnych rośliny i zwal-

czenia infekcji bakteryjnej. Stwierdzono, że bakterie Eca rosnące na pożywkach płynnych o niskiej sile jonowej

produkują poligalakturonazę, lecz cząsteczki enzymu sorbują się na powierzchni komórek bakteryjnych, wkutek

czego filtrat posiada jedynie szczątkową aktywność PG. Dodatek do pożywki elektrolitów zwiększających prze-

wodność do poziomu odpowiadającego około 0.6% NaCl powoduje desorpcjęenzymu i uwolnienie go do filtra-

tu. Bakterie Eca kolonizują przestrzenie międzykomórkowe i powierzchnie roślin ziemniaka, tj. środowiska ubo-

gie w składniki pokarmowe i o niskiej sile jonowej. Unieczynnienie PG w tej sytuacji pozwala na zwiększenia li-

czebności bakterii na drodze wzrostu saprofitycznego bez indukowania reakcji obronnych rośliny. Działanie

czynników stresowych, zranienie tkanki, powoduje wyciek soku z komórek roślinnych, zwiększenie siły jonowej

otoczenia i nagłą desorpcjęPG. Skokowy wrost stężenia czynnika wirulencji paraliżuje rozwój reakcji obronnych

rośliny.

P10-13

WOLNE RODNIKI W ZARODKACH GROCHU HODOWANYCH W WARUNKACH GŁODU

WĘGLOWODANOWEGO

Iwona Morkunas

, Małgorzata Garnczarska

, Stefan Waplak

, Wiktoria Ratajczak

, Lech Ratajczak

A: Wyższa Szkoła Pedagogiczna, Zakład Biologii Eksperymentalnej, Słupsk

B: Uniwersytet im. A.Mickiewicza, Zakład Fizjologii Roślin

C: Polska Akademia Nauk, Zakład Fizyki Molekularnej

W tkankach roślinnych źródłem aktywnych form tlenu są liczne procesy metaboliczne zachodzące w naturalnych

warunkach. Różne czynniki biotyczne i abiotyczne mogą zmieniać poziom aktywnych form tlenu. Celem przepro-

wadzonych doświadczeń było oznaczenie poziomu wolnych rodników i aktywności enzymów antyoksydacyj-

nych w osiach zarodkowych grochu hodowanych w warunkach głodu węglowodanowego. Zastosowano dwa

warianty hodowlane: pożywka Hellera z sacharozą (dla zarodków odżywionych) i pożywka Hellera bez sacharozy

(dla zarodków głodzonych). Materiał pobierano do analiz po 24, 48, 72 i 96 godzinach hodowli. Badania EPR wy-

konane na liofilizowanych osiach zarodkowych grochu wykazały, że poziom wolnych rodników w materiale

głodzonym obniżał sięmonotonicznie do 72 godziny, a następnie wzrastał osiągając po 96 godzinach poziom

wyjściowy. W zarodkach odżywionych obserwowano istotny wzrost ilości wolnych rodników już po 24 godzi-

nach hodowli, a po upływie 96 godzin poziom wolnych rodników przewyższał dwukrotnie ilość oznaczoną w

materiale głodzonym. Oznaczono także wzory molekularne i aktywność enzymów antyoksydacyjnych: SOD, CAT,

POX i APOX. Analizy elektroforetyczne nie ujawniły różnic w liczbie form molekularnych pomiędzy wariantem

odżywionym i głodzonym dla wszystkich badanych enzymów, lecz niektóre izoenzymy wykazywały zróżnico-

waną aktywność. Stwierdzono także, że analizowane enzymy wykazywały niższą aktywność w materiale głodzo-

nym. Spadek poziomu wolnych rodników i aktywności enzymów antyoksydacyjnych w warunkach głodu węglo-

wodanowego jest wynikiem ograniczenia aktywności metabolicznej i funkcjonalnej tkanek i stanowi element

strategii przetrwania polegającej na adaptacji tkanek do braku substratów oddechowych.

ODPOWIEDŹ ORGANIZMÓW NA CZYNNIKI BIOTYCZNE I ABIOTYCZNE

249

P10-14

AKTYWNOŚĆ DEHYDROGENAZY GLUTAMINIANOWEJ W ODPOWIEDZI NA GŁODZENIE

WĘGLOWODANOWE

Teresa Lehmann, Lech Ratajczak

Uniwersytet im. A. Mickiewicza, Zakład Fizjologii Roślin, Poznań

Doświadczenia prowadzono na osiach zarodkowych izolowanych z kiełkujących nasion łubinu żółtego hodowa-

nych in vitro. Kultury prowadzono 72h w 3 wariantach zaopatrzenia w cukier: (-S) bez sacharozy; (S) z sacharozą ;

(-SS) 24h bez sacharozy + 24h z sacharozą. Oznaczano aktywność NADH-GDH i NAD-GDH oraz spektrum izoen-

zymatyczne enzymu. Zakładając, że wywoływane przez cukier zmiany w aktywności enzymu wymagają nieprze-

rwanej syntezy białka przebadano także wpływ inhibitorów syntezy białka: cykloheksimidu (Cxd) i chloramfeni-

kolu (Chmf) na wzrost świeżej masy osi i aktywność enzymu. Oznaczenia aktywności NADH-GDH i NAD-GDH wy-

kazały, że cukier wyraźnie hamuje aktywność enzymu w stosunku do wariantu głodzonego, równolegle redu-

kując spektrum izoenzymatyczne z ok. 22 form (osie głodzone) do 14 form (osie odżywione). Stwierdzono, że

przyrost masy w małym stopniu ograniczony był przez Chmf natomiast Cxd, w zależności od stężenia, hamował

wzrost o 30–60%. Aktywność enzymu w osiach głodzonych jak i odżywionych była także stymulowana przez niż-

sze stężenia Cxd i Chmf (0.001–0.005mMCxd i 1mM Chmf). Wyższe stężenia obu inhibitorów (0.020mM i 10mM,

odpowiednio) powodowały obniżenie aktywności GDH. Analizy elektroforetyczne wykazały, że dodatek Cxd do

wariantów odżywionych nasilał redukcjęw spektrum izoenzymów GDH. Jednak podanie Cxd wraz z cukrem do

osi głodzonych uprzednio przez 24h znosiło hamujący wpływ cukru na aktywność jak i spektrum izoenzymatycz-

ne enzymu. W osiach głodzonych efektem dodania Cxd były zmiany w intensywności wybarwienia poszczegól-

nych form. Podobne efekty modyfikacji jakościowej obserwowano po dodaniu Chmf do wszystkich wariantów

kultury. Powyższe wyniki omawiane są w oparciu o mechanizm represji katabolicznej powodowanej przez cu-

kier.

P10-15

DOES PROLINE ACCUMULATION IN LEAVES ENHANCE PLANT TOLERANCE TO DROUGHT?

Katarina Olsovska , Marek Kovar, Marian Brestic

The Slovak Agricultural University in Nitra, Faculty of Agronomy, Department of Plant Physiology, Nitra

A positive turgor is important to maintain mechanical properties of tissues, leaf growth as well as cell metabolic

activity. When plant tissue water potential decreases, a change in osmotic potential may be able to maintain

turgor pressure at a water potential that would otherwise result in turgor loss. This situation frequently occurs

not only seasonaly (mainly during slow changes in water availability), but also over a diurnal period. Osmotic ad-

justment contributing to the leaf turgor pressure maintenance includes accumulation of osmotically active com-

pounds that leads to osmotic potential decrease. In the whole-vegetation pot experiments with spring barley

cultivars, the slow plant dehydration was evoked after anthesis by withholding water and the water ( w, MPa)

and osmotic ( s, MPa) potentials, relative water content (RWC, %) and free proline content (¾mol.g-1 of fresh

weight) were daily measured and turgor potential ( p, MPa) was calculated from w and s. As seen from the

results, the leaf turgor was maintained (cv. Kompakt, Slovakia), even increased (cv. Dobla, Spain) till the 7th day

of dehydration by decreased osmotic potential to a larger extent in cv. Dobla comparing cv. Kompakt. The os-

motic potential decline was accompanied by accumulation of free proline with twofold concentration in Dobla

compared to Kompakt. Cultivar differences in osmotic potential at turgor loss point ( s0) supported by free

proline data as well as relationship between relative water content and osmotic potential could serve for assess-

ment of plant/cultivar ability to adjust osmotically and withstand the drought.

250

SESJA 10 PLAKATY

P10-16

EFFECT OF ALCOHOL ON ACETALDEHYDE LEVELS AND CATALASE ACTIVITY IN THE RAT

BRAIN

Antonina Kuzmich, Lubov Bardina, Pavel Pronko

Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of Belarus, Grodno

It has been postulated that acetaldehyde, first metabolite of ethanol, responsible for the central effects of etha-

nol. The conversion of ethanol to acetaldehyde is catalyzed by alcohol dehydrogenase, microsomal ethanol oxi-

dizing system and catalase. Now the principal role of catalase in the oxidation of brain ethanol is discussed. The

aim of our investigation was to study the levels of acetaldehyde and the catalase activity in the rat brain after

acute alcohol intoxication and chronic alcohol intoxication. Male rats received a single dose of ethanol (3,5 g/kg,

i.p.). Chronic alcohol intoxication was induced by consuming liquid alcohol diet for 1 month. Control groups re-

ceived isokaloric amount of sucrose. The rats were treated with ethanol (2 g/kg, i.g.) for 1 hour prior to decapita-

tion. During acute alcohol intoxication low levels of acetaldehyde were found in the brain (2.13±0.24 uM). The

catalase activity was not significant different in the control and experimental groups. The acetaldehyde concen-

tration in the brain of chronically alcohol treated rats was significantly elevated compared to control (4.19±0.25

and 1.99±0.25 M, P<0.05). The activity of catalase in the brain of experimental rats did not differ from the con-

trol values. Our results suggest a possible involvement of catalase in the local formation of acetaldehyde in brain.

The raise acetaldehyde levels after alcohol intoxication may be explained as activation of ethanol oxidation both

by catalase and the microsomal ethanol oxidizing system. The contribution of microsomal ethanol oxidizing sys-

tem increased in long-term ethanol consumption.

P10-17

WPŁYW KARBARYLU NA AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW ANTYOKSYDACYJNYCH

Zbigniew Adamski

, Kazimierz Ziemnicki

A: UAM, Pracownia Mikroskopii Elektronowej, Poznań

B: UAM, Zakład Fizjologii Zwierząt

Wpływ karbarylu na aktywność wybranych enzymów antyoksydacyjnych w ciele tłuszczowym larw światłołówki

naziemnicy Spodoptera exigua Hübner i mącznika młynarka Tenebrio molitor L. Larwy owadów poddawano eks-

pozycji na działanie insektycydu karbaminianowego – karbarylu. Pestycyd podawano owadom wraz z pokar-

mem, w dawce odpowiadającej LC

i LC

. Stwierdzono różnice w odporności pomiędzy badanymi gatunkami.

S. exigua okazał sięgatunkiem bardzo wrażliwym, a T. molitor odpornym na działanie insektycydu, w stosowa-

nych stężeniach i czasie ekspozycji. Karbaryl w bardzo istotny sposób wpływał na aktywność enzymów antyoksy-

dacyjnych u obu gatunków. Wysokiej śmiertelności larw S. exigua towarzyszy podwyższona aktywność dysmu-

taz ponadtlenkowych. Badania wskazują, że podczas ekspozycji owadów na działanie pestycydów może docho-

dzić do powstawania reaktywnych form tlenu, dodatkowo uszkadzających komórki. Enzymy antyoksydacyjne

mogą odgrywać ważną rolęw procesie detoksykacji. Duże możliwości zwiększenia aktywności dysmutaz ponad-

tlenkowych umożliwiają przetrwanie populacji w warunkach ekspozycji na działanie karbarylu. W przypadku S.

exigua możliwości detoksykacji wolnych rodników ograniczają sięprzeważnie do niższych stężeń badanego in-

sektycydu, co powoduje że owady te są podatne na jego działanie. Natomiast larwy T. molitor potrafią zwiększać

aktywność enzymów antyoksydacyjnych w szerszym zakresie stężeń szkodliwego związku. Również obserwacje

w mikroskopie elektronowym uwidaczniają wpływ karbarylu na ciało tłuszczowe.

P10-18

ZAWARTOŚĆ DOPAMINY I JEJ METABOLITU DOPAC W MÓZGU SZCZURÓW NARAŻONYCH

NA RTĘĆ W TRAKCIE ROZWOJU ŚRÓDMACICZNEGO

Przemysław Nowak, Joanna Oświęcimska, Wiesław Kiszka, Ryszard Szkilnik, Ryszard Brus

Katedra i Zakład Farmakologii w Zabrzu Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach, Zabrze

Rtęć jest metalem o niezwykłych własnościach. Metaliczna rtęć praktycznie jest nietoksyczna po przyjęciu

dożołądkowym z uwagi na bardzo słabą wchłanialność. Natomiast wchłaniana drogami oddechowymi w posta-

ci oparów jest doskonale absorbowana i po utlenieniu w organizmie staje sięniezmiernie toksycznym związkiem.

ODPOWIEDŹ ORGANIZMÓW NA CZYNNIKI BIOTYCZNE I ABIOTYCZNE

251

Z kolei nieorganiczne jak też organiczne sole rtęci wchłaniają się z przewodu pokarmowego w granicach 10–90%

i w zależności od ilości przyjętego związku, czasu narażenia wywołują objawy toksyczne głównie ze strony

ośrodkowego układu nerwowego. Rtęć łatwo przenika przez łożysko do organizmu płodu osiągając tam pozio-

my równoważne a niekiedy wyższe niż w organizmie matki. Metal ten także łatwo przenika barierękrew-mózg.

Narażenie rtęcią ssaków we wczesnym okresie rozwoju osobniczego a także rozwoju śródmacicznego może po-

wodować u potomstwa poważne zmiany w ośrodkowym układzie nerwowym. Dlatego celem niniejszej pracy

było zbadanie wpływu narażenia rtęcią w trakcie rozwoju śródmacicznego na zawartość dopaminy (DA) i jej me-

tabolitu DOPAC-u w mózgu potomnych, dorosłych szczurów. Szczurzyce szczepu Wistar otrzymywały w trakcie

ciąży do picia wodę(kontrola) lub roztwór HgCl

(50 ppm Hg) ad libitum. W momencie urodzenia potomstwa

roztwór rtęci zastępowano wodą. U 8-tygodniowego potomstwa oznaczono zawartość DA i jej metabolitu DO-

PAC-u w prążkowiu, korze mózgowej i zakręcie Hippokampa metodą HPLC. Wykazano, że narażenie rtęcią w

trakcie rozwoju śródmacicznego obniża zawartość badanych amin w prążkowiu i korze mózgowej potomnych

szczurów.

Finansowane przez Śląską Akademię Medyczną: NN-5–036/00.

P10-19

ZAWARTOŚĆ BIAŁKA, DNA, RNA I CHLOROFILU W KOMÓRKACH CHLORELLA BB Z

BENZO(A)PIRENEM

Grażyna Janikowska, Władysław Wardas, Ewa Adamek

Śląska Akademia Medyczna, Katedra i Zakład Chemii Ogólnej i Analitycznej, Sosnowiec

Celem pracy była ocena zmian zawartości białka, DNA, RNA i chlorofilu w komórkach glonu Chlorella vulgaris Be-

ijerinck 1890, szczep A-8 (Chlorella BB) poddanych działaniu różnych stężeń BaP, które powodowały stymulację

wzrostu ich hodowli. Hodowle Chlorella BB prowadzono w zmodyfikowanej płynnej pożywce Kühla – Lorentze-

na, w temp. pok., w warunkach ciągłego oświetlania lampą żarowo-rtęciową (4800 lx) i ciągłego mieszania. Ho-

dowle badane prowadzono na pożywkach wysyconych BaP (stężenie 0,001 mg BaP/cm

pożywki) – hodowle I

oraz z dodatkiem acetonowych roztworów BaP (stężenie acetonu 0,01% v/v i BaP 0,001, 0,01, 0,1 i 1,0 mg/cm

) –

hodowle II. W tych samych warunkach prowadzono hodowle kontrolne bez dodatku BaP i acetonu – K1, jak rów-

nież bez dodatku BaP, lecz z acetonem – K2. W fazie stacjonarnej hodowli (14 doba) w homogenatach biomasy

komórek oznaczano białko metodą Lowry i wsp., DNA i RNA metodą Wanka F. oraz chlorofil metodą Strain i wsp.

Wraz ze wzrostem wyjściowego stężenia BaP w hodowlach typu I i II obserwowano spadek zawartości białka i

DNA w komórkach Chlorella BB (w porównaniu do obydwu kontroli) oraz spadek zawartości chlorofilu, lecz jedy-

nie dla hodowli typu II. W przypadku hodowli II obserwowano wzrost zawartości RNA, zarówno w stosunku do

kontroli K1, jak i K2, który przy najniższym badanym stężeniu wyjściowym BaP wynosił odpowiednio 40 i 162%.

Ponadto, ze wzrostem wyjściowego stężenia BaP, stwierdzono silną liniową korelację pomiędzy obserwowanymi

zmianami zawartości w komórkach Chlorella BB – RNA i DNA, białka i RNA oraz chlorofilu i białka. Może to ozna-

czać, nie tylko uzależnienie obserwowanych zmian od wyjściowego stężenia BaP, lecz również jego wpływ na

procesy replikacji, transkrypcji, translacji i syntezy chlorofilu w komórkach Chlorella BB.

P10-20

CHITYNAZY ŚCIAN KOMÓRKOWYCH ŁUBINU BIAŁEGO (LUPINUS ALBUS L.)

Mariola Piślewska, Ewelina Śnieżek, Przemysław Wojtaszek

Instytut Chemii Bioorganicznej PAN, Poznań

Ściany komórkowe są integralnym składnikiem żywych komórek, podlegającym dynamicznym zmianom w odpo-

wiedzi na bodźce wewnętrzne i docierające z zewnątrz. Chitynazy, występujące w wakuolach oraz w ścianach

komórkowych, pomimo wielu lat badań pozostają nadal zagadkową grupą białek. Enzymy te hydrolizują wiąza-

nia -1,4 pomiędzy resztami N-acetyloglukozaminy w chitynie – podstawowym składniku ścian komórkowych

grzybów. Sugeruje to udział chitynaz w reakcjach obronnych roślin na infekcje patogenne. Problemem pozostaje

ich rzeczywista rola w biologii roślin, w których ścianach komórkowych nie wykryto jak dotąd chityny. W zawiesi-

nie komórek łubinu białego (Lupinus albus L. odm. Bac) chitynaza jest dominującym składnikiem puli białek wy-

dzielanych do medium hodowlanego [

Wojtaszek P, Piślewska M, Bolwell GP, Stobiecki M (1998) Acta Biochim Polon 45:

281–285

]. Obecna jest ona również w ścianach komórek zawiesiny [

Wojtaszek P, Stobiecki M, Bolwell GP (1997) J Exp

Bot 48: 2015-2021

] lub roślin [

Burzyński A, Piślewska M, Wojtaszek P (2000) Acta Physiol Plant 22: 31–38

]. W reakcji na po-

jawienie sięelisytora grzybowego, zmienia sięzarówno ilość, jak i aktywność enzymatyczna chitynaz [

Wojtaszek P,

252

SESJA 10 PLAKATY

Stobiecki M, Bolwell GP (1997) J Exp Bot 48: 2015-202, Burzyński A, Piślewska M, Wojtaszek P (2000) Acta Physiol Plant 22:
31–38

]. Ponieważ enzym występuje w roślinach zdrowych, zbadano jego potencjalny udział w procesach rozwo-

jowych, a zwłaszcza interakcje chitynaza – fitohormony. Stwierdzono, że ilość chitynazy w płynach apoplastycz-

nych izolowanych z roślin lub zawiesiny komórek poddanych działaniu regulatorów wzrostu, zmienia sięw zale-

żności od rodzaju i stężenia zastosowanego fitohormonu. * Studentka IV roku biotechnologii Wydziału Biologii

UAM w Poznaniu. Część prezentowanych wyników stanowi fragment jej pracy magisterskiej, wykonywanej w

IChB PAN.

Badania finansowane są przez Komitet Badań Naukowych w ramach projektu badawczego 6 P04C 022 13.

P10-21

PROFILE KOMÓRKOWYCH KWASÓW TŁUSZCZOWYCH FILOGENETYCZNIE POKREWNYCH

GATUNKÓW BAKTERII DESULFOVIBRIO DESULFURICANS I BILOPHILA WADSWORTHIA

Zofia Dzierżewicz, Beata Cwalina, Ewa Chodurek, Marzena Jaworska-Kik

Katedra Biologii Molekularnej, Biochemii i Biofarmacji ŚAM, Sosnowiec

Porównawcze badania bakterii Desulfovibrio desulfuricans i Bilophila wadsworthia podjęto ze względu na ich fi-

logenetyczne pokrewieństwo. Obydwa gatunki należą do Gram-ujemnych, beztlenowych pałeczek, których rola

w organizmie człowieka nie została dotychczas wyjaśniona. Sugeruje się, że bakterie te mogą uczestniczyć w

etiopatologii niektórych schorzeń (zwłaszcza przewodu pokarmowego), przebiegających ze stanami zapalnymi.

Badania profili komórkowych kwasów tłuszczowych (KKT) oraz zawartości kwasów uważanych za biomarkery

określonego rodzaju lub gatunku bakterii umożliwiają różnicowanie szczepów. Celem pracy było porównanie

profili KKT (badanych techniką GC-MS) sześciu jelitowych szczepów D. desulfuricans oraz sześciu kultur B. wad-

sworthia, wyprowadzonych z liofilizatu typowego szczepu CCUG 32349. Bakterie namnażano w podłożu płyn-

nym z tioglikolanem. Uzyskane wyniki wykazały, że w przypadku jelitowych szczepów D. desulfuricans nastąpiło

znaczne zróżnicowanie profili KKT – w przeciwieństwie do bardzo dużego podobieństwa (>95%) profili uzyska-

nych wcześniej dla kultur bakterii namnażanych w standardowej pożywce z mleczanem i siarczanem. Różnice

dotyczyły zawartości wszystkich badanych kwasów, w tym także kwasów i-C17:1 oraz i-C15:0, będących biomar-

kerami odpowiednio rodzaju Desulfovibrio i gatunku D. desulfuricans. W przypadku B. wadsworthia stwierdzo-

no istotny wpływ sposobu prowadzenia hodowli, a w szczególności czasu upływającego między kolejnymi pasa-

żami, na profile KKT tych bakterii. Zmianie ulegały nie tylko udziały poszczególnych kwasów w puli KKT, ale także

stosunki ilości kwasów nasyconych do nienasyconych. Uzyskane wyniki dokumentują zróżnicowanie w obrębie

badanych gatunków bakterii i wskazują na istotne różnice między nimi, pomimo filogenetycznego pokrewie-

ństwa.

P10-22

ZMIANY AKTYWNOŚCI ENZYMÓW ODPOWIEDZIALNYCH ZA USUWANIE H

W LIŚCIACH

PSZENICY PODDANYCH DZIAŁANIU HALOKSYFOPU – ETOKSYETYLU

Urszula Wiloch, Halina Mioduszewska

Zakład Genetyki i Fizjologii Roślin, Instytut Biologii, Akademia Podlaska, Siedlce

Haloksyfop-etoksyetylu należy do grupy graminicydów pochodnych kwasu aryloksyfenoksypropionowego. Ba-

dano wpływ haloksyfopu-etoksyetylu na wzrost liści pszenicy i zmiany aktywności peroksydazy askorbinianowej

(APX) i gwajakolowej (POX) oraz katalazy (CAT) głównych enzymów odpowiedzialnych za rozkład H

. Liść

dzielono na 4 części: pierwszą stanowił 1 cm fragment powyżej strefy nakraplania, drugą 1 cm fragment poniżej,

gdzie nakraplano haloksyfop-etoksyetylu. Pozostałą część liścia dzielono na 2 równe części, które stanowiły frag-

ment 3 i 4. W każdej części mierzono aktywność APX, POX oraz CAT. Rośliny z obciętymi liśćmi na wysokości po-

chewek pozostawiano na okres 4, 8, 12, 24 i 48 godzin i po tym czasie mierzono ich przyrost . Na podstawie prze-

prowadzonych badań wykazano, że haloksyfop-etoksyetylu hamuje wzrost liści pszenicy w 60% już po 4 godzi-

nach i stan ten nie ulegał zmianie w pozostałych godzinach obserwacji. Uzyskane wyniki sugerują, że aktywność

enzymów jest ściśle związana ze strefą liścia. I tak, w przypadku APX najwyższą aktywność notowano w szczyto-

wej strefie liścia oraz w części będącej tuż poza strefą nakraplania, najniższy natomiast w bazalnej. Podobną ten-

dencjęwykazywała POX, jednakże jej aktywność była niższa niż APX. Odwrotny rodzaj zmian notowano w przy-

padku CAT, gdzie w szczytowej strefie liścia jej aktywność była niższa, za to w 3 i 4 fragmencie osiągała taką

samą wartość jak kontrola.

ODPOWIEDŹ ORGANIZMÓW NA CZYNNIKI BIOTYCZNE I ABIOTYCZNE

253

Wyniki uzyskane w tej pracy sugerują, że fitotoksyczne działanie haloksyfopu-etoksyetylu jest związane z meta-

bolizmem powstawania aktywnych form tlenu.

P10-23

STRES CHŁODU MODYFIKUJE PROCESY UTLENIANIA LIPIDÓW I AKTYWNOŚĆ EZYMATY-

CZNEGO SYSTEMU ANTYOKSYDACYJNEGO W KONTROLNYCH I OSMOKONDYCJONOWA-

NYCH NASIONACH SOI

Małgorzata M. Posmyk, Krystyna M. Janas

Katedra Regulacji Wzrostu Roślin, Uniwersytet Łódzki, Łódź

Rośliny nie kontrolują temperatury środowiska, w którym żyją wykształciły, więc dwie strategie pozwalające eg-

zystować w niesprzyjających warunkach termicznych – unikanie stresu bądź jego tolerancję. Nabywanie toleran-

cji jest procesem złożonym i długotrwałym, wiąże sięze zdolnością naprawy uszkodzeń wywoływanych czynni-

kiem stresowym. Literatura potwierdza, że stresy biotyczne i abiotyczne, w tym niska temperatura powodują

zwiększenie syntezy wolnych rodników, a co za tym idzie uszkodzeń powodowanych ich reaktywnością. Celem

pracy było zanalizowanie potencjalnej skuteczności enzymatycznego systemu usuwania reaktywnych form tle-

nu, czyli zmian aktywności SOD, CAT, GR i APX, wywołanych chłodem 1°C w kontrolnych i osmokondycjonowa-

nych nasionach soi (Glycine max (L.) Merr. cv. Essor). Oznaczono stopień utlenienia tłuszczów jako jeden z efek-

tów działania chłodu. Po 4 dniach imbibicji w 1°C zaobserwowano postępującą kumulację MDA w osiach zarod-

kowych izolowanych z nasion kontrolnych w przeciwieństwie do osmokondycjonowanych. Niska temperatura

stymulowała aktywność SOD, CAT, GR w przypadku nasion wrażliwych – kontrolnych i niewrażliwych – osmo-

kondycjonowanych. Jednakże aktywność badanych enzymów była znacznie wyższa w przypadku kondycjono-

wanych nasion zarówno bezpośrednio po stresie, jak i po okresie 24 godzinnego ocieplenia w optymalnej tem-

peraturze 25°C. Zdolność rośliny do usuwania aktywnaego tlenu jako aspekt obrony i czynnik regulujący toleran-

cję bądź wrażliwość na stres chłodu to temat dyskutowany w pracy.

P10-24

WPŁYW POCHODNYCH STILBENU NA PRZEBIEG REAKCJI WOLNORODNIKOWYCH PODCZAS

OSTREGO ZAPALENIA TRZUSTKI

Michał Ławiński

, Zbigiew Śledziński

, Wojciech Bogusławski

, Michał Woźniak

A: I Katedra i Klinika Chirurgii AMG

B: Katedra i Zakład Chemii Ogólnej AMG

Ostre Zapalenie Trzustki [OZT] jest chorobą o ciężkim przebiegu obarczoną dużą śmiertelnością i wysokim odset-

kiem powikłań. Udowodniono ważną rolęstresu oksydacyjnego w przebiegu OZT. Celem naszych badań jest

sprawdzenie wpływu pochodnych stilbenu, znanych w literaturze jako silne antyutleniacze, na przebieg reakcji

wolnorodnikowych w trakcie OZT wywołanego wstecznym podaniem do przewodu wątrobowo-trzustkowe-

go[PWT] hydroperoksydu butylu. W tym celu badane szczury rasy Wistar podzielono na trzy grupy. Grupa I-prze-

prowadzono obserwacje 1 godzinne, Grupa II-3 godzinne, Grupa III-6 godzinne. W każdej z grup wyodrębniono

zwierzęta kontrolne, którym podawano do PWT sól fizjologiczną. Pozostałe zwierzęta poddano działaniu odpo-

wiednio: 30, 60,90,120,150 mM roztworowi hydroperoksydu butylu. Drugi etap badań polegał na dootrzewno-

wym podaniu zwierzętom pochodnych stilbenu. Zaobserwowano znaczące spowolnienie reakcji wolnorodniko-

wych potwierdzonych oznaczeniami stężenia dialdehydu malonowego, grup karbonylowych białek, grup SH.

Dodatkowym potwierdzeniem wyników są zdjęcia preparatów z mikroskopu świetlnego i elektronowego.

254

SESJA 10 PLAKATY

P10-25

WPŁYW WARUNKÓW PRZECHOWYWANIA NA STAN BIAŁEK STRUKTURALNYCH

I FUNKCJONALNYCH BAKULOWIRUSÓW SEMNPV

Agata Jakubowska, Jadwiga Ziemnicka

Instytut Ochrony Roślin, Poznań

Poliedryna – białko strukturalne bakulowirusów, stanowi grubą warstwęochronną zabezpieczającą je przed nie-

korzystnymi warunkami środowiska. Dlatego ważne jest, aby białko to zachowywało swoje właściwości podczas

przechowywania preparatów wirusowych. Poliedryna nie jest konieczna do replikacji bakulowirusów. Nie znany

jest udział tego białka w infekcji drogą per os, wiadomo natomiast, że wraz z wiekiem preparatu wirulencja jego

maleje. Nie wiadomo w jakim stopniu jest to zależne od zmian w białkach strukturalnych i funkcjonalnych, a w ja-

kim stopniu od samego DNA. Dysponując materiałem wirusowym zbieranym na przestrzeni 35 lat przechowywa-

nym w różny sposób zbadano wpływ wieku i formulacji wirusów na stan białek. Wirusy w postaci zawiesiny po-

liedrów wodzie, proszku wirusowego przygotowywanego metodą Dulmage’a oraz maceratu z owadów prze-

chowywane były w temperaturze 4

C. Elektroforeza białek w 12% żelu poliakrylamidowym z SDS-em wykazała

znaczną degradacjępolipeptydów wirusów przechowywanych w postaci proszku, podczas gdy białka wirusów

przechowywanych w postaci zawiesiny wydawały siębyć nienaruszone. Przeprowadzono także oddzielne roz-

działy dla poliedryny oraz białek wirionów. Białkiem najbardziej zdegradowanym jest poliedryna. Badania mają

na celu ustalenie jaki sposób przechowywania bakulowirusów jest najkorzystniejszy dla jego przyszłego, park-

tycznego zastosowania.

P10-26

ZABLOKOWANIE TOKSYCZNEGO WPŁYWU OŁOWIU NA CHLORELLA VULGARIS PRZEZ

24-EPIBRASSINOLID

Andrzej Bajguz

Uniwersytet w Białymstoku, Instytut Biologii, Białystok

W naturalnym środowisku na rośliny działają różnorodne czynniki stresowe o charakterze biotycznym i abiotycz-

nym. Mogą one spowodować zakłócenia we wzroście, rozwoju i procesach fizjologiczno-metabolicznych roślin.

Od natężenia i czasu działania czynnika stresowego zależy, czy zmiany będą miały charakter nie- lub odwracalny.

W wyniku wysokiego nasilenia stresu dochodzi do trwałego uszkodzenia komórek i śmierci rośliny. Przystosowa-

nie sięroślin do skrajnych warunków środowiska polega przede wszystkim na tolerancji i adaptacji do stresu.

Brassinosteroidy (BR) – hormony roślinne – oddziaływują na rośliny przystosowane do życie w różnorodnych,

często niekorzystnych warunkach środowiska: susza, ekstremalnie niska lub wysoka temperatura, zasolenie,

działanie herbicydów, itp. Pod wpływem stresu uaktywnia sięstymulujące działanie BR, które niweluje nieko-

rzystne reakcje roślin na stres. Przeprowadzone badania miały na celu stwierdzenie antystresowej aktywności BR

w przypadku interakcji 24-epibrassinolidu (24-epiBL) z ołowiem na wzrost i rozwój jednokomórkowego, eukario-

tycznego glonu Chlorella vulgaris Beijerinck (Chlorophyceae). W badaniach zastosowano: 24-epiBL w stężeniu

-8

M – najbardziej optymalnym biologicznie oraz ołów w zakresie stężeń 10

-6

–10

-3

M. Ołów w stężeniu 10

-3

zarówno w interakcji z 24-epiBL lub sam, wykazuje efekt letalny na komórki C. vulgaris. Z kolei współdziałanie

24-epiBL z ołowiem (10

-6

–10

-4

M) prowadzi do stymulacji liczby komórek glonu, natomiast ołów działa jako silny

inhibitor wzrostu C. vulgaris. 24-EpiBL w interakcji z ołowiem blokuje akumulacjętegoż metalu przez komórki

glonu. Największe zablokowanie akumulacji ołowiu zanotowano w kombinacji 24-epiBL z ołowiem w stężeniu

-4

M. W związku z tym 24-epiBL posiada antystresowy wpływ na C. vulgaris wywołany przez ołów. Zawartość

ołowiu w komórkach była proporcjonalna do zastosowanego stężenia metalu. Proces zablokowania akumulacji

ołowiu przez 24-epiBL jest związany ze stymulacją liczby komórek glonu oraz wzrostem pH pożywki (5,33–5,83).

Z kolei sam ołów powoduje obniżenie pH do 3,30. Niskie pH zwiększa toksyczność ołowiu w C. vulgaris.

ODPOWIEDŹ ORGANIZMÓW NA CZYNNIKI BIOTYCZNE I ABIOTYCZNE

255

P10-27

AKTYWNOŚĆ BIOCHEMICZNA ACETYLOCHOLINY I TAURYNY W GLONIE CHLORELLA

VULGARIS

Andrzej Bajguz, Romuald Czerpak

Uniwersytet w Białymstoku, Instytut Biologii, Białystok

Acetylocholina i tauryna należą do kwaśnych amin alifatycznych pochodnych etanu, pospolicie występujących w

komórkach zwierzęcych, zwłaszcza w układzie nerwowym, gdzie pełnią głównie rolę neurotransmiterów. Obie

aminy występują także w różnych taksonomicznie gatunkach roślin naczyniowych, glonów, grzybów. Wykazują

w nich znaczną aktywność metaboliczną, poznaną jednakże w niewielkim stopniu. Dlatego przeprowadzono po-

równawcze badania dotyczące wpływu acetylocholiny i tauryny, jako analogów chemicznych, na dynamikę

wzrostu komórek glonu Chlorella vulgaris (zielenice) i zawartość w nich: chlorofili a i b, monosacharydów i białek

rozpuszczalnych w wodzie. Obie aminy wykazały największą aktywność stymulującą na analizowane parametry

biochemiczne w zakresie stężeń 10

-4

– 10

-5

M w 3 dniu hodowli glonów, z wyjątkiem barwników fotosynte-

zujących, których zawartość była najintesywniej stymulowana między 6 a 9 dniem hodowli Chlorella vulgaris.

Acetylocholina w porównaniu z tauryną wykazuje znacznie większą aktywność stymulującą na zawartość w ko-

mórkach białek rozpuszczalnych i monosacharydów. Natomiast na intensywność namnażania siękomórek glo-

nów oraz zawartość w nich chlorofili a i b stymulujące działanie obu badanych amin jest prawie jednakowe.

P10-28

ZMIANY STRUKTURY CYTOSZKIELETU AKTYNOWEGO PODCZAS PINOCYTOZY

INDUKOWANEJ U AMOEBA PROTEUS

Wanda Kłopocka, Robert Makuch

Instytut Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego, Warszawa

Spośród białek tworzących cytoszkielet komórek migrujących, system mikrofilamentów wydaje siębyć odpowie-

dzialny za migrację oraz za reakcje związane z ruchliwością: chemotaksję, fagocytozę, pinocytozę. Reorganizacja

cytoszkieletu aktynowego umożliwia komórkom każdą reakcjęzwiązaną ze zmianą kierunku ich migracji, polary-

zacji i kształtu, a także z zahamowaniem lokomocji. U Amoeba proteus bodźce działające równomiernie na całą

powierzchniękomórki (np. induktory pinocytotyczne, chlorek choliny) wpływają na całą sieć mikrofilamentów.

Reakcja tak stymulowanych komórek przejawia sięutratą polaryzacji, zahamowaniem lokomocji i stopniową

zmianą kształtu ameby aż do utworzenia rozety (w przypadku pinocytozy z licznymi kanałami), bądź formy kuli-

stej. Badano zawartość F-aktyny na różnych etapach reakcji wywołanej u Amoeba proteus induktorami pinocyto-

tycznymi: 125 mM Na

i 125 mM K

oraz chlorkiem choliny. Obserwowane w każdej sytuacji doświadczalnej wy-

raźne zmiany struktury aparatu kurczliwego, a mianowicie stopniowy spadek ilości F-aktyny w czasie reakcji ko-

mórki, wynikające z rozpadu sieci mikrofilamentów i depolimeryzacji aktyny aż do przejściowej, niemal całkowi-

tej dezintegracji cytoszkieletu aktynowego po 45 min działania KCl. Procesy te towarzyszą zmianom kształtu ko-

mórki oraz formowaniu kanałów pinocytotycznych. Po spadku ilości F-aktyny do pewnej wartości krytycznej re-

akcja pinocytotyczna wygasa. Rekonstrukcja aparatu kurczliwego jest niezbędna dla odzyskania przez komórkę

zdolności reagowania na bodźce i powrotu do migracji.

P10-29

UWALNIANIE AMIN BIOGENNYCH W PRĄŻKOWIU MÓZGU SZCZURÓW PO PODANIU

ANTAGONISTÓW OŚRODKOWYCH RECEPTORÓW DOPAMINOWYCH D

, D

I D

TECHNIKĄ

MIKRODIALIZY

Przemysław Nowak, Joanna Oświęcimska, Ryszard Brus

Katedra i Zakład Farmakologii w Zabrzu Śląskiej Akademii Medycznej w Katowicach, Zabrze

Dopamina (DA) jest neuroprzekaźnikiem uczestniczącym w szeregu procesach fizjologicznych zachodzących w

ośrodkowym układzie nerwowym (OUN) jak też w zaburzeniach czynności OUN, na przykład w schizofrenii, cho-

robie Parkinsona i innych. DA oddziaływuje poprzez swoiste receptory dopaminowe klasy D

i D

. Ostatnio odkry-

to i sklonowano nowe podtypy receptora DA klasy D

a mianowicie receptor DA D

i D

. Są one obiektem inten-

256

SESJA 10 PLAKATY

sywnych badań z uwagi na możliwość otrzymania nowych leków psychotropowych (antypsychotycznych) o in-

nym niż aktualnie używane profilu działania. Niedawno zsyntetyzowano antagonistów receptora DA D

(U-99194A) oraz DA D

(U-101958), których farmakologiczne właściwości nie są jeszcze poznane. Dlatego celem

niniejszego doświadczenia było zbadanie wpływu powyższych związków na uwalnianie amin biogennych w

prążkowiu oceniane techniką przyżyciowej mikrodializy mózgu szczurów. Działanie zostało porównane z efekta-

mi klasycznego neuroleptyku – haloperidolu. Dorosłym szczurom samcom szczepu Wistar o masie ok. 350 g w

uśpieniu indukowanym ketaminą i diazepamem implantowano do prawego prążkowia kaniulęmikrodializacyjną

(A,+0.8; L,+3.0; V,-7.0 mm). Dzień później swobodnie poruszającym sięzwierzętom po 2-godzinnym okresie

stabilizacji podawano dootrzewnowo ekwimolarne dawki badanych związków i przez kolejne 3 godziny prowa-

dzono dializęprążkowia. W uzyskanych dializatach metodą HPLC (z kolumetrycznym detektorem elektroche-

micznym) oznaczano zawartość dopaminy, kwasu dwuhydroksyfenylooctowego i kwasu homowalinowego. Wy-

niki badań wykazały, że w przeciwieństwie do haloperidolu nowi antagoniści ośrodkowych receptorów DA D

nie wpływają na uwalnianie badanych amin w prążkowiu szczura.

Finansowane przez Śląską Akademię Medyczną: NN-4-016/00.

P10-30

WPŁYW AGONISTY OŚRODKOWYCH RECEPTORÓW DOPAMINOWYCH D

(7-OH-DPAT) NA

WYCHWYT I WBUDOWYWANIE (

H)GLUKOZY W MÓZGU SZCZURÓW PRENATALNIE

NARAŻONYCH NA RTĘĆ

Ryszard Szkilnik, Wiesław Kiszka, Janusz Konecki, Adam Durczok, Ryszard Brus

Katedra i Zakład Farmakologii oraz Katedra, Zakład Histologii i Embriologii w Zabrzu Śląskiej Akademii Medycznej w

Katowicach, Zabrze

Uprzednio wykazaliśmy, że narażenie szczurów w okresie rozwoju płodowego kadmem, ołowiem lub rtęcią

wywołuje dalekosiężne skutki manifestujące się zaburzeniami funkcji układów neuroprzekaźnikowych, głównie

dopaminowego, mózgu dorosłego potomstwa. Ponieważ ośrodkowy układ dopaminowy reguluje procesami

energetycznymi mózgu, celem niniejszych badań była ocena wpływu prenatalnego narażenia rtęcią na wychwyt i

wbudowywanie egzogennej glukozy w mózgu potomnych szczurów. Szczurzyce szczepu Wistar otrzymywały w

trakcie ciąży do picia wodę(kontrola) lub roztwór HgCl

(50 ppm Hg) ad libitum. W momencie urodzenia potom-

stwa roztwór rtęci zastępowano wodą. Dalsze doświadczenie wykonano na potomnych 8 tygodniowych sam-

cach. Szczurom obu grup podano agonistęośrodkowych receptorów dopaminowych (DA) D

– 7-OH-DPAT 2.0

mg/kg IP po czym po 15 minutach D-[6-

H]glukozę500 mCi/kg IP i dekapitowano po 15 minutach i 4 godzinach.

W wybranych strukturach mózgu po zważeniu, rozpuszczeniu i dodaniu płynu scyntylacyjnego, zliczano liczbę

impulsów dwukrotnie przez 10 minut (DPM/100 mg świeżej tkanki) uśredniając wynik. Wykazano, że narażenie

rtęcią w trakcie rozwoju śródmacicznego nasila wbudowywanie (

H)glukozy w prążkowiu i korze mózgowej po

podaniu 7-OH-DPAT, nie powodując zmian w zakręcie Hippokampa, pniu i móżdżku potomnych, dorosłych

szczurów.

Finansowane przez Śląską Akademię Medyczną: NN-5–036/00.

P10-31

WPŁYW OŚWIETLENIA NA ZMIANY PROFILI FENYLOPROPANOIDÓW W SIEWKACH ŁUBINU

BIAŁEGO (LUPINUS ALBUS L.)

Paweł Bednarek, Przemysław Wojtaszek, Maciej Stobiecki

Pracownia Fitochemii, Instytut Chemii Bioorganicznej PAN, Poznań

Związki fenolowe, w szczególności flawonoidy odgrywają istotną rolęw zabezpieczaniu roślin przed promienio-

waniem UV. Celem przeprowadzonych badań było określenie, czy różnice w oświetleniu siewek łubinu białego

podczas ich wzrostu mają wpływ na skład ilościowy wolnych i glikozylowanych flawonoidów oraz izoflawono-

idów występujących w tkance roślinnej. Badania zmian ilościowych w profilach fenolowych metabolitów wtór-

nych przeprowadzono stosując metody chromatografii cieczowej z detekcją UV. Do identyfikacji substancji wy-

korzystano standardy związków fenolowych, których obecność w łubinie białym została potwierdzona wcześniej

Cześć związków (acylowane pochodne glikozydów izoflawonoidów) została zidentyfikowana na podstawie

widm masowych zarejestrowanych metodą elektrorozpraszania po rozdziale mieszanin substancji na chromato-

grafie cieczowym (LC/ESI/MS). Do badań wykorzystano siewki łubinu białego rosnące w pięciu różnych warun-

ODPOWIEDŹ ORGANIZMÓW NA CZYNNIKI BIOTYCZNE I ABIOTYCZNE

257

kach oświetlenia. Różnice w oświetleniu roślin miały zasadniczy wpływ na ilość obecnych w liściach glikozydów

kaempferolu i izorhamnetyny. Brak światła wywoływał znaczne obniżenie całkowitej ilości malonylowanych po-

chodnych glikozydów izoflawonoidów. Obserwowano również zmiany we względnych ilościach wolnych agliko-

nów izoflawonoidów i ich połączeń cukrowych.

P10-32

REAKCJA OPORNEGO NA CHROM MUTANTA PICHIA GUILLIERMONDII 1352 NA STRES

WYWOŁANY SUBLETALNYMI STĘŻENIAMI CR (VI)

Anita Jaglarz

, Paweł Kaszycki

, Daria Fedorowych

, Helena Kszeminska

, Luba Babjak

, Henryk Kołoczek

A: Akademia Rolnicza, Zakład Biochemii, Wydział Ogrodniczy, Kraków

B: Ukraińska Akademia Nauk, Instytut Biochemii im. A.V.Palladina, Wydział Regulacyjnych Systemów Komórki,

Lwów, Ukraina

Mutant szczepu P. guilliermondii 1352 został pozyskany metodą środowiskowej mutagenezy UV oraz selekcji w

obecności związków chromu. Hodowle mutanta prowadzono w podłożach zawierających Cr (VI) w stężeniach

0.4 oraz 1.0 mM. Badano kinetykęakumulacji Cr w czasie 36 godz. inkubacji. W porównaniu ze szczepem wyjś-

ciowym (typ dziki), mutant cechował sięzwiększoną przeżywalnością w obecności 1 mM Cr (VI) (60% w stosunku

do ok. 5%), natomiast komórkowy poziom zakumulowanego Cr był znacząco niższy (o ok. 0.4 mg/g s.m., tj. o ok.

30%) i osiągał maksimum po 24 h (1.3 mg/g s.m.), po czym spadał (do ok. 0.9 mg/g s.m.). Pod wpływem Cr oba

szczepy syntetyzowały ryboflawinę(RF) w il. do 8 mg/ml podłoża, jednak wykazując odmienną kinetykęprocesu:

u mutanta następował gwałtowny początkowy przyrost RF (do 7 mg/ml w czasie 3 godz.), podczas gdy u typu

dzikiego synteza przebiegała w sposób ciągły (do 8 mg/ml w ciągu 24 godz.). Dodanie RF (20 mg/ml) do podłoża

powodowało wzrost przeżywalności szczepu dzikiego w obecności 1 mM Cr (VI) do wartości kontrolnej (hodow-

la mutanta) oraz ok. 2-krotny spadek ilości zakumulowanego Cr. Wydaje się, że RF może odgrywać istotną rolę w

procesach bioremediacji związków chromu. Obserwacje mikroskopowe wykazały różnice w morfologii komórek

mutanta i typu dzikiego w podłożu kontrolnym, a inkubacja z 1 mM Cr (VI) wywoływała zmiany wyłącznie w

morfologii hodowli komórek szczepu dzikiego. Elektroforetyczne profile białkowe obu szczepów są zbliżone,

jednakże mutant nie wykazuje obecności białka ok. 47 kDa, którego synteza u typu dzikiego była stymulowana

inkubacją z Cr.

P10-33

THE PARTICIPATION OF CHROMIUM (VI) IN THE REGULATION OF RIBOFLAVIN

BIOSYNTHESIS IN YEAST

Daria Fedorowych

, Helena Kszeminska

, Luba Babjak

, Dmytro Yanovych

, Paweł Kaszycki

Henryk Kołoczek

A: Division of Regulatory Cell Systems, A. V. Palladin Institute of Biochemistry, National Academy of Sciences of

Ukraine, Lviv, Ukraine

B: Agriculture University, Biochemistry Department, Krakow, Poland

Iron deficiency in the cells of Pichia guilliermondii and in some other yeast species causes riboflavin (RF) oversyn-

thesis as a result of coordinative derepression of most enzymes involved in this process. It was shown that Cr (VI)

(0,2–0,5mM), but not Cr (III), gives rise to the overproduction of RF in flavinogenic yeast grown in a synthetic me-

dium containing yeast extract (0,1–0,3%) and high concentration of iron (0,2 mg/l). Some of the yeast species

(P.guilliermondii, Candida famata, Debaryomyces kloeckeri) under these conditions produce even higher amo-

unt of RF than do the iron deprived cells. The increased (5–15 times) level of GTP cyclohydrolase activity, the first

enzyme of the riboflavin synthesis pathway, was observed in the Cr (VI) supplemented cells in situ. However,

such an increase was not caused by iron-deficiency since cells contained the same amount of Fe as those grown

without Cr (VI). Simultaneously, in Cr (VI)-supplemented cells the accumulation of 0,5–1 mg Cr per g of dry we-

ight was observed. The possible mechanisms of the influence of Cr on RF biosynthesis are discussed.

258

SESJA 10 PLAKATY

P10-34

CYJANEK JAKO CZYNNIK STRESOWY W GENERACJI WOLNYCH RODNIKÓW TLENOWYCH W

HODOWLACH PSEUDOMONAS SP.

Jerzy Chmielowski, Zbigniew Jarząbek, Małgorzata Jabłońska

Katedra Biochemii, Uniwersytet Śląski, Katowice

Celem pracy było wykazanie skutków oddziaływania cyjanku potasu na bakterie na przykładzie szczepu Pseudo-

monas sp. Cyjanek powoduje u tych bakterii rearanżacjęłańcucha oddechowego w sposób umożliwiający respi-

racjęz pominięciem cytochromu a

, zaś dłuższe działanie cyjanku wyzwala indukcjęenzymów degradujących ten

związek. Stwierdzono, że jednorazowe wprowadzenie dawki 20 mM cyjanku potasu (1.3 g/l) wskutek zabloko-

wania łańcucha oddechowego wywoływało generacjęwolnych rodników tlenowych. Stosując metody spektro-

fotometryczne wykazano, że cyjanek powodował ponad dziesięciokrotny wzrost generacji anionorodnika po-

nadtlenkowego oraz rodnika hydroksylowego. Dodanie cyjanku przyczyniało sięteż do nagłego spadku biomasy

w hodowlach bakterii. We wcześniejszych badaniach modelowych wykazano, że jon amonowy jest skutecznym

zmiataczem wolnych rodników tlenowych, głównie rodnika hydroksylowego. Podjęto więc próbę zmiatania wol-

nych rodników tlenowych przez jon amonowy w hodowlach Pseudomonas sp. poddanych działaniu dawki 20

mM cyjanku potasu. Wykazano, że w kaskadzie wolnych rodników tlenowych jon amonowy w stężeniu 100 mM

nie powodował istotnych zmian generacji anionorodnika ponadtlenkowego, natomiast zmiatał około 50% rod-

nika hydroksylowego. Jon amonowy ograniczał również wolnorodnikową lizękomórek bakterii. Na podstawie

przeprowadzonych obserwacji można spodziewać się, że toksyczne działanie cyjanku na niektóre bakterie może

być związane nie tylko z dezaktywacją łańcucha oddechowego, ale również generacją kaskady wolnych rodni-

ków tlenowych.

P10-35

AKTYWNOŚĆ FOSFOFRUKTOKINAZ LIŚCI TOPOLI (POPULUS DELTOIDES) TRAKTOWANYCH SO

Gabriela Lorenc-Plucińska, Anna Szadel

Instytut Dendrologii Polskiej Akademii Nauk, Kórnik

Jednym z objawów niekorzystnego wpływu gazowych zanieczyszczeń atmosfery na wzrost i rozwój roślin są

zmiany metabolizmu sacharozy. W liściach topoli traktowanych SO2 obserwowano redukcjęnatężenia syntezy

sacharozy na świetle [

Lorenc-Plucińska G, 1998. J. Exp. Bot. 4: 213–219

]. Stwierdzano także wzrost katalitycznej ak-

tywności syntazy sacharozy (SuSy). Degradacja sacharozy via SuSy jest zależna od stężenia fruktozo-2,6-bisfosfo-

ranu (Fru2,6BP) i aktywności PPi-fosfofruktokinazy (PFP). Dlatego też analizowano, czy indukowany przez SO

metabolizm sacharozy via SuSy jest połączony ze zmianami Fru2,6BP i PFP. Badania wykonano na rozwiniętych

liściach topoli (Populus deltoides Bartr. Ex Marsh) traktowanych SO

w stężeniu 0.5–5.0 mol m

-3

przez 30 min w

warunkach wcześniej opisanych [

Lorenc-Plucińska G, 1998. J. Exp. Bot. 4: 213–219

]. Ekstrakcjęi identyfikacjęFru2,6BP

przeprowadzono zgodnie z procedurą przedstawioną w [

Lorenc-Plucińska G, 1998. J. Exp. Bot. 4: 213–219

]. Aktyw-

ność PFP, a także ATP-fosfofruktokinazy (PFK) analizowano tak jak w [

A Copeland L, de Lima ML, 1992. Plant Physiol.

140: 641–645

], z niewielkimi modyfikacjami. Stwierdzono, że pod wpływem zastosowanej dawki SO

wzrasta stę-

żenie Fru2,6BP w cytozolu z 3.2 do 7.3 mM. Takie stężenia Fru2,6BP powinny być wystarczające dla pełnej akty-

wacji PFP, jako że stała aktywacji K

= 3–50 mM. Jednakże aktywność PFP nie ulegała istotnym zmianom. Z dru-

giej strony działanie SO

prowadziło do wzrostu wartości stosunku aktywności PFP/PFK, co potwierdza możli-

wość indukcji przez SO

metabolizmu sacharozy via SuSy.

Badania wykonano w ramach realizacji projektu nr 6 PO4G 057 16 finansowanego przez KBN.

ODPOWIEDŹ ORGANIZMÓW NA CZYNNIKI BIOTYCZNE I ABIOTYCZNE

259

P10-36

ZALEŻNOŚĆ POZIOMU REAKTYWNYCH FORM TLENU ORAZ AKTYWNOŚCI ENZYMÓW

ANTYOKSYDACYJNYCH OD WIEKU ROŚLIN I CZASU DZIAŁANIA Cd

Ewa Skórzyńska-Polit, Maria Drążkiewicz, Zbigniew Krupa

Zakład Fizjologii Roślin UMCS, Lublin

Oznaczano poziom reaktywnych form tlenu (RFT) i aktywność enzymów antyoksydacyjnych (dysmutazy ponad-

tlenkowej – SOD, peroksydazy gwajakolowej – POX, katalazy – CAT) w pierwszorzędowych liściach Phaseolus

coccineus kontrolnej i traktowanej 25 M Cd w dwóch różnych stadiach wzrostu po 6, 8 i 12 dniach działania

metalu. W czasie wzrostu młodych roślin kontrolnych stwierdzono wzrost zawartości anionorodnika ponadtlen-

kowego (O

) i nadtlenku wodoru (H

), spadał zaś poziom rodnika hydroksylowego (OH

). Zmianom w pozio-

mie RFT towarzyszył stopniowy spadek aktywności SOD i CAT, nie zmieniała sięzaś aktywność POX. W czasie

wzrostu starszych roślin kontrolnych obserwowano stopniowy wzrost zawartości O

, spadek ilości H

i OH

wzrastała zaś aktywność SOD i POX. Poddanie młodych roślin działaniu Cd spowodowało, zależny od czasu

działania metalu, wzrost zawartości O

, spadek OH

oraz redukcjępoziomu H

. Stopniowo wzrastała aktyw-

ność SOD, zaś aktywności CAT i POX były swoimi odwrotnościami, lecz zawsze były one wyższe niż u roślin kon-

trolnych. U roślin starszych traktowanych Cd wysoki poziom O

stwierdzono jedynie po 8 dniach działania meta-

lu. Podobnie jak u młodszych roślin traktowanych Cd obserwowano redukcjępoziomu H

, lecz zawartość OH

stopniowo wzrastała. Mimo, iż aktywności CAT i POX, podobnie jak u roślin młodszych, były swoimi odwrotno-

ściami, to jednak po 8 dniach działania metalu CAT osiągnęła aktywność niższą niż u roślin kontrolnych (78%),

zaś dla POX mierzono najwyższą aktywność (308% kontroli). Aktywność SOD spadała w czasie 12 dni działania

Cd. Zawartość RFT i aktywności enzymów antyoksydacyjnych zmieniały sięw czasie wzrostu roślin fasoli.

Działanie Cd modyfikowało poziom RFT i aktywności enzymów w zależności zarówno od stadium wzrostu pierw-

szorzędowych liści fasoli jak i czasu działania metalu.

P10-37

WPŁYW CDDP I TDDP NA AKTYWNOŚĆ GST ORAZ NA ŻYWOTNOŚĆ LIMFOCYTÓW KRWI

OBWODOWEJ CZŁOWIEKA

Z. Walter, Ch. Kargas, M. Rogalińska

Katedra Genetyki Molekularnej UŁ, Łódź

Transferazy S-glutationowe (GST) to wielogenowa rodzina enzymów katalizujących tworzenie koniugatów glu-

tationu (GSH) zarówno z wieloma związkami endogennymi, jak i ksenobiotykami. Wzmożona ekspresja GST w

tkankach nowotworowych jest uważana za jeden z czynników odpowiedzialnych za oporność na leki antynowo-

tworowe, stąd zainteresowanie korelacją pomiędzy aktywnością enzymu, a opornością. Celem pracy było bada-

nie wpływu cis-diamminodichloroplatyny II (CDDP) leku antynowotworowego stosowanego w chemioterapii

jak i jego nieaktywnej formy trans (TDDP) na aktywność GST oraz na żywotność komórek limfocytarnych izolowa-

nych z krwi obwodowej zdrowych dawców. Obserwowano po krótkim czasie inkubacji z CDDP wzrost aktywno-

ści GST co mogło wskazywać na bezpośredni udział GST w detoksykacji tego związku. Ustabilizowanie siępozio-

mu aktywności po dłuższym czasie inkubacji wraz z jednoczesnym utrzymywaniem siężywotności na stałym po-

ziomie może wskazywać na wypływ leku z komórek w postaci koniugatu i nabywanie pewnej oporności na lek.

W przypadku TDDP zaobserwowano mały wzrost aktywności enzymatycznej tylko przy najwyższych stosowa-

nych dawkach i stały spadek żywotności komórek. TDDP jako związek nieaktywny antynowotworowo wywołuje

więc inną odpowiedź komórkową. Bardzo mało do tej pory wiadomo o bezpośrednim wpływie CDDP i TDDP na

komórkęw aspekcie ekspresji GST w zależności od dawki i od czasu działania tych związków. Pozostaje niewyja-

śnione czy CDDP wpływa na wzrost stężenia i/ lub na aktywność GST w komórce czy też wcześniejszy wzrost eks-

presji GST w tkankach nowotworowych ma wpływ na skuteczność leku.

260

SESJA 10 PLAKATY

P10-38

REAKCJE ARABIDOPSIS THALIANA NA NADMIAR Cu W ŚRODOWISKU: POWSTAWANIE

I WYGASZANIE REAKTYWNYCH FORM TLENU

Maria Drążkiewicz, Ewa Skórzyńska-Polit, Zbigniew Krupa

Zakład Fizjologii Roślin UMCS, Lublin

Arabidopsis thaliana była uprawiana na zmodyfikowanej pożywce Hoaglanda zawierającej 0.3 nM Cu. Po 3

dniach zwiększono zawartość tego mikroelementu w pożywce, wprowadzając Cu w stężeniach: 0, 5, 25, 50 i

100 M. Po 7 dniach wzrostu roślin w tych warunkach oznaczano w liściach zawartość reaktywnych form tlenu

(RFT): O

, H

i OH

oraz aktywność enzymów antyutleniających: dysmutazy ponadtlenkowej (SOD, EC1.15.1.1),

katalazy (CAT, EC1.11.1.6) i peroksydazy gwajakolowej (POX, EC1.11.1.7). Stwierdzono wzrost akumulacji RFT w

liściach roślin rosnących w warunkach nadmiaru Cu w porównaniu z kontrolą. Towarzyszyła mu zwiększona ak-

tywność SOD i POX oraz zmniejszona aktywność CAT. U Arabidopsis thaliana poddanej działaniu 5 M Cu

stwierdzono wyjątkowo wysoką zawartość O

(280% kontroli) i najbardziej wzmożoną aktywność POX (240%

kontroli). Natomiast u roślin rosnących w obecności 100 M Cu występowała największa akumulacja H

(520%

kontroli), zaś aktywność SOD i POX wzrastała w jednakowym stopniu (do około 340% kontroli). Najwyższy po-

ziom OH

(350% kontroli) obserwowano u roślin traktowanych 50 M Cu. Uzyskane dane wskazują na różnorod-

ność zmian zawartości poszczególnych ROS i aktywności enzymów systemu antyutleniającego u Arabidopsis

thaliana w zależności od stężenia Cu w środowisku. Pomimo wysokiej aktywności enzymatycznych wygaszaczy

rodników, liście roślin rosnących w warunkach nadmiaru Cu wykazywały drastycznie zwiększony poziom ROS.

Badania były finansowane przez Komitet Badań Naukowych – grant 6 P04C 064 15.

P10-39

TOLERANCJA NA KADM DZIKIEGO TYPU ARABIDOPSIS THALIANA

Małgorzata Wójcik, Barbara Hawrylak, Anna Tukiendorf

Zakład Fizjologii Roślin, Instytut Biologii, Uniwersytet Marii Curie-Skłodowskiej, Lublin

Jednym z mechanizmów wewnątrzkomórkowej detoksykacji metali ciężkich u roślin jest biosynteza fitochelatyn.

Są to peptydy o strukturze ( -Glu-Cys)

-Gly (n=2–11), które chelatują wolne jony metali obecne w cytoplaźmie za

pomocą grup sulfhydrylowych cysteiny. Wśród wielu jonów metali, najefektywniejszym induktorem fitochelatyn

jest kadm. Badania nad mutantami o ograniczonej zdolności syntezy fitochelatyn wykazały, że peptydy te pełnią

istotną rolęw tolerancji na kadm u Arabidopsis thaliana. Rośliny dzikiego typu Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.

var. Columbia były uprawiane hydroponicznie w kontrolowanych warunkach fotoperiodu i temperatury. Zaob-

serwowano, że kadm wpływał hamująco na wzrost korzeni oraz na przyrost biomasy korzeni i organów nad-

ziemnych. Zmiany te były zależne od czasu działania i dawki metalu. Indeks tolerancji osiągał wartość 0.5 przy

stężeniu 100 M Cd już po 4 dniach, podczas gdy stężenia 10 i 25 M Cd powodowały taką inhibicjęwzrostu do-

piero po 14 dniach. Najniższe stężenie metalu, hamujące całkowicie wzrost korzeni, wynosiło 200 M Cd. Obec-

ność kadmu stymulowała akumulacjęfitochelatyn w korzeniach i organach nadziemnych badanych roślin. Wyż-

szy poziom fitochelatyn obserwowano w korzeniach niż w liściach, zaś ich ilość w obu przypadkach rosła ze

wzrostem stężenia metalu i czasu jego działania. Kinetyka akumulacji fitochelatyn potwierdziła stwierdzoną

wcześniej zależność, że formy krótkołańcuchowe tych peptydów (n=2) syntetyzowane były z glutationu naj-

wcześniej i w największych ilościach. Natomiast polimery o dłuższych łańcuchach (n=3–4) pojawiały się w miarę

wydłużania czasu ekspozycji roślin na kadm i przy wyższych dawkach tego metalu.

Prezentowane badania są finansowane przez KBN, grant nr 6 P04C 064 15.

ODPOWIEDŹ ORGANIZMÓW NA CZYNNIKI BIOTYCZNE I ABIOTYCZNE

261

P10-40

STRES OKSYDACYJNY WYWOŁANY NADKWASEM OCTOWYM JAKO PRZYCZYNA OSTREGO

ZAPALENIA TRZUSTKI U SZCZURÓW

Kamil Jankowski

, Zbigniew Śledziński

, Łukasz Kaska

, Wojciech Makarewicz

, Michał Woźniak

A: I Katedra i Klinika Chirurgii AMG, Gdańsk

B: Katedra i Klinika Chirurgii Ogólnej, Gastroenterologicznej i Endokrynologicznej AMG, Gdańsk

C: Katedra i Zakład Chemii Ogólnej AMG, Gdańsk

Ostre zapalenie trzustki (OZT) jest chorobą, której patofizjologia wciąż pozostaje niejasna. Nadkwas octowy

(NKO) jest pochodną etanolu, która. podczas stanu zapalnego może pojawić sięw tkance trzustkowej. Praca ni-

niejsza miała na celu ustalenie, czy podanie nadoctanu do przewodu wątrobowo-trzustkowego (PWT) szczurów

wywoła ostre zapalenie trzustki. Zwierzęta podzielono na 6 grup. W grupach 1 i 4 otrzymały one 1 mM roztwór

nadoctanu w 0.5 ml 0.9% NaCl, w grupach 2 i 5 roztwór 40 mM, zaś w grupach 3 i 6 jedynie 0.5 ml soli fizjolo-

gicznej. Szczury z grup 1–3 były obserwowane przez 1 h, zaś z grup 4–6 przez 3 h. Po okresie obserwacji badano

poziom amylazy w osoczu, strukturętkankętrzustkową w mikroskopie świetlnym oraz poziom grup sulfhydrylo-

wych białek w homogenatach trzustek. W grupach otrzymujących NKO wystąpiły zmiany w trzustkach – przy

1mM roztworze obrzęk i podtorebkowe zbiorniki płynowe, przy 40 mM – ogniska martwicy krwotocznej trzustki

i martwica typu Balsera. W badaniach mikroskopowych obserwowano nacieki leukocytarne oraz martwicęzrazi-

ków i tkanki tłuszczowej. Zmiany te korelowały z poziomem amylaz w surowicy oraz poziomem grup SH w ho-

mogenatach trzustek. Otrzymane wyniki dowodzą, iż NKO w niskim stężeniu wywołuje ostre obrzękowe zapale-

nie trzustki, natomiast w większym stężeniu – postać martwiczo-krwotoczną OZT.

P10-41

OCZYSZCZANIE TRANSFERAZY 1-O-IA-GLUKOZA: MYO-INOZYTOL Z BIELMA

NIEDOJRZAŁYCH NASION KUKURYDZY

Elżbieta Zielińska, Anna Jakubowska, Stanisław Kowalczyk

Zakład Biochemii Instytutu Biologii Ogólnej i Molekularnej Uniwersytet M. Kopernika, Toruń

Synteza koniugatów auksyn w bielmie dojrzewających nasion tworzy zapasową pulęnieaktywnego hormonu,

która jak sięuważa, jest źródłem wolnych auksyn w początkowej fazie kiełkowania. IA-inozytol (IAInoz), podsta-

wowy koniugat kwasu indolilo-3-octowego w nasionach kukurydzy jest syntetyzowany dwuetapowo w myśl

równań: IAA + UDP-glukoza

1–O-IA-glukoza + UDP, 1–O–IA-glukoza + myo-inozytol

IA-inozytol + gluko-

za. Syntaza 1-O-IA-glukozy, katalizująca pierwszą reakcję, została już oczyszczona i dzięki uzyskanym przeciw-

ciałom sklonowana na podstawie analizy biblioteki cDNA opartej na reakcjach immunochemicznych. Celem

obecnie prowadzonych badań jest sklonowanie transferazy 1-O-IA-glukoza: myo-inozytol (syntazy IA-Inoz). W

oczyszczaniu enzymu stosowaliśmy klasyczne metody rozdziału białek: frakcjonowanie siarczanem amonu,

chromatografięjonowymienną na DEAE-Sephacel, chromatografięna hydroksyapatycie, chromatografiępowi-

nowactwa na ConA-Sepharose, elektroforezępreparatywną w żelu poliakrylamidowym i ogniskowanie izoelek-

tryczne. Wydajność preparatyki jest niewielka (około 3%), ale uzyskiwana ilość homogennego białka umożliwiła

otrzymanie przeciwciał poliklonalnych oraz pozwoliła na ustalenie sekwencji dwudziestoaminokwasowego frag-

mentu otrzymanego po trawieniu enzymu trypsyną.

P10-42

PEROKSYDACJA LIPIDÓW MIKROSOMÓW WĄTROBY Z UDZIAŁEM ORTO-WANADANU(+5)

Bogdan Stachecki

Zakład Biochemii, Katedra Biochemii Farmaceutycznej, Akademia Medyczna w Poznaniu

Badaniom poddano skutki obecności orto-wanadanu (+5), w środowisku mikrosomów wątroby świńskiej, na

wytwarzanie lipidowych nadtlenków. Za miaręperoksydacji lipidów przyjęto ilość wytwarzany;ch TBARS (MDA)

po indukcji procesu peroksydacji przez Fe

/ askorbinian (wraz z kombinacją wyłączań jednego z czynników in-

dukujących). Doświadczenia pozwalają na następujące spostrzeżenia: (1) obecność wanadanu nie zmienia ilości

TBARS wytwarzanej przez mikrosomy, (2) wprowadzenie do środowiska mikrosomów jednego z dwóch czynni-

ków indukujących kwasu askorbinowego wystarcza by endogenne zasoby Fe

i Fe

były zdolne wytworzyć tę

262

SESJA 10 PLAKATY

samą ilość TBARS co mikrosomy z obu czynnikami indukującymi, niezależnie od obecności lub nieobecności wa-

nadu w zawiesinie mikosomów, (3) w indukowanej peroksydacji lipidów Fe

/ askorbinian, ostatni ze związków

jest głównym czynnikiem odpowiedzialnym za skutki przemiany nadtlenkowej co potwierdza spadek ilości

TBARS do poziomu 2,6% ilości maksymalnej w przypadku nieobecności tego induktora w środowisku mikroso-

mów, (4) obecność wanadanu w środowisku mikrosomów, przy niewprowadzaniu kwasu askorbinowego, zdol-

ność wytwarzania TBARS przez układ rekompensuje w 42% ilości maksymalnej tych związków. Porównanie dy-

namiki wzrostu TBARS wykazuje, że obecność wanadanu w środowisku mikrosomów zwiększa szybkość powsta-

wania lipidowych nadtlenków.

P10-43

ZMIANY EKSPRESJI GENU IAAGLU W KIEŁKACH KUKURYDZY W WARUNKACH

PODWYŻSZONEGO POZIOMU WOLNEJ AUKSYNY

Anna Jakubowska, Anna Hetmann, Stanisław Kowalczyk

Zakład Biochemii Instytutu Biologii Ogólnej i Molekularnej, Uniwersytet M. Kopernika, Toruń

Kwas indolilo-3-octowy (IAA) występuje w roślinach nie tylko jako wolny kwas, ale także w formie związanej w

postaci koniugatów estrowych i amidowych. Obecność koniugatów IAA stwierdzono zarówno w nasionach,

gdzie stanowią źródło aktywnej auksyny we wczesnych etapach kiełkowania, jak również w tkankach wegeta-

tywnych, w których prawdopodobnie uczestniczą w utrzymaniu homeostazy hormonalnej. Syntazęindoli-

lo-3-acetyloglukozy (UDP-glukoza: indolilo-3-acetyl glukozylotransferaza) katalizującą reakcję: UDP-glukoza +

IAA

1-O-IA-glukoza + UDP oczyszczono z bielma niedojrzałych nasion kukurydzy i po uzyskaniu przeciwciał

sklonowano na podstawie analizy biblioteki cDNA. W prowadzonych obecnie badaniach wykazano iż oczyszczo-

na syntaza 1-O-IA-glukozy jest specyficzna względem IAA. Spośród badanych kwasów organicznych tylko synte-

tyczna auksyna - kwas naftylo-1-octowy (1-NAA) jest względnie dobrym substratem tworzącym koniugaty estro-

we. Stosując królicze przeciwciała poliklonalne przeciwko oczyszczonej syntazie IA-glukozy stwierdzono obec-

ność białka enzymatycznego w niedojrzałym bielmie i jego brak w 4-dniowych siewkach kukurydzy. Po inkubacji

kiełków w środowisku zawierającym 50mM 1-NAA, ekstrakty rozdzielano elektroforetycznie i po przeniesieniu

białek na nitrocelulozęobserwowano zmiany poziomu antygenu. 1-NAA indukował syntezębiałka enzymatycz-

nego oraz wzrost aktywności syntazy 1-O-IA-glukozy.

P10-44

PRZEMIANY POCHODNYCH KWASU CYNAMONOWEGO U RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS

Marzanna Paździoch-Czochra, Elżbieta Malarczyk, Ryszard Gondek

Zakład Biochemii, Uniwersytet M. Curie-Skłodowskiej, Lublin

Komórki Rhodococcus charakteryzują sięogromną różnorodnością metaboliczną. Są one zdolne do degradacji

wielu związków, w tym aromatycznych węglowodorów, chloroalkanów, pestycydów [

Dabbs ER (1998)Antonie van

Leeuwenhoek 74:155–168

] oraz związków fenolowych, które powstają m.in. podczas rozkładu ligniny [

Eggeling L,

Sahm (1980) Arch. Microbiol. 126:141–148

]. Przemiany te przejawiają sięokresowymi zmianami w endogennym po-

borze tlenu oraz stężeniu substratów i produktów reakcji [

Eggeling L, Sahm (1980) Arch. Microbiol. 126:141–148

Ma-

larczyk E, Paździoch-Czochra M. (2000) Cell Biol. Intern. 24(8), in press

]. Celem niniejszego doniesienia było zbadanie

procesów rozkładu kwasu ferulowego, izoferulowego oraz dimetoksycynamonowego przez komórki Rhodococ-

cus erythropolis podczas 12-godzinnej inkubacji. Komórki, hodowane na płynnej pożywce mineralnej z dodat-

kiem kwasu bursztynowego, pobierano w środkowej fazie wzrostu logarytmicznego, odwirowywano i po prze-

myciu zawieszano w buforze fosforanowym, pH 7, a następnie inkubowano z 0.02% kwasem ferulowym, kwasu

izoferulowym lub dimetoksycynamonowym. Podczas inkubacji z pochodnymi kwasów cynamonowych stwier-

dzono, że obecność kwasu izoferulowego powoduje największy endogenny pobór tlenu z charakterystycznymi

oscylacjami, wysokie stężenie kwasów metoksyfenolowych w środowisku, wysokie stężenie H

w środowisku z

charakterystycznym obniżeniem po 7h inkunbacji. Obecność kwasu ferulowego była odpowiedzialna za zwięk-

szony endogenny pobór tlenu w porównaniu do komórek kontrolnych, wysokie stężenie kwasów metoksyfeno-

lowych w środowisku, największą produkcję HCHO, zwłaszcza w pierwszej połowie inkubacji, największe stęże-

nie anionorodnika ponadtlenkowego, wysokie stężenie H

w środowisku z obniżeniem w 9h inkubacji. Kwas

dimetoksycynamonowy przyczynia siędo zwiększonego endogennego poboru tlenu, niewielkich ilości kwasów

metoksyfenolowych, wysokiego stężenia H

w środowisku z charakterystycznym obniżeniem po 8h inkubacji.

We wszystkich przypadkach nie stwierdzono produkcji kwasów hydroksyfenolowych, które są produktami całko-

ODPOWIEDŹ ORGANIZMÓW NA CZYNNIKI BIOTYCZNE I ABIOTYCZNE

263

witej demetylacji. Wszystkim przemianom towarzyszyło wysokie stężenie anionorodnika ponadtlenkowego, za-

równo w komórkach jak i środowisku inkubacyjnym. Zaobserwowano także oscylacyjne zmiany w aktywności

SOD. Obecność bocznego łańcucha w pierścieniu aromatyczym istotnie modyfikuje charakter i tempo przemian

demetylacyjnych. Otrzymane wyniki wskazują na złożoność procesów demetylacyjnych zależną od obecności tle-

nu i wysoką specyficzność enzymów zaangażowanych w te przemiany.

P10-45

PROCESY DEMETYLACJI KWASU WERATROWEGO U NOCARDIA GLOBERULA

Marzanna Paździoch-Czochra, Aneta Kłoczkowska, Elżbieta Malarczyk

Zakład Biochemii, Uniwersytet M. Curie-Skłodowskiej, Lublin

Glebowe promieniowce należące do rodzaju Nocardia i Rhodococcus charakteryzują sięzdolnością do rozkładu

wielu związków organicznych, w tym związków metoksyfenolowych [

Eggeling L., Sahm (1980) Arch. Microbiol.

126:141–148, Malarczyk E. (1984) Acta Biochim.Polon. 31/4:383–395.]

. Przemiany te są związane z oscylacyjnymi zmia-

nami stężeń substratów i produktów reakcji oraz z okresowymi zmianami aktywności enzymów [

Malarczyk E

(1984) Acta Biochim.Polon. 31/4:383–395; Malarczyk E., Paździoch-Czochra M. (2000) Cell Biol. Intern. 24(8), in press.]

. Celem

niniejszej pracy było dobranie parametrów reakcji demetylacji kwasu weratrowego przez komórki Nocardia glo-

berula podczas 12-godzinnej inkubacji. Komórki, namnażane na płynnej pożywce mineralnej z dodatkiem kwasu

bursztynowego jako źródła węgla, pobierano w środkowej fazie wzrostu logarytmicznego i inkubowano z do-

datkiem 0.01%; 0.02% i 0.04% soli sodowej kwasu weratrowego(WER). Równolegle zbadano wpływ trzech gę-

stości zawiesiny komórkowej (A660=0.5; A660= 1; A660= 2). Gęstość zawiesiny inkubacyjnej oraz stężenie

kwasu weratrowego istotnie wpływało na ilość i jakość produktów demetylacji oraz częstotliwość oscylacji. Gę-

stość A=1 oraz 0.02% stężenie WER prowadziło do wytwarzania obu produktów demetylacji zarówno częścio-

wej (kwasy wanilinowe) jak i całkowitej (kwas protokatechowy) w największym stężeniu, co łączyło się z najin-

tensywniejszym wydzielaniem tlenu przez komórki. Te warunki były także optymalne dla produkcji formaldehy-

du. Gęstość A=0.5 i 0.02% stężenie WER okazało się niekorzystne dla przemian demetylacyjnych, gdyż nie

stwierdzono obecności kwasu protokatechowego, a kwasy wanilinowe pojawiały siędopiero w 7 godzinie inku-

bacji, przy czym nie obserwowano wydzielania tlenu. We wszystkich wariantach stwierdzono gromadzenie kwa-

sów wanilinowych w drugiej połowie inkubacji. Wszystkim przemianom demetylacyjnym towarzyszyło wysokie

stężenie H

w środowisku. Uzyskane wyniki wykazały, że najbardziej zróżnicowane przemiany demetylacyjne

występują dla zwiesiny komórek A=1 i 0.02% WER. Równocześnie stwierdzono wyraźną zależność pomiędzy in-

tensywnością poboru tlenu przez komórki a ich zdolnością do rozkładu metoksyfenoli. Zmiana gęstości zawiesi-

ny inkubacyjnej oraz stężenia WER prowadziła do istotnego obniżenia poboru tlenu a tym samym zmiany inten-

sywności reakcji demetylacji (zmiany stężenia produktów reakcji) a nawet do jej zatrzymania.

P10-46

STRUKTURA POPULACJI BRADYTHIZOBIUM JAPONICUM PO PIĘCIU LATACH UPRAWY SOI

NA POLOWYM STANOWISKU DOŚWIADCZALNYM

Barbara Golińska, Dorota Narożna, Joanna Króliczak, Ewa Karpińska, Krzysztof Pudełko, Cezary J. Mądrzak

Zakład Biologii Molekularnej, Katedra Biochemii i Biotechnologii, Akademia Rolnicza im. Augusta Cieszkowskiego,

Poznań

Przeprowadzono analizęzróżnicowania genetycznego populacji izolatów bakterii zdolnych do brodawkowania

soi, zebranych z gleby poletek doświadczalnych, na których wcześniej prowadzono badania nad wzajemną kon-

kurencyjnością szczepów Bradyrhizobium japonicum USDA 123 i USDA 110. Przed rozpoczęciem eksperymentu,

prowadzonego w latach 1994–998, gleba na stanowisku doświadczalnym nie zawierała, jak stwierdzono, rdzen-

nych mikroorganizmów brodawkujących ten gatunek rośliny. Po jednorazowym wprowadzeniu badanych szcze-

pów do gleby w postaci inokulum, w kolejnych latach uprawy soja wydajnie tworzyła brodawki korzeniowe.

Świadczy to o dobrej przeżywalności Bradyrhizobium japonicum w glebach polskich. Jednocześnie, w kolejnych

latach eksperymentu polowego dały sięzauważyć objawy zwiększającego sięzróżnicowania występujących na

badanym stanowisku mikroorganizmów. Można to było wywnioskować z wzrastającej niejednoznaczności wy-

ników serologicznej identyfikacji szczepów. Obserwacja ta jest o tyle nieoczekiwana, że do przygotowania inoku-

lum zastosowano czyste kultury szczepów bakteryjnych. W celu określenia zakresu zróżnicowania mikroorgani-

zmów, których populacja została wprowadzona do gleby cztery lata wcześniej, przeprowadzono ich izolacjęz

gleby z zastosowaniem pożywki selekcyjnej, a następnie określono ich zdolność do brodawkowania soi w warun-

264

SESJA 10 PLAKATY

kach szklarniowych. Do dalszych badań wykorzystano wyłącznie izolaty uzyskane z brodawek korzeniowych ro-

ślin brodawkowanych in vitro. Przebadano grupę50 izolatów. Okazało się, że oprócz mikroorganizmów re-

agujących z przeciwciałami przeciwko antygenom powierzchniowym USDA 123 lub USDA 110, w badanej gru-

pie znalazły sięrównież takie, które nie reagują z żadnym z zastosowanych przeciwciał, a także takie, które re-

agują jednocześnie z obydwoma przeciwciałami. Oznacza to, że przynajmniej pod względem charakterystyki se-

rologicznej, pojawiły siędwa, nie spotykane wcześniej typy izolatów. Dla określenia różnic w strukturze fizycznej

genomów badanych izolatów zastosowano metodęREP-PCR. Uzyskane profile REP (populacje amplifikowanych

fragmentów chromosomalnego DNA bakterii) sugerują, że badana grupa izolatów jest pod względem struktury

genomu niejednorodna. W tej chwili nie można odpowiedzieć na pytanie, skąd biorą sięizolaty tak znacznie róż-

niące sięod szczepów wprowadzonych w postaci inokulum. Robocza hipoteza stanowi, iż pozbawione konku-

rencji blisko ze sobą spokrewnionych mikroorganizmów, podlegały naturalnemu różnicowaniu i realizowały

swoisty typ procesu radiacji. Na pytanie, jakie są źródła obserwowanej zmienności i czy jednym z nich nie jest ho-

ryzontalny transfer genów, również nie można w tech chwili odpowiedzieć, tym bardziej, że musiałby on doty-

czyć wymiany międzygatunkowej.

P10-47

USZKODZENIA DNA LIMFOCYTÓW EKSPONOWANYCH NA MALAOKSON W OBECNOŚCI

ANTYOKSYDANTÓW

A. Trzeciak

, J. Błasiak

, E. Małecka-Panas

, J. Drzewoski

A: Katedra Genetyki Molekularnej, Uniwersytet Łódzki, Łódź

B: Klinika Chorób Układu Pokarmowego i Przemiany Materii, Akademia Medyczna, Łódź

Insektycydy fosforoorganiczne są grupą związków powszechnie stosowanych w rolnictwie i produkcji żywności.

Malaokson jest metabolitem malationu, często stosowanego insektycydu. Celem pracy była ocena poziomu

uszkodzeń DNA w ludzkich limfocytach eksponowanych na malaokson w obecności witaminy E, mannitolu i ka-

talazy przy użyciu testu kometkowego. Malaokson powodował wzrost wartości momentu ogonowego przy naj-

wyższym zastosowanym stężeniu 200 µM, podczas gdy antyoksydanty: witamina E (0–60 µM), mannitol (1–10

mM) i katalaza (250 U/ml) nie wpływały na jego poziom. Zarówno witamina E jak i mannitol nie miały wpływu na

wielkość uszkodzeń wywołanych przez malaokson. W obecności katalazy malaokson powodował mniejsze

uszkodzenia DNA badanych komórek. Otrzymane wyniki wskazują na to, że genotoksyczność malaoksonu nie

jest związana z generowaniem wolnych rodników. Zmniejszenie poziomu uszkodzeń DNA w obecności katalazy

prawdopodobnie nie jest wywołane przez dysmutacjęnadtlenku wodoru, lecz przez inny mechanizm poznanie,

którego wymaga dalszych studiów.

Praca finansowana z grantu KBN 4 P05B 079 17.

P10-48

ZWIĄZKI FLAWONOIDOWE – POCHODNE KEMFEROLU I ICH AKTYWNOŚĆ

PRZECIWUTLENIAJĄCA

Małgorzata Zielińska

, Jaromir Budzianowski

A: Zakład Biochemii Katedry Biochemii Farmaceutycznej

B: Katedra Botaniki Farmaceutycznej Akademia Medyczna, Poznań

Flawonoidy stanowią liczną grupęzwiązków fenolowych, występujących w roślinach. Biochemiczna aktywność

flawonoidów w dużej mierze zależy od ich działania antyoksydacyjnego oraz hamowania procesów wolnorodni-

kowych. Celem naszych badań było określenie zależności pomiędzy strukturą chemiczną flawonoidów, a aktyw-

nością metabolizmu tlenowego aktywowanych in vitro ludzkich granulocytów obojętnochłonnych. Zastosowa-

no: 3–0–(6"-0-acetylo) glukozyd kemferolu, 3–0-rutynozydo-7–0-glukuronid kemferolu oraz 3–0-b rutynozyd

kemferolu wyizolowane z roślin leczniczych. Porównano działanie tych związków z aktywnością przeciwutle-

niającą kemferolu. Oceniano intensywność chemiluminescencji zależnej od luminolu neutrofili aktywowanych w

obecności i bez dodatku flawonoidu oraz stężenie anionorodnika ponadtlenkowego testem redukcji cytochromu

c. Stężenie końcowe badanych związków wynosiło1–100 M w próbie. Badania wykazały statystycznie znamien-

ne obniżenie intensywności chemiluminescencji neutrofili w obecności pochodnych kemferolu. Nasilenie antyok-

sydacyjnego działania zależy od stężenia związku i jest najsilniejsze dla 100 M, wynosząc ok. 57% dla acetylo

glukozydu kemferolu, 54% dla kemferolu, 51% dla rutynozydu kemferolu oraz 43% dla rutynozydo glukuronidu

kemferolu (p<0,01). Hamowanie chemiluminescencji przez badane flawonoidy zależy od ilości i rodzaju pod-

ODPOWIEDŹ ORGANIZMÓW NA CZYNNIKI BIOTYCZNE I ABIOTYCZNE

265

stawników. Połączenie glikozydowe w pozycji 3 kemferolu nieznacznie obniża reaktywność związków, co może

wynikać z ich mniejszej lipofilności. W teście redukcji cytochromu c badane flawonoidy tylko nieznacznie

wpływały na obniżenie produkcji anionorodnika ponadtlenkowego w czasie fagocytozy PMN (p<0,1). Na pod-

stawie otrzymanych wyników wnioskujemy, że badane związki wykazują cechy zmiataczy wolnych rodników tle-

nowych. Wyniki te sugerują również możliwość wykorzystania stosowanych metod do identyfikacji aktywnych

pochodnych flawonoidowych mogących chronić przed uszkodzeniami wolnorodnikowymi.

P10-49

BADANIE ODPOWIEDZI GRZYBÓW Z KLASY BASIDIOMYCETES NA WYBRANE CZYNNIKI

STRESU OKSYDACYJNEGO

Magdalena Jaszek, Grażyna Skierczyńska-Płoszyńska, Krzysztof Grzywnowicz, Andrzej Leonowicz

Zakład Biochemii UMCS, Lublin

Zjawisko stresu oksydacyjnego obserwujemy wówczas, gdy zaburzona zostaje naturalna równowaga pomiędzy

produkcją reaktywnych form tlenu, a działaniem wewnątrzkomórkowych enzymatycznych i nieenzymatycznych

systemów antyoksydacyjnych. Generowanie toksycznych ilości reaktywnych form tlenu związane może być z

działaniem różnego typu czynników stresowych m.in. substancji prooksydacyjnych takich jak menadion, para-

kwat, plumbagina, jony metali ciężkich i inne. Ciekawą i mało poznaną pod tym względem grupą są, będące

przedmiotem prezentowanej pracy grzyby z klasy Basidiomycetes. Celem pracy było przebadanie zmian w aktyw-

ności lakazy (enzymu biorącego udział w rozkładzie kompleksu ligninocelulozowego), poziomu typowych czyn-

ników antyoksydacyjnych (dysmutazy ponadtlenkowej, katalazy i glutationu) oraz niskocząsteczkowych marke-

rów stresu oksydacyjnego (anionorodnik ponadtlenkowy, formaldehyd) wywołanych wprowadzeniem menadio-

nu, parakwatu i nadtlenku wodoru do podłoża podczas hodowli grzybów Trametes versicolor i Abortiporus

biennis. Stwierdzono, iż dodanie prooksydantów do hodowli grzybowych powodowało bardzo wyraźny wzrost

aktywności lakazy, szczególnie w kulturach stymulowanych menadionem. Zaobserwowano także wyraźną kore-

lacjęmiedzy poziomem anionorodnika ponadtlenkowego, a aktywnościami dysmutazy ponadtlenkowej i katala-

zy, obniżenie sięilości zredukowanej formy glutationu oraz wzrost stężenia substancji fenolowych zewnątrzko-

mórkowych w przypadku obydwu badanych szczepów grzybowych. Wykazano również wyraźne podwyższenie

poziomu wewnątrzkomórkowego formaldehydu, produktu reakcji transmetylacyjnych wzmożonych w warun-

kach stresowych.

Praca była częściowo finansowana z grantu KBN (nr 6P04A03017).

P10-50

ANTYOKSYDACYJNE DZIAŁANIE ZWIĄZKÓW POLIFENOLOWYCH

Ewa Ignatowicz

, Ewa Stawicka

, Irena Matławska

, Wiesława Bylka

A: Katedra Biochemii Farmaceutycznej

B: Katedra Farmakognozji, Akademia Medyczna im. K. Marcinkowskiego w Poznaniu, Poznań

Podjęto badania wpływu roślinnych związków polifenolowych z grupy kumaryn na ilość reaktywnych form tlenu,

generowanych w czasie „wybuchu oddechowego” granulocytów obojętnochłonnych. Naturalne polifenole są

składnikami diety człowieka o znaczeniu w profilaktyce m. in. miażdżycy i choroby nowotworowej. Reaktywne

formy tlenu, produkowane przez komórki fagocytujące są kompletnymi karcinogenami, gdyż biorą udział za-

równo w oksydacyjnym uszkodzeniu DNA (inicjacja karcinogenezy), jak i w promocji procesu nowotworowego.

Przebadano pochodne kumarynowe: dikumarol, składnik leków przeciwkrzepliwych i eskulinęz kasztanowca

zwyczajnego, w stężeniach 1,10, 50 i 100 mikromola. Leki zawierające eskulinę maja działanie przeciwbólowe,

przeciwzapalne i tonizujące naczynia. Antyoksydacyjne działanie kumaryn porównano z aktywnością tych sa-

mych stężeń butylohydroksytoluenu, standardowego środka konserwującego żywność. Zaobserwowano zale-

żny od stężenia wpływ kumaryn i BHT na stężenie anionorodnika ponadtlenkowego, nadtlenku wodoru i kwasu

podchlorawego, powstających w czasie „wybuchu oddechowego” granulocytów obojętnochłonnych. Dikuma-

rol i butylohydroksytoluen w stężeniach 50 i 100 mikromola charakteryzują się podobną aktywnością antyoksy-

dacyjną. Statystycznie znamiennie obniżają stężenie anionorodnika ponadtlenkowego, nadtlenku wodoru i kwa-

su podchlorawego. Eskulina jest mniej aktywnym przeciwutleniaczem. W stężeniu 50 i 100 mikromola znamien-

nie obniża produkcjęanionorodnika ponadtlenkowego, natomiast pozostałe parametry istotnie obniża tylko w

stężeniu 100 mikromola. Eskulina i dikumarol są słabszymi antyoksydantami niż uprzednio przebadane flawono-

idy.

266

SESJA 10 PLAKATY

P10-51

MODYFIKACJE METABOLIZMU LIPIDOWEGO ZALEŻNE OD CZASU DZIAŁANIA LINAMARYNY

Jolanta Chichłowska, Andrzej Kliber, Magdalena Graczyk, Ewa Dolańska-Niedbała, Iwona Bialik

Katedra Fizjologii i Biochemii Zwierząt, Akademia Rolnicza w Poznaniu

Linamaryna jest glikozydem cyjanogennym występującym u przedstawicieli ponad 60 rodzin botanicznych, m.in.

w takich roślinach jak: len, koniczyna i maniok. Rośliny te wykorzystywane są w żywieniu ludzi i zwierząt, stąd za-

interesowanie efektami fizjologicznymi linamaryny, zwłaszcza wobec możliwości przekształcania sięjej w ustro-

ju w cyjanowodór i tiocyjanek, związki o silnym biologicznym działaniu .Celem prezentowanych badań było

określenie wpływu linamaryny na wskaźniki przemiany lipidowej u szczurów, którym przez 7 i 14 dni iniekowano

podskórnie ten związek w ilości 500 g/szczura/dzień. Poubojowej analizie poddano surowicękrwi, wątrobęi

mięsień udowy. Po 7 dniach działania linamaryny w surowicy krwi obserwowano istotny statystycznie wzrost za-

wartości wolnych kwasów tłuszczowych, a po 14 dniach obniżenie tego parametru, przy równoczesnej hipertri-

glicerydemii. Poziom cholesterolu całkowitego, wolnego i estryfikowanego był zwiększony w obu okresach ba-

dawczych odpowiednio po 7 i 14 dniach o 24% i 20%; 34% (p<0.01) i 30% (p<0.05) oraz 11% i 17% (p<0.05) w

porównaniu z kontrolą. Analiza tkanek wskazuje na wyraźną mobilizacjęTG z wątroby i mięśni po działaniu lina-

maryny, bowiem obniżenie tego parametru sięgało 50% ibyło wysoce istotne. Wydaje się, że utylizacja TG była

źródłem zwiększonej puli WKT w osoczu. Równocześnie ze wzrostem odtłuszczenia wątroby obserwowano wy-

soce istotne obniżenie cholesterolu wątrobowego po 7 i 14 dniach podawania linamaryny, odpowiednio o 27% i

19% i tylko nieznaczny wzrost tego sterolu w mięśniu szkieletowym po 2 tygodniach badań. Uzyskane wyraźne

zmiany zwłaszca odnośnie wątroby świadczą o ingerencji linamaryny w metabolizm lipidowy szczura.

P10-52

SUBKOMÓRKOWA LOKALIZACJA SYSTEMU ANTYOKSYDACYJNEGO W KOMÓRKACH

KORZENI GROCHU TRAKTOWANYCH JONAMI OŁOWIU

Arleta Małecka, Anna Szkodowska, Barbara Tomaszewska

Zakład Metabolizmu Roślin, Uniwersytet im Adama Mickiewicza, Poznań

Działanie jonów ołowiu (jak i innych metali śladowych) inicjuje w komórkach roślin warunki stresu oksydacyjne-

go prowadzące do produkcji reaktywnych form tlenu (RFT). Odpowiedzią roślin jest uruchomienie systemów

obronnych: antyoksydacyjnego i detoksykacyjnego. W skład systemu antyoksydacyjnego wchodzą ni-

skocząsteczkowe (GSH, cysteina, kwas askorbinowy) i enzymatyczne mechanizmy obronne. Wykazano genero-

wanie H

w komórkach korzeni grochu hodowanych hydroponicznie z jonami Pb

w stężeniach 0.1, 0.5 i 1

mM. Techniką mikroskopii elektronowej monitorowano penetracjęołowiu do frakcji subkomórkowych komórek

korzenia. Izolacja mitochondriów techniką wirowania w gradiencie perkolu pozwoliła obserwować penetrację

ołowiu do ich wnętrza tylko w 1mM stężeniu Pb

. Jednocześnie badano oksygraficznie wpływ ołowiu na fosfo-

rylacjęoksydacyjną i udział alternatywnej drogi oddechowej w oddychaniu mitochondrialnym. Dla utleniania

bursztynianu wykazano spadek kontroli oddechowej z KO=1,9 dla próby kontrolnej do KO=0.8 w 0.5 mM stęże-

niu Pb

, spadek ADP/O z 0.8 do 0.74 oraz obniżenie inhibicji CN

z 62.5% (-Pb

) do 45% (0.5 mM Pb

) z jedno-

czesną znaczną aktywacją pirogronianem białka oksydazy alternatywnej. Dane te świadczą o spadku aktywności

fosforylacji oksydacyjnej spowodowanej uprzepuszczalnieniem błony mitochondrialnej i zwiększonym udziałem

ADO w oddychaniu mitochondrialnym po upośledzeniu drogi cytochromowej w warunkach stresu oksydacyjne-

go. Wyznaczana spektrofotometrycznie aktywność SOD wzrastała 6-krotnie zarówno w cytozolu jak i w mito-

chondriach komórek roślin poddanych stresowi jonami Pb

. Jednocześnie techniką elektroforetyczną wykazano

występowanie w cytozolu, peroksysomach i mitochondriach trzech różnych form izoenzymatycznych SOD. Ak-

tywność drugiego enzymu układu antyoksydacyjnego – katalazy (CAT) również podlegała aktywacji, w warun-

kach stresu „ołowiowego”, ale związana była z frakcją peroksysomalną i cytozolową komórek korzeni.

ODPOWIEDŹ ORGANIZMÓW NA CZYNNIKI BIOTYCZNE I ABIOTYCZNE

267

P10-53

SYNTAZA FITOCHELATYNOWA (EC. 2.3.2.15) AKTYWOWANA JONAMI OŁOWIU

W CYTOZOLU KOMÓREK KORZENI GROCHU

Aneta Piechalak

, Barbara Tomaszewska

, Piotr Kachlicki

A: Zakład Metabolizmu Roślin, Uniwersytet im Adama Mickiewicza, Poznań

B: Instytut Genetyki Roślin PAN, Poznań

Wykazaliśmy (

Tomaszewska B, Tukendorf A, Barałkiewicz D, „ The synthesis of phytochelatins in lupin roots treated with lead

ions”, 1996. The Science of Legumes 3:206–217. Tomaszewska B, Piechalak A, Barałkiewicz D, Małecka A, „ Mechanism of tole-
rance to environmental pollution caused by lead ions in legumes”, 2000.Chemosphere: w druku

), że z czterech przebada-

nych roślin motylkowych : fasoli, grochu, łubinu i bobiku właśnie w korzeniach Pisum sativum traktowanych jo-

nami ołowiu w stężeniu 1 mM ma miejsce indukcja systemu detoksykacyjnego a więc syntezy fitochelatyn i ho-

mofitochelatyn w ilościach 10-krotnie wyższych niż w pozostałych roślinach. Wykazano techniką spektroskopii

masowej (ASA), że zaledwie 1% pobieranego przez korzenie ołowiu (1 mM Pb

) przedostaje siędo frakcji cyto-

plazmatycznej . To 0.1 mM stężenie jonów Pb

w cytozolu wystarcza do aktywacji syntazy fitochelatynowej (EC

2.3.2.15) konstytutywnego, cytozolowego enzymu odpowiedzialnego za syntezęzarówno fito- jak i homofito-

chelatyn, a wykazującego znacznie większe powinowactwo do substratu jakim jest glutation GSH ( -Glu-Cys-Gly)

niż do jego homologu homoglutationu hGSH ( -Glu-Cys-betaAla). Wyizolowano i podczyszczono enzym syntazę

fitochelatynową z korzeni grochu traktowanych 72 godziny 1 mM stężeniem Pb

. Aktywność tego enzymu wy-

znaczono na 0.62 nmoli SH/min/mg białka. Aktywność wyznaczano techniką HPLC rozwijając chromatogram w

odwróconej fazie w liniowym gradiencie 0–20% acetronitrylu w 1% TFA. Związki tiolowe oznaczano w reakcji

postkolumnowej z odczynnikiem Ellmana. Wykazaliśmy, że już po 8 godzinach traktowania jonami ołowiu w stę-

żeniu 0.1 mM, ma miejsce synteza fitochelatyn w ilości 130.91 nmoli SH/g FW osiągając maksimum wynoszące

1229.88 nmoli SH/g FW po 96 godzinach. Dopiero po 48 godzinach stresu enzym ten produkuje homofitochela-

tyny w ilości 229.36 nmoli SH/mg FW osiągając również maksimum wynoszące 423.67 nmoli SH/g FW po 96 go-

dzinach. W trakcie traktowania korzeni grochu 0.1 mM stężeniem Pb

ma miejsce stały wzrost syntezy GSH

związany ze wzrostem aktywności dwóch enzymów jego biosyntezy: syntetazy -Glu-Cys (EC. 6.3.2.2) i syntetazy

glutationowej (EC. 6.3.2.3). Stężenie GSH wzrastało z 376.70 do 1062,42 nmoli SH/g FW w ciągu 96 godzin trak-

towania 0.1 mM Pb

, natomiast stężenie hGSH z 34.32 do 444.05 nmoli SH/g FW.

P10-54

MATURATION OF IN ORGANELLO TRANSLATION PRODUCTS IN PEA MITOCHONDRIA

INVOLVES A COLD SENSITIVE ATP-DEPENDENT METALLOPROTEASE

Bartosz Szczęsny

, Carina Knorpp

, Gunilla Hdkansson

, Hanna Jańska

A: Institute of Biochemistry and Molecular Biology, University of Wroclaw, Wroclaw, Poland

B: Plant Cell Biology, Lund University, Box 7007, S-220 07 Lund, Sweden

Exposure of isolated pea (Pisum sativum L.) mitochondria to low temperature (4°C) resulted in immediate de-

crease in the amounts of the majority of in organello synthesized mitochondrial proteins. Surprisingly, a subset

of extra proteins bands could be detected at 4°C compared to the protein synthesis pattern observed at 25°C and

vice versa. During pulse-chase experiments the protein bands characteristic for the synthesis at 4°C were rapidly

1/2

=minutes) converted into the bands found only after the protein synthesis at 25°C. We believe that the low

temperature made it possible to observe normal intermediates in the proteolytic maturation of in organello syn-

thesized proteins in pea mitochondria. This process requires active metal ion and ATP. Therefore, we suggest that

the maturation of mitochondrially encoded proteins in plant is mediated by a cold sensitive, ATP-dependent

metalloprotease, possibly of the AAA-type. Currently, our investigations concern on identification of mitochon-

drial target proteins which are under proteolytic control. After the in organello synthesis mitochondrial proteins

are fractionated into soluble and membrane fractions, followed by the 2-dimensional electrophoresis. Proteins

characteristic only for the in organello synthesis at 25°C (the mature forms of processed proteins) will be excise

from the gel and subjected to sequencing.

268

SESJA 10 PLAKATY

P10-55

WPŁYW STRESU SOLNEGO NA METABOLIZM AZOTOWY ROŚLIN MOTYLKOWYCH TYPU

AMIDOWEGO I UREIDOWEGO

Magdalena Minta, Teresa Mossor-Pietraszewska, Agata Rola

Zakład Metabolizmu Roślin, Uniwersytet im. Adama Mickiewicza, Poznań

Rośliny adaptują siędo zmiennych warunków środowiska przez modyfikacje swoich torów metabolicznych. Róż-

ne stresy wpływają na zmianęaktywności wielu enzymów, a także na pojawianie sięnowych form molekularnych

tych enzymów. Celem pracy było porównanie zmian aktywności enzymów metabolizmu azotowego, amino-

transferazy asparaginianowej (AspAT, EC 2.6.1.1) i alaninowej (AlAT, EC 2.6.1.2), w odpowiedzi na działanie

stresu solnego i osmotycznego w amidowym łubinie i ureidowej soi. Dwudniowe siewki łubinu (Lupinus luteus

L., cv. Ventus) i soi (Glycine max, L., cv. Luna) hodowano na pożywce Hoaglanda (kontrola) i na pożywce z dodat-

kiem 50 do 250 mM NaCl (stres solny) i takich samych stężeń PEG (stres osmotyczny). Po czterech dniach korzenie

siewek płukano i brano do analiz. Aktywność badanych enzymów oznaczano we frakcji białek rozpuszczalnych.

Elektroforezę(PAGE) prowadzono w 7,5% żelu poliakryloamidowym. Wyniki wykazały, że zarówno stres solny

jak i osmotyczny znacznie hamują wzrost i rozwój siewek badanych roślin. Najwyższa aktywność AspAT i AlAT

występowała w 200 mM NaCl, a przy 250 mM NaCl gwałtownie się zmniejszała. Podobne tendencje występo-

wały w aktywności enzymów siewek poddanych stresowi osmotycznemu. W spektrum izoenzymatycznym

AspAT w stresie solnym w obydwu badanych roślinach pojawił siędodatkowy, trzeci prążek, który jest prawdo-

podobnie nową formą tego enzymu. W spektrum polipeptydów z siewek łubinu i soi poddanych stresowi solne-

mu wystąpiły nowe prążki, które odpowiadają prawdopodobnie białkom indukowanym przez ten stres. Łubin i

soja, przedstawiciele roślin amidowych i ureidowych, podobnie reagowały na stres solny i osmotyczny, u oby-

dwu roślin w stresie solnym pojawiła sięnowa izoforma AspAT. Różnice uwidoczniły siętylko w spektrum poli-

peptydów.

P10-56

WPŁYW KWASU P-KUMAROWEGO NA AKTYWNOŚCI OKSYDAZ W PODŁOŻACH KULTUR

TRAMETES VERSICOLOR

Grzegorz Nowak, Marta Sztal-Gondek, Maria Nowak, Andrzej Leonowicz

Zakład Biochemii, Wydział BiNoZ UMCS, Lublin

Trametes versicolor, grzyb tzw. „białej zgnilizny” drewna, degraduje ligninęprzy udziale wydzielanych pozako-

mórkowo oksydoreduktaz - peroksydaz i lakazy, współdziałających z produkującymi nadtlenek wodoru oksyda-

zami glukozową i glioksalanową. Jak stwierdzono, lakaza i peroksydazy mogą być indukowane w kulturach

grzybów „białej zgnilizny” przez ksenobiotyki mające pierścień aromatyczny, takie jak 2,5-ksylidyna czy kwas fe-

rulowy (4-hydroksy-3-metoksycynamonowy). Naturalnym substratem tych grzybów są ligninocelulozy, w któ-

rych hemicelulozy są połączone z ligniną poprzez estrowo związane pochodne kwasów ferulowego i p-kumaro-

wego (4-hydroksycynamonowego). W przedstawionych badaniach wykazaliśmy, że kwas p-kumarowy, dodany

do podłóż kultur Trametes versicolor zamiast glukozy, powoduje znaczący wzrost aktywności zarówno lakazo-

wej, jak i peroksydazowej, co jest skorelowane ze wzrostem aktywności ligninolitycznej kultur, mierzonej pośred-

nio metodą odbarwiania błękitu remazolowego (Remazol Brilliant Blue). Jednocześnie ze wzrostem aktywności

oksydaz ma miejsce zwiększona sekrecja białek do podłoża i zmiana ich składu, na co wskazują analizy elektrofo-

retyczne. W porównaniu z równolegle badanym wpływem kwasu ferulowego kwas p-kumarowy powoduje

mniejszą sekrecjębiałek do podłoża i większy wzrost aktywności oksydaz, co pozwala sądzić, że jest on silniej-

szym induktorem. Wstępna analiza związków aromatycznych w podłożu po dodaniu kwasów p-kumarowego i

ferulowego wykazała w obu przypadkach obecność kilku związków pochodnych, w tym kwasu kawowego

(3,4-dihydroksycynamonowego), co wskazuje na występowanie w podłożach aktywności demetylujących kwas

ferulowy i hydroksylujących kwas p-kumarowy. Oba te związki powodują również zmiany aktywności proteoli-

tycznych w podłożach badanych kultur, co ma swoje odbicie w zymogramach uzyskanych metodą elektroforezy

w żelu poliakryloamidowym.

Badania finansowane były w ramach BS/Zakład Biochemii, UMCS.

ODPOWIEDŹ ORGANIZMÓW NA CZYNNIKI BIOTYCZNE I ABIOTYCZNE

269

P10-57

TRANSGENICZNY ZIEMNIAK WYRAŻAJĄCY SKRÓCONY GEN REPLIKAZ (ORF2) WIRUSA

LIŚCIOZWOJU ZIEMNIAKA (PLRV) WYKAZUJE ZWIEKSZONĄ ODPORNOŚĆ NA PLRV

Marek Koter, Małgorzata Mozoluk, Jacek Hennig

Warsaw, Poland

Potato Leafroll Virus (PLRV) is the most economically important virus disease of potato worldwide, causing a re-

duction in both quality and yield. The new method of fighting viral diseases is transforming potato plants with vi-

ral genes and this way causing them resistant to infection. A full and modified by deletions PLRV replicase gene

(ORF2) of Canadian isolate has been transformed into potato (Solanum tuberosum L.) cultivars Bzura and Ibis by

Agrobacterium tumefaciens – mediated transformation. The presence of the transgene has been detected by

PCR using specific primers and Southern blot. Northern blot confirmed transcription of the viral genes in differ-

ent organs of the transgenic plants. To see if PLRV replicase protein is present in plants, we overexpressed the

most antigenic fragment (317 amino acids) of ORF2 in Escherichia coli and raised in rabbit. This policlonal anti-

bodies specifically detected replicase expressed in bacteria and in PLRV infected nontransgenic plants. No

replicase has been detected in transgenic but not infected potatoes, despite successful in vitro transcription of

the ORF2 and its derivatives. 40 transgenic plants expressing one of the both replicase constructs have been chal-

lenged with Polish and Canadian PLRV isolates and then level of the infection with specific antibodies was moni-

tored using ELISA with specific antibodies.

P10-58

STRUKTURA I FUNKCJA GENU (ÓW) CYTOPLAZMATYCZNEJ CYKLOFILINY ŁUBINU ŻÓŁTEGO

CV. VENTUS

Katarzyna Nuc

, Przemysław Nuc

, Ryszard Słomski

A: Zakład Diagnostyki Molekularnej, Katedra Biochemii i Biotechnologii Akademii Rolniczej im. Augusta

Cieszkowskiego, Poznań

B: Instytut Genetyki Człowieka Polska Akademia Nauk, Poznań

Cyklofiliny (PPIazy) katalizujące izomeryzację cis-trans wiązań peptydowych X-Pro stanowią rodzinębiałek o sil-

nie zachowawczej strukturze, występujących w komórkach wszystkich badanych pod tym względem organi-

zmów. Około pięć procent wiązań peptydowych X-P występuje w konformacji cis. Do tej pory określono struktu-

ręI-rzędową tylko trzech genów roślinnych cyklofilin: kukurydzy, ryżu i rzodkiewnika. Geny cyklofilin ulegają eks-

presji we wszystkich tkankach na określonym poziomie z pewnymi tendencjami wzrostowymi w tkankach szybko

rosnących. Poziom mRNA cyklofilin ulega zwiększeniu pod wpływem czynników stresowych. Bibliotekę ekspre-

syjną cDNA łubinu żółtego cv.Ventus poddano selekcji, na zasadzie oddziaływań eksprymowane białka – DNA.

Sondęmolekularną stanowiła sekwencja kodująca genu 5S rRNA. Jeden z klonów, wybranych do analizy sekwen-

cji nukleotydowej, zawiera cDNA cytoplazmatycznej cyklofiliny, który posłużył jako sonda molekularna do selek-

cji biblioteki genomowej. Sekwencja kodująca wyselekcjonowanego genu jest w 100 procentach homologiczna

do cDNA. Rejon DNA występujący przed genem zawiera motywy charakterystyczne dla regulacji genów transkry-

bowanych przez polimerazęRNA II (motyw TATA i tzw. G-box). Stwierdzono również obecność motywów cha-

rakterystycznych dla promotorów niektórych nodulin (AAAGAT i tzw. Rejon bogaty w AT). Wykazano, że inokula-

cja roślin bakteriami symbiotycznymi Bradyrhizobium sp. (lupinus) powoduje wzrost poziomu mRNA cyklofilin w

badanych organach w porównaniu z roślinami nie inokulowanymi. Wykonano hybrydyzację in situ na przekro-

jach poprzecznych łodygi i korzenia z brodawką. Sygnał hybrydyzacyjny zlokalizowany jest głównie w tkankach

merystematycznych tj. kambium wiązkowe i merystem brodawki.

Praca finansowana w części przez KBN 0226/P04/98/14 oraz UAM–AR Nr PU-II/2.

270

SESJA 10 PLAKATY

P10-59

INDUKCJA STRESU OKSYDACYJNEGO W TKANKACH NARAŻONYCH NA DZIAŁANIE

CZTEROCHLORKU WĘGLA

Stanisława Szymonik-Lesiuk

, Marta Stryjecka-Zimmer

, Grażyna Czechowska

, Maria Słomka

Agnieszka Mądro

, Krzysztof Celiński

A: Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej

B: Katedra i Klinika Gastroenterologii Akademia Medyczna w Lublinie

Reakcje wolnorodnikowe zachodzą w toku wielu procesów fizjologicznych i patologicznych. Reszty wieloniena-

syconych kwasów tłuszczowych fosfo- i glikolipidów błon biologicznych oraz białka błonowe są szczególnie na-

rażone na uszkodzenia wolnorodnikowe. Reaktywne formy tlenu zapoczątkowują ciąg reakcji w trakcie których

dochodzi do peroksydacji lipidów, uszkodzenia białek i kwasów nukleinowych. Czterochlorek węgla to rozpusz-

czalny w lipidach silnie hepatotoksyczny związek dający wiele pośrednich toksycznych metabolitów, które mają

zdolność do wiązania z lipidami i białkami błonowymi. Celem pracy było badanie czy i w jakim stopniu intoksyka-

cja czterochlorkiem węgla (CCl

) ma wpływ na procesy peroksydacji wielonienasyconych kwasów tłuszczowych,

zawartość całkowitych grup tiolowych i aktywność kluczowego błonowego enzymu Na

ATP-azy. Badania

przeprowadzano na szczurach rasy Wistar. Grupębadaną stanowiły zwierzęta, którym podawano przez trzy dni

dootrzewnowo CCl

w dawce 0,5ml/kg w 2,0 ml/kg oliwy z oliwek. Grupa kontrolna otrzymywała w tym samym

czasie i dawce oliwęz oliwek. Po dekapitacji do badań pobierano wątrobę, mózg, nerki i serce, z których przygo-

towywano homogenaty. Produkt peroksydacji lipidów, dialdehyd malonowy (MDA) oznaczano na podstawie

barwnej reakcji z kwasem tiobarbiturowym wg Ohkawa i wsp. Poziom całkowitych grup tiolowych oznaczano

wg metody Sedlak i wsp.i wyrażano w mmolach/100g mokrej tkanki. Aktywność Na

ATP-azy oznaczano wg

metody Lee i wsp. i wyrażano w M/mg białka/godz. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono

wzrost stężenia MDA w badanych tkankach (najwyższy w wątrobie i nerkach-średnio o 11,6%) zwierząt podda-

nych działaniu CCl

w porównaniu z grupą kontrolną. Poziom całkowitych grup tiolowych był nieznacznie obniż-

ony (średnio o 2, 6%) we wszystkich tkankach w grupie badanej. Aktywność Na

ATP-azy w homogenatach

uzyskanych z wątroby i nerek zwierząt po intoksykacji CCl

była niższa o 21,5% zaś w mózgu o 32% w porówna-

niu z grupą kontrolną. Podsumowując badania można stwierdzić, że nawet krótkotrwała intoksykacja CCl

znacznie nasila procesy peroksydacji lipidów, zmienia w sposób istotny aktywność Na

ATP-azy i prowadzi do

obniżenia poziomu całkowitych grup tiolowych.

P10-60

WPŁYW HORMONÓW TARCZYCY NA INDUKCJĘ STRESU OKSYDACYJNEGO

Marta Stryjecka-Zimmer, Stanisława Szymonik-Lesiuk

Katedra i Zakład Biochemii i Biologii Molekularnej, Akademia Medyczna w Lublinie

Hormony tarczycy wywierają istotny wpływ na szereg procesów metabolicznych, są niezbędne dla prawidłowe-

go różnicowania i wzrostu organizmu. Stymulują oksydatywną fosforylacjęw mitochondriach i regulują zużycie

tlenu w większości tkanek zwierzęcych. Wzrost poziomu hormonów tarczycy prowadzi do nasilenia przemian ka-

tabolicznych, podwyższenia podstawowej przemiany materii, nasilenia termogenezy i zwiększonego zużycia tle-

nu przez tkanki. Stres oksydacyjny może stanowić istotny czynnik w etiopatogenezie nadczynności tarczycy. Ce-

lem pracy jest ocena peroksydacji wielonienasyconych kwasów tłuszczowych, zawartości grup tiolowych w

białkach oraz grup tiolowych niebiałkowych w tkankach królika z doświadczalnie wywołaną hipertyreozą. W celu

wywołania hipertyreozy 8-tygodniowe króliki otrzymywały w ciągu 4 dni iniekcje domięśniowe L-tyroksyny (200

mikrogramów/kg masy ciała). W piątym dniu eksperymentu króliki dekapitowano. Oznaczony poziom hormo-

nów tarczycy 2,5–3,0-krotnie przekraczał poziom hormonów we krwi zwierząt zdrowych. Peroksydacjęwielonie-

nasyconych kwasów tłuszczowych oceniano na podstawie stężenia MDA (dialdehydu malonowego) wg metody

Ohkawa i wsp. W homogenatach tkankowych. Poziom grup tiolowych całkowitych oraz niebiałkowych oznacza-

no w homogenatach wg metody Sedlak i wsp. i wyrażano w mmolach/100g mokrej tkanki. Wykazano, że pod-

wyższony w ciągu czterech dni poziom hormonów tarczycy powoduje istotny wzrost stężenia MDA w badanych

tkankach (wątroba, nerki, serce, mózg) w porównaniu z kontrolą. Poziom grup tiolowych białkowych w bada-

nych tkankach wynosił od 0,46–1,29 mmola/100 g mokrej tkanki, grup tiolowych niebiałkowych od 0,30–0,88

mmola/100 g mokrej tkanki. Podwyższony poziom hormonów tarczycy nie wpłynął w istotny sposób na poziom

grup tiolowych w sercu. W pozostałych tkankach obserwowano nieznaczne obniżenie grup tiolowych, w wątro-

bie o około 20% w porównaniu z kontrolą. Uzyskane wyniki wskazują, że podwyższony eksperymentalnie w

ODPOWIEDŹ ORGANIZMÓW NA CZYNNIKI BIOTYCZNE I ABIOTYCZNE

271

ciągu 4 dni poziom hormonów tarczycy prowadzi do stresu oksydacyjnego i nasilenia procesów peroksydacji lipi-

dów. W okresie tym nie dochodzi jednak do istotnych zmian w poziomie grup tiolowych.

P10-61

OBSERWACJA ZMIAN W SYSTEMACH ANTYOKSYDACYJNYCH ZWIĄZANYCH

Z NIEFERMENTOLALNYM ŹRÓDŁEM WĘGLA U DROŻDŻY SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Witold Jakubowski

, Grzegorz Bartosz

A: Katedra Biofizyki Molekularnej, Uniwersytet Łódzki

B: Zakład Biofizyki i Biotribologii, Wydział Mechaniczny, Politechnika Łódzka

C: Katedra Biologii, WSP Rzeszów

Stała ekspozycja komórek organizmów żywych na reaktywne formy tleny (RFT) doprowadziła do powstania w

toku ewolucji szeregu mechanizmów obronnych przed niekorzystnymi efektami stresu oksydacyjnego. Wśród

nich można wydzielić dwie grupy – linięochrony nieenzymatyczną oraz enzymatyczną. Drożdże Saccharomyces

cerevisiae należą do grupy anaerobów fakultatywnych, co pozwala na prowadzenie hodowli w warunkach tle-

nowych, jak i również w beztlenowych. Przy niedostępności tlenu komórki nie mogą wykorzystać szlaku oddy-

chania tlenowego, a uzyskiwanie energii niezbędnej dla procesów metabolicznych zachodzi jedynie dzięki gliko-

lizie. Do odwrotnej sytuacji dochodzi, jeżeli komórki mają dostępne jedynie niefermentowalne źródło węgla (gli-

cerol). Zablokowanie oddychania tlenowego, które jest głównym donorem endogennych RFT w komórce, pro-

wadzi od zmian w systemach chroniących komórkęprzed niekorzystnymi skutkami ekspozycji na RFT. Obserwo-

wane procesy noszą znamiona reakcji adaptacyjnej do zmniejszonego toksycznego oddziaływania środowiska.

Scharakteryzowany został poziom ochrony antyoksydacyjnej komórek hodowanych w warunkach standardo-

wych do komórek poddanych hodowli beztlenowej oraz hodowli na niefermentowalnym źródle węgla. Określo-

ne zostały różnice wewnątrzkomórkowego stężenia glutationu oraz aktywności takich enzymów jak: dysmutaza

ponadtlenkowa i katalaza. Obserwowane były także różnice w szybkości utleniania dichlorofluorescyny (DCF).

P10-62

OCENA ANTYOKSYDACYJNEGO DZIAŁANIA -TOKOFEROLU, KWASU ASKORBINOWEGO I

N-ACETYLOCYSTEINY NA KOMÓRKI ŚRÓDBŁONKA NACZYŃ MIKROKRĄŻENIA WE

WSTRZĄSIE KRWOTOCZNYM U SZCZURA

Ilona Korzonek Szlacheta

, Krystyna Żwirska-Korczala

, Henryk Grzybek

, Beata Marniok

, Anna

Pogorzelska

, Jacek Wojtacha

, Piotr Warakomski

A: Katedra i Zakład Fizjologii Śląskiej Akademii Medycznej, Zabrze

B: Katedra i Zakład Histologii Śląskiej Akademii Medycznej, Zabrze

C: Katedra i Zakład Anatomii Śląskiej Akademii Medycznej, Zabrze

Zaburzenia w krążeniu w następstwie wstrząsu krwotocznego są przyczyną upośledzenia czynności wielu

narządów wskutek ich niedokrwienia i niedotlenienia. Zarówno ischemia jak i reperfuzja są powodem generowa-

nia w nadmiarze reaktywnych form tlenu uszkadzających komórki śródbłonka. Celem pracy była ocena

śródbłonka naczyń mikrokrążenia we wstrząsie pokrwotocznym po zastosowaniu antyoksydantów takich jak:

alfa-tokoferol, kwas askorbinowy i n-acetylocysteiny. Badania wykonano u 24 szczurów w narkozie uretanowej

stosując kontrolowany upust krwi, aż do uzyskania hipotensji rzędu 35–40mmHg, którą utrzymywano przez

okres 60 minut. W drugiej grupie zwierząt dwie godziny przed upustem krwi podano dootrzewnowo alfa-toko-

ferol w dawce 400mg/kg m.c. Po upływie tego czasu upuszczano krew do uzyskania wartości ciśnienia skurczo-

wego około 35mmHg i podano dożylnie n-acetylocysteinęw dawce 150mg/kg m.c., a następnie kwas askorbino-

wy w dawce 20mg/kg m.c. Następnie po izolacji tętnicy krezkowej i perfundacji jej 2,5% roztworem glutaralde-

hydu pobierano wycinki ze środkowej części ostatniej pętli jelita cienkiego, które opracowano histologicznie i

oceniano w mikroskopie świetlnym i elektronowym. U zwierząt we wstrząsie krwotocznym wykazano cechy

uszkodzenia śródbłonka tj. obrzęk komórek śródbłonka włośniczek, uszkodzenie i zatarcie struktury grzebieni

mitochondrialnych, błon otaczających, uwypuklenie cytoplazmy do światła naczynia. W przypadku podania an-

tyoksydantów nie stwierdzono w obrazie mikroskopii elektronowej zmian uszkodzeniowych komórek

śródbłonka naczyń mikrokrążenia. Podane antyoksydanty (alfa-tokoferol, n-acetylocysteina i kwas askorbinowy)

chronią śródbłonek naczyń mikrokrążenia przed uszkodzeniem.

272

SESJA 10 PLAKATY

P10-63

SKUTKI MUTACJI sod2 W KOMÓRKACH DROŻDŻY S. CEREVISIAE

Anna Krzepiłko

, Tomasz Biliński

A: Instytut Nauk Rolniczych w Zamościu Akademia Rolnicza w Lublinie, Zamość

B: Wyższa Szkoła Pedagogiczna, Rzeszów

W komórkach drożdży S.cerevisiae na terenie cytoplazmy występuje dysmutaza ponadtlenkowa CuZnSOD, a na

terenie mitochondriów MnSOD. Oba enzymy katalizują ten sam typ reakcji dysmutacjęanionorodnika ponad-

tlenkowego, jednak właściwości katalizowanego substratu powodują, że mutacje sod1 (brak aktywnej CuZn-

SOD) i sod2 (brak aktywnej MnSOD) dają różne efekty fizjologiczne. W opisywanym mutancie sod2 konsekwen-

cją braku aktywnej dysmutazy w mitochondriach jest obniżenie przeżywalności, osłabienie kondycji metabolicz-

nej komórek, przyspieszone w porównaniu z izogenicznym szczepem dzikim procesy starzenia. Opisywany mu-

tant sod2 drożdży nie jest zdolny do wzrostu na nie ulegających fermentacji źródłach węgla, charakteryzuje się

niskim pobieraniem tlenu, jednak niezdolność do oddychania nie jest spowodowana dodatkową mutacją rho-.

Świadczy o tym odtwarzanie fenotypu rho+ w diploidalnym szczepie otrzymanym w wyniku krzyżowania szcze-

pu Mn-SOD z mutantem rho- szczepu dzikiego. Konsekwencją braku aktywnej dysmutazy ponadtlenkowej Mn-

SOD są zaburzenia w tworzeniu białek hemowych. W szczepie Mn-SOD

występuje wyraźne zaniżony poziom ka-

talazy, obserwowano też brak maksimów absorbcji na widmach cytochromowych. Przyczyną tego zjawiska są

zaburzenia w funkcjonowaniu szlaku syntezy hemu. Stężenie ALA w komórkach sod2 było wyższe, natomiast

stężenie hemu było bardzo niskie w porównaniu ze szczepem dzikim. Przypuszczalnie zmiany te powodowane są

przez jakieś mechanizmy regulacyjne. Wskazuje na to występowanie niewielkie ilości cytochromów na widmie

cytochromowym mutanta sod2 w warunkach derepresji glukozowej. Wyniki uzyskane z analizy widm cytochro-

mowych wykonanych po adaptacji oddechowej sugerują, że brak dysmutazy mitochondrialnej może prowadzić

do nasilenia reakcji wolnorodnikowych w mitochondriach, a to z kolei może powodować degradacjęcytochro-

mów.

P10-64

WPŁYW PRENATALNEGO NARAŻENIA MANGANEM NA WYCHWYT I WBUDOWYWANIE

(

H)GLUKOZY W MÓZGU I NIEKTÓRYCH TKANKACH OBWODOWYCH SZCZURÓW

Ryszard Szkilnik, Janusz Konecki, Adam Durczok, Ryszard Brus

Katedra i Zakład Farmakologii oraz Katedra, Zakład Histologii i Embriologii w Zabrzu Śląskiej Akademii Medycznej w

Katowicach, Zabrze

Mangan jest jednym z pierwiastków śladowych będących kofaktorem wielu reakcji enzymatycznych w organi-

zmach ssaków. Przyjęty w nadmiarze przez człowieka powoduje między innymi zmiany w ośrodkowym układzie

nerwowym przypominające zaawansowaną chorobęParkinsona i świadczące o zaburzeniach funkcji ośrodko-

wego układu dopaminowego. Uprzednio wykazaliśmy, że prenatalne narażenie głównie na ołów i kadm a także

częściowo selen, powoduje dalekosiężne skutki neurotoksyczne u dorosłych szczurów, manifestujące się głów-

nie zaburzeniami w czynności ośrodkowego układu dopaminowego i serotoninowego a także zmianami proce-

sów energetycznych związanych z przemianami glukozy. Dlatego celem niniejszych badań było zbadanie naraże-

nia manganem w trakcie rozwoju śródmacicznego na wychwyt i wbudowywanie znakowanej trytem glukozy w

mózgu i niektórych tkankach obwodowych szczura. Szczurzyce szczepu Wistar otrzymywały w trakcie ciąży do

picia wodę(kontrola) lub roztwór MnCl

O (10 000 ppm Mn) ad libitum. W momencie urodzenia potomstwa

roztwór manganu zastępowano wodą. Dalsze doświadczenia wykonano na potomnych 8-tygodniowych sami-

cach. Szczurom obu grup podano D-[6-

H]glukozę500 Ci IP i dekapitowano po 15 minutach i 4 godzinach. W

wybranych strukturach mózgu (prążkowie, kora mózgowa, zakręt Hippokampa) oraz niektórych narządach ob-

wodowych po zważeniu, rozpuszczeniu i dodaniu płynu scyntylacyjnego, zliczano liczbęimpulsów (DPM/100 mg

świeżej tkanki). Wykazano, że narażenie manganem w trakcie rozwoju śródmacicznego nie modyfikuje wychwy-

tu i wbudowywania (

H)glukozy w mózgu a w narządach obwodowych jedynie w mięśniu sercowym potomnych

dorosłych szczurów.

Finansowane przez Śląską Akademię Medyczną: NN-4-094/00.

ODPOWIEDŹ ORGANIZMÓW NA CZYNNIKI BIOTYCZNE I ABIOTYCZNE

273

P10-65

WRAŻLIWOŚĆ KOMÓREK L5178Y NA H

ZALEŻY OD POZIOMU „DOSTĘPNYCH” JONÓW

ŻELAZA

Teresa Bartłomiejczyk

, Paweł Lipiński

, Jean-Claude Drapier

, Leonor Oliveira

, Barbara Sochanowicz

Marcin Kruszewski

A: Instytut Chemii i Techniki Jądrowej, Zakład Radiobiologii i Ochrony Zdrowia, Warszawa

B: Instytut Genetyki i Hodowli Zwierząt PAN, Zakład Biologii Molekularnej, Jastrzębiec, Mroków

C: Institut de Chimie des Substances Naturelles, CNRS, 91190 Gif-sur-Yvette, Francja

Uszkodzenia komórki powstające w wyniku działania RFT ulegają zwiększeniu na skutek obecności jonów żelaza,

które reagując z H

w reakcji Fentona powodują powstanie wyjątkowo toksycznego rodnika wodorotlenowe-

go. Scharakteryzowano i porównano regulacjęmetabolizmu żelaza w dwóch podliniach mysiej białaczki limfa-

tycznej L5178Y (LY) różniących sięwrażliwością na H

. Wykazano, że poziom “dostępnych” jonów żelaza (LIP),

czyli jonów żelaza związanych z wewnątrzkomórkowymi, niskocząsteczkowymi chelatorami jest ponad 3-krotnie

wyższy we wrażliwych na H

komórkach LY-R, niż w odpornych na ten czynnik komórkach LY-S. Wykazano

również, że ekspresja ferrytyny (Fr), głównego białka wiążącego żelazo, jest istotnie wyższa w komórkach LY-S

niż w komórkach LY-R na poziomie mRNA i białka. Potwierdza to rolęFr jako czynnika antyoksydacyjnego. Doda-

nie do hodowli komórek LY chelatora jonów żelaza - deferoksaminy (DFO) - zmniejsza wrażliwość tych komórek

na H

, mierzoną zdolnością do wytwarzania kolonii po traktowaniu czynnikiem uszkadzającym, jak również

znajduje odzwierciedlenie w liczbie początkowych uszkodzeń DNA. Działanie to jest bardziej widoczne w komór-

kach LY-R niż w komórkach LY-S. Jednocześnie zaobserwowano, że DFO redukuje poziom LIP o 70% w komór-

kach LY-R i tylko o 20% w linii LY-S. Przedstawione wyniki wskazują, że wrażliwość komórek LY na H

zależy od

poziomu „dostępnych” jonów żelaza. Obniżenie poziomu „dostępnych” jonów żelaza na skutek działania czyn-

ników wewnętrznych (ekspresja ferrytyny) lub zewnętrznych (dodanie chelatora) powoduje zmniejszenie liczby

uszkodzeń DNA i zwiększenie przeżywalności komórek. Wydaje się więc, że poziom jonów żelaza jest jednym z

kluczowych czynników określających toksyczność H

w komórkach ssaków.

P10-66

WPŁYW ZWIĄZKÓW FENOLOWYCH IZOLOWANYCH Z BROKUŁÓW NA PRZEŻYWALNOŚĆ

I WZROST BEZDYSMUTAZOWEGO SZCZEPU DROŻDŻY SACCHAROMYCES CEREVISIAE

Robert Pawliszak

, Anna Krzepiłko

, Barbara Baraniak

A: Instytut Nauk Rolniczych w Zamościu, Akademia Rolnicza w Lublinie, Zamość

B: Katedra Biochemii i Chemii Żywności Akademia Rolnicza w Lublinie

Powszechnie występujące w roślinach związki fenolowe mają właściwości antymutagenne i antykancerogenne

(

Radtke J., 1998; Tanaka T., 1995

). W prezentowanej pracy oceniano in vivo antyoksydacyjne właściwości związków

fenolowych. Mutanty drożdży S. cerevisiae pozbawione jednego z elementów ochrony antyoksydacyjej są uzna-

nym obiektem badań nad biologią wolnych rodników [

Biliński T. (1985): Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol 130:

533–539; Radtke J. (1998): Z Ernahrungswiss, Vol 37:190–7; Tanaka T (1995): Cancer; Vol 75: 1433–9

.]. Do badań wybrano

mutanta sod1 S. cerevisiae pozbawionego aktywnej dysmutazy ponadtlenkowej i izogeniczny do niego szczep

dziki. Analizowano wpływ ekstraktów z brokułów i wybranych kwasów fenolowych na przeżywalność i dynami-

kęwzrostu hodowli drożdży. Dwa z badanych kwasów – kawowy i cynamonowy powodowały hamowanie wzro-

stu komórek drożdży, przy czym największy efekt uzyskano przy ich stężeniu wynoszącym 0,1%. Natomiast kwas

syryngynowy, w badanym zakresie stężeń, nie wpływał na intensywność wzrostu hodowli drożdży. Acetonowe,

alkoholowe i wodne ekstrakty zawierające naturalne związki fenolowe brokułów nie hamowały wzrostu hodow-

li, przeciwnie, w przypadku acetonowego ekstraktu z brokułów przy stężeniu 100% v/v uzyskano przyśpieszenie

wzrostu hodowli drożdży.

274

SESJA 10 PLAKATY

P10-67

WSPÓŁZALEŻNOŚĆ POMIĘDZY STRUKTURĄ ZWIĄZKÓW POCHODNYCH STILBENU A ICH A

WŁAŚCIWOŚCIAMI ANTYOKSYDACYJNYMI

Henryka Łapkowska, Wojciech Bogusławski

Katedra i Zakład Chemii Ogólnej, Akademia Medyczna w Gdańsku

Pochodne stilbenu są związkami chemicznymi wzbudzającymi coraz większe zainteresowanie. Wynika to faktu,

że niektóre z nich wykazują właściwości biologiczne estrogenów, są inhibitorami cholesterologenezy oraz wyka-

zują właściwości antyoksydacyjne. Jednakże wśród wielu związków będących pochodnymi stilbenu, tylko niektó-

re z nich wykazują opisane wyżej właściwości. Celem prezentowanej pracy jest określenie współzależności po-

między strukturą pochodnych stilbenu a zdolnością tych związków do hamowania procesu indukowanej jonami

miedzi (Cu

) peroksydacji lipidów w surowicy krwi człowieka. Badane pochodne stilbenu podzielono na trzy

grupy: (1) Pochodne zawierające pierścień fenylowy: jak trans i cis stilben. (2) Pochodne zawierający układ hy-

droksyfenylowy jak resveratrol i stilbestrol. (3) Pochodne stilbenu zawierające w cząsteczce tlen niezwiązany z

pierścieniem fenylowym jak tlenek trans – stilbenu oraz 4 – hydroxymetylostilben. Wpływ tych związków na pe-

roksydacjęlipidów surowicy krwi porównano z wpływem 17 beta – hydroksyestradiolu i estronu, oraz z

wpływem niearomatycznych sterydów posiadających grupęhydroksylową związaną z pierścieniem cykloheksa-

nowym jak dehydroepiandrosteron (DHEA) a także z antyoksydacyjnym wpływem troloksu (pochodną tokolu).

Uzyskane wyniki wskazują, że tylko te pochodne stilbenu, które zawierają w cząsteczce ugrupownie hydroksyfe-

nylowe wykazują aktywność hamowania indukowanej jonami miedzi peroksydacji lipidów surowicy krwi.

P10-68

ANALIZA POPULACJI SZCZEPÓW RHIZOBIUM LEGUMINOSARUM VAR. VICEAE

BRODAWKUJĄCYCH BOBIK W DOŚWIADCZALNYCH UPRAWACH POLOWYCH

Krzysztof Pudełko

, Jerzy Szukała

A: Katedra Biochemii i Biotechnologii, Akademia Rolnicza im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu, Poznań

B: Katedra Uprawy Roli i Roślin, Akademia Rolnicza im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu, Poznań

Brodawkowanie bobiku (Vicia faba) w glebach polskich nie stanowi problemu ponieważ licznie występują w nich

szczepy endogenne, nie znamy jednak ich wydajności symbiotycznej oraz wzajemnej konkurencyjności w zróżni-

cowanych warunkach agrotechnicznych. Dlatego prace nad przygotowaniem i możliwością wprowadzenia ak-

tywnych inokulów zwiększających wydajność biologicznego wiązania azotu są szczególnie istotne w odniesieniu

do uprawy tych roślin, wobec dużego zróżnicowania wydajności wiązania azotu układów symbiotycznych Vicia

faba z bakteriami Rhizobium leguminosarum var. viceae, zawierającej sięw przedziale 45–552 kg/ha/rok azotu

związanego symbiotycznie. Niewystarczająco poznany jest także wpływ stosowania uproszczonych metod upra-

wy roślin motylkowych na proces brodawkowania i symbiotycznego wiązania azotu atmosferycznego. Specy-

ficzność upraw roślin motylkowych polega na tym, że optymalne rezultaty biologiczne i ekonomiczne uzyskiwa-

ne są jedynie wówczas, gdy w środowisku glebowym dochodzi do powstania efektywnych układów symbiotycz-

nych z udziałem roślin uprawnych i symbiotycznej mikroflory glebowej. Wobec coraz powszechniejszego stoso-

wania uproszczonych metod uprawy wydaje sięzasadne podjęcie prac mających na celu lepsze poznanie proce-

sów biologicznych zachodzących w warunkach środowiska dalece różnych od znanych z dotychczasowej prakty-

ki rolniczej. Szczepy Rhizobium leguminosarum var. viceae wyizolowano z brodawek korzeniowych roślin bobiku

pochodzących z doświadczalnych stanowisk polowych, na których stosowano różne metody uprawy roli, zróżni-

cowane dawki nawożenia azotowego oraz deszczowanie. Zróżnicowanie populacji określono na podstawie ana-

lizy występowania naturalnej oporności bakterii na wybrane antybiotyki oraz analizy porównawczej struktury fi-

zycznej genomów bakteryjnych przeprowadzonej metodą rep-PCR.

ODPOWIEDŹ ORGANIZMÓW NA CZYNNIKI BIOTYCZNE I ABIOTYCZNE

275

P10-69

ZNACZENIE UTLENIANIA BIAŁEK BŁONOWYCH W MECHANIZMACH CYTOTOKSYCZNOŚCI

ADRIAMYCYNY

Dorota Kulawiak-Gałąska

, Beata Kalińska-Błach

, Michał Woźniak

, Dorota Żurawa

Joanna Skórko-Glonek

, Barbara Lipińska

A: Katedra i Zakład Chemii Ogólnej AM w Gdańsku

B: Katedra Biochemii, Uniwersytet Gdański

Adriamycyna (ADR) jest szeroko stosowanym lekiem przeciwnowotworowym wykazującym znaczącą kardiotok-

syczność. Mechanizm kardiotoksycznego działania ADR mimo wielu badań nie został dostatecznie wyjaśniony i

jedna z teorii zakłada, że peroksydacja lipidów leży u jego podłoża. Celem podjętych badań było porównanie

procesów utleniania fosfolipidów i białek błonowych izolowanych błon reticulum sarkoplazmatycznego serca

szczura w obecności ADR. Wyniki wykazały znaczący 100% wzrost poziomu grup karbonylowych w błonach eks-

ponowanych na działanie ADR. Nie zaobserwowano wpływu ADR na procesy peroksydacji lipidów błonowych w

tych samych warunkach. Utlenianie białek błonowych w komórkach prokariotycznych inicjuje proces indukcji se-

lektywnej proteazy stresu termicznego HtrA. Ostatnio wykryto ekspresjętego enzymu w komórkach eukariotycz-

nych. Zbadano indukcjęHtrA w komórkach E. coli eksponowanych na działanie 100 M ADR. Uzyskane wyniki

potwierdzają możliwość utleniania białek błonowych przez rodniki semichinonowe ADR. Wolnorodnikowe

uszkodzenie białek przy braku wpływu na utlenienie lipidów błonowych może być elementem cytotoksycznego

działania tego związku.

P10-70

PROTEKCYJNY WPŁYW INOZYNY NA DEGRADACJĘ PLAZMIDOWEGO DNA WYWOŁANĄ

AUTOOKSYDACJĄ FE

Anna Sasin, Beata Kalińska-Błach, Michał Woźniak

Katedra i Zakład Chemii Ogólnej, AM w Gdańsku

Astrocyty poddane ischemii przeżywają jeśli w środowisku inkubacyjnym znajduje sięadenozyna. Mechanizm

działania adenozyny nie został dostatecznie wyjaśniony aczkolwiek enzymatyczna konwersja adenozyny do ino-

zyny wydaje siębyć niezbędnym etapem w powstawaniu cytoprotekcji. Jednym z ewentualnych mechanizmów

działania wydaje siębyć możliwość tworzenia kompleksów inozyna-Fe

i delokalizacja Fe

uniemożliwiająca

wolnorodnikową destrukcjękrytycznych biomolekuł. Tkanka nerwowa jest bogatym źródłem Fe

, stąd też mo-

żliwość toksycznego wpływu tego mikroelementu w warunkach stresu oxydacyjnego wydaje sięprawdopodob-

na. Ostanio obserwowano wzmożoną degradacjęgenomowego DNA w hepatocytach po zadziałaniu fenylohy-

drazyny–induktora akumulacji Fe

w tych komórkach. W związku z powyższym zbadano wpływ Fe

na degra-

dacjęplazmidowego DNA (pBR322) metodą elektroforezy na żelu agarozowym. Uszkodzenia DNA obserwowa-

no jako konwersjęformy superzwiniętej, dwuniciowej cząsteczki plazmidowego DNA (formy natywnej – CCC) do

formy zrelaksowanej OC. DNA inkubowane w obecności soli Fe

(1 i 5 M) wykazywało cechy degradacji (przejś-

cie formy CCC plazmidu do formy OC). Inozyna i deoksyinozyna dodane do układu inkubacyjnego w stężeniach

0.1 i 1mM wywierały znaczny wpływ protekcyjny na strukturęDNA poddanego efektom działania Fe

. Wydaje

sięwięc iż wiązanie Fe

przez inozynęi delokalizacja Fe

leżą u podstaw obserwowanych efektów protekcyj-

nych inozyny.

276

SESJA 10 PLAKATY

P10-71

ATTENUATION OF ESR SIGNAL DECAY OF QUINOLINIC AROMATIC AMNOXYL BY

2 HYDROXYESTRADIOL, ENDOGENOUS ANTIOXIDANT

Zbigniew Heleniak

, Jerzy Nowak

, Wiesława Mickiewicz

, Beata Kalińska-Błach

, Giancarlo Falcioni

Lucedio Greci

, Michał Woźniak

A: Katedra i Zakład Chemii Ogólnej AM w Gdańsku

B: Katedra i Zakład Biofizyki AM w Gdańsku

C: Dipartimento di Biologia molecolare cellulare animale, Universita degli studi di Camerino-Italy

D: Dipartimento di Scienze dei Materiali e della Terra, Universita di Ancona-Italy

In this investigation we utilized the EPR spectroscopy using aromatic aminoxyl 1,2-dihydro-2,2-diphen-

yl-4-ethoxy-quinoline-1-oxyl (QUAL) to investigate the effect of endogenous antioxidant on the kinetics of

peroxidative activity of metmyoglobin in the presence of CumOOH. Addition of CumOOH resulted in time and

concentration dependent exponential decay of EPR pick signal intensity. Presence of 2-OH estradiol but not par-

ent molecule estradiol significantly attenuated decay of ESR signal intensity. In conclusion hydroxylation of

estradiol to catechol product can produce efficient scavenger of peroxyl radical originating from the decomposi-

tion of hydroperoxides mediated by peroxidase activity of hemoproteines.

P10-72

INHIBITORY EFFECT OF 4-OH-TEMPO-ACYL ANALOGS ON LIPID PEROXIDATION INDUCED

IN LIPID MODEL MEMBRANES BY METMYOGLOBIN AND CumOOH

Bartłomiej Gałecki

, Giancarlo Falcioni

, Michał Woźniak

A: Katedra i Zakład Chemii Ogólnej AM w Gdańsku

B: Dipartimento di Biologia molecolare cellulare animale, Universita degli studi di Camerino-Italy

Lipid peroxidation of membranes has been implicated in numerous pathological and toxicological conditions.

Myoglobin (Mb) a muscle protein involved in intracellular transport and storage of oxygen can act as peroxidase

in the presence of hydroperoxides and it induces lipid peroxidation. In this study we investigated the effect of

O-acyl analogs of 4OH TEMPO on lipid peroxidation mediated by peroxidase activity of metmyoglobin.

Myoglobin has been reported to contain a binding site for fatty acids so we investigated the binding of acyl

analogs of 4OH TEMPO to this protein. EPR spectrum demonstrated binding of acyl analogs to hemoprotein. We

demonstrated that they strongly inhibit lipid peroxidation acyl analogs being more effective than parent

nonacylated molecule.

P10-73

THE EFFECTS OF PIPERIDINE NITROXIDES ON OXIDATIVE DAMAGE TO PLASMID AND

GENOMIC DNA

Beata Kalińska-Błach

, Elisabetta Damiani

, Lucedio Greci

, Michał Woźniak

A: Katedra i Zakład Chemii Ogólnej AM w Gdańsku

B: Dipartimento di Scienze dei Materiali e dell Terra, Universita di Ancona

Here we report on the results obtained after exposure of pBR322 and pMOS Blue plasmid DNA and calf thymus

(CT)DNA to peroxy radicals generated by the water-soluble radical inhibitor AAPH using sensitive in vitro assay

for DNA damage. In addition we tested for the potential of aliphatic nitroxides TEMPO and TEMPOL to inhibit

peroxy radical mediated DNA damage inflicted by termodissociation of AAPH. To assay for single strand breaks

induced by peroxy radicals, supercoiled plasmid DNA was incubated with AAPH with or without different con-

centrations of test compounds. Than samples were directly analyzed by electrophoresis in agarose gels. After 1h

of incubation with 50mM AAPH (well-known azo-initiator that produces tertiary carbon radicals upon

thermolysis which in the presence of oxygen generates a constant flux of peroxy radicals) it is converted into the

relaxed form. TEMPO and TEMPOL was found to inhibit DNA nicking at 1mM final concentration. The outcome

obtained with plasmid DNA exposed for peroxy radical flux was also confirmed when CT-DNA (non-supercoiled

substrate) was treated in a similar manner. Again piperidine nitroxides TEMPO and TEMPOL were able to com-

pletely protect CT-DNA from oxidative damage. The probable mechanism of the protection displayed by the

ODPOWIEDŹ ORGANIZMÓW NA CZYNNIKI BIOTYCZNE I ABIOTYCZNE

277

nitroxides against AAPH–induced DNA damage is due to scavenging of the initial carbon centered radicals gener-

ated upon thermal decompossition of the azo-initiator to give alkylated hydroxylamines.

P10-74

OCHRONNY WPŁYW KATECHOLI ESTROGENÓW NA OKSYDACYJNĄ MODYFIKACJĘ

ALBUMINY WYWOŁANĄ RODNIKAMI PONADTLENKOWYMI

Jerzy Szymendera, Jerzy Nacel, Halina Hałoń, Teresa Powierza, Michał Woźniak

Katedra i Zakład Chemii Ogólnej Akademii Medycznej w Gdańsku

Albumina osocza krwi poza funkcją transportową i osmotyczną pełni również istotną rolęw „buforowaniu” po-

ziomu reaktywnych form tlenu będąc obiektem ataku wolnorodnikowego podczas stresu oksydacyjnego. Spo-

śród naturalnych przeciwutleniaczy estrogeny przykuwające rosnącą uwagęze względu na ich udokumentowa-

ny ochronny wpływ w niedokrwiennej chorobie serca. Mechanizm protekcyjnego działania estrogenów nie jest

do końca wyjaśniony, postulowano rolętych hormonów jako biologicznych przeciwutleniaczy. W przeprowa-

dzonych eksperymentach albuminęwołu eksponowano na działanie wodoronadtlenku butylu i PbO

(układ ge-

nerujący rodniki ponadtlenkowe butylu) przez 30 minut w temperaturze 30 stopni C. Obserwowano pojawienie

sięgrup karbonylowych w cząsteczkach albuminy w następstwie wolnorodnikowego uszkodzenia tego białka.

Po dodaniu 2OH estradiolu i 4OH estradiolu obserwowano znaczącą protekcjęjuż w niskim 2,5 M stężeniu ka-

techoli estrogenów. Estradiol użyty w stężeniu 4-krotnie wyższym pozostawał bez wpływu na wolnorodnikową

destrukcjęalbuminy. W świetle uzyskanych wyników wydaje sięprawdopodobny mechanizm protekcyjnego

wpływu katecholi estrogenów, przeciwdziałający wolnorodnikowemu uszkodzeniu białek osocza krwi w warun-

kach stresu oksydacyjnego.

P10-75

POWSTAWANIE TLENU SINGLETOWEGO W PROCESIE DYSPROPORCJONACJI KWASU

NADOCTOWEGO – FIZJOLOGICZNEGO METABOLITU ETANOLU

Jerzy Nacel

, Kamil Jankowski

, Jerzy Szymandera

, Michał Woźniak

A: Katedra i Zakład Chemii Ogólnej AM w Gdańsku

B: I Klinika Chirurgii AM w Gdańsku

Badania ostatnich lat wskazują na możliwość konwersji kwasu octowego do nadkwasu w reakcji z H

. Fizjolo-

giczne stężenie kwasu octowego równe 0,1 mM ulega dziesięciokrotnemu zwiększeniu po spożyciu etanolu i

może w związku z tym dostarczać substratu do konwersji w nadoctan. Celem przeprowadzonych eksperymen-

tów było zbadanie możliwości dysproporcjonacji cząsteczek kwasu octowego do wyjściowej cząsteczki kwasu

octowego i tlenu singletowego w fizjologicznym pH. W detekcji tlenu singletowego użyto pomiar znacznikiem

fluorescencji DPBF w obecności nadoctanu i swoistych zmiataczy tlenu singletowego. Uzyskane wyniki potwier-

dziły pojawianie sięznaczącej ilości tlenu singletowego z nadoctanu w pH 7,4. Obniżenie pH poniżej 7,0

znacząco zmniejszało zmiany fluorescencji DPBF a zastosowanie D2O przyśpieszyło zanik DPBF. Swoiste „zmiata-

cze” tlenu singletowego, histydyna oraz alfa-terpinen ograniczały zmiany intensywności fluorescencji DPBF

wywołane nadoctanem. Badania potwierdziły możliwość peroksydacyjnego wpływu metabolitów etanolu po-

przez generowanie tlenu singletowego w układach biologicznych.

P10-76

WPŁYW SYNTETYCZNYCH PRZECIWUTLENIACZY NA PEROKSYDACJĘ LIPIDÓW

W CZĄSTKACH SUBMITOCHONDRIALNYCH ŁOŻYSKA LUDZKIEGO

Dorota Budźko, Beata Kalińska-Błach, Dorota Kulawiak-Gałąska, Michał Woźniak

Katedra i Zakład Chemii Ogólnej, AM w Gdańsku

Rzucawka porodowa jest schorzeniem o nieznanej etiologii rozwijającym sięw dwudziestym tygodniu ciąży. Pro-

teinuria charakterystyczna dla tego schorzenia jest objawem wskazującym na uszkodzenie struktury i funkcji ba-

riery błon biologicznych. Niedobór łożyskowej peroksydazy glutationu w rzucawce wydaje sięmieć związek z

278

SESJA 10 PLAKATY

nadmierną akumulacją wodoronadtlenków w tej tkance. Peroksydaza glutationu 4-a jest enzymem związanym z

wewnętrzną błoną mitochondrialną. Syntetyczne aminooksyle z grupy tetrametylo-piperydyno-N-tlenków na-

leżą do drobnocząsteczkowych przeciwutleniaczy wykazujących zdolność do neutralizacji cząsteczek anionorod-

nika ponadtlenkowego jak i rodników, w których niesparowany elektron zlokalizowany jest na atomie węgla. W

przeprowadzonych eksperymentach zbadano wpływ różnych acylowych pochodnych TEMPOL na procesy perok-

sydacji lipidów inicjowane wodoronadtlenkiem kumenu generującym rodniki lipidowe w błonach cząstek submi-

tochondrialnych dzięki obecności cytochromu p-450 SCC. Stwierdzono, że syntetyczne aminooksyle hamują pro-

ces peroksydacji w SMP. Najbardziej efektywnie działa pochodna oktanylowa, podczas gdy pochodna palmito-

ilowa wykazuje znacznie zredukowaną efektywność. Widma EPR aminooksyli w SMP wskazują na efektywną pe-

netracjęoktanylo-TEMPO do błon i względną swobodęrotacji, podczas gdy palmitoilowa pochodna po wbudo-

waniu do błon ulega znacznej immobilizacji. Uzyskane wyniki pozwalają przypuszczać, że zmiana struktury ami-

nooksyli prowadząca do możliwości „kotwiczenia” w błonie zwiększa efektywność działania przeciwutleniacza.

Wydłużenie łańcucha acylowego do 16 węgli powoduje znaczącą immobilizację, co wyraźnie ogranicza efektyw-

ność przeciwutleniacza.

P10-77

CYTOTOKSYCZNE EFEKTY WODORONADTLENKÓW W KOMÓRKACH NEUROBLASTOMA

SN-56. OCHRONNY WPŁYW 4-OH-TETRAMETYLOPIPERYDYNO-N-TLENKU(4-OH-T)

Piotr Rozwadowski, Justyna Gołębiewska, Anna Sasin, Michał Woźniak

Katedra i Zakład Chemii Ogólnej, AM w Gdańsku

Stres oxydacyjny jest stanem nierównowagi pomiędzy generowanymi reaktywnymi formami tlenu (RFT) a niedo-

stateczną ochroną wywieraną przez obecne w komórkach przeciwutleniacze. N-tlenki piperydyny wykazują ak-

tywność neutralizacji reaktywnych form tlenu, anionorodnika ponadtlenkowego, H

i rodników organicznych,

w których niesparowany elektron zlokalizowany jest na atomie węgla. Wykazują działanie naśladujące dysmuta-

zęponadtlenkową, posiadają zdolność do przechodzenia przez bariery błon komórkowych w przeciwieństwie

do wielkocząsteczkowych enzymów. Wodoronadtlenek butylu (ButOOH) wykazuje efekty prooksydacyjne w

układach komórkowych inicjując reakcjęwolnorodnikowej destrukcji lipidów i białek błonowych. W izolowanych

hepatocytach związek ten inicjując stres oksydacyjny, powoduje utlenienie białek tzw. ‘megakanału’, otwarcie

tego kanału, uwolnienie cytochromu c i w konsekwencji proces apoptozy. Powstaje pytanie czy 4-OH-T, przeciw-

działający apoptozie komórek wątrobowych RL-34 eksponowanych na działanie H

nie będzie również prze-

ciwdziałał efektom stresu oksydacyjnego wywieranego przez ButOOH (syntetyczny, penetrujący błony komórko-

we wodoronadtlenek) w komórkach neuroblastoma SN-56. Komórki neuroblastoma SN-56 eksponowane przez

24 godziny na działanie 100 M ButOOH wykazywały zmiany morfologiczne charakterystyczne dla procesu apo-

ptozy. Zaobserwowano wzrost poziomu produktów peroksydacji lipidów po inkubacji komórek z wodoronad-

tlenkiem. Obecność 1mM 4-OH-T powodowała zahamowanie powyższych efektów wodoronadtlenku. W świetle

otrzymanych wyników wydaje siębyć prawdopodobnym mechanizm wolnorodnikowy działania ButOOH na ko-

mórki neuroblastoma SN-56.

P10-78

PEROXIDATIVE ACTIVITY OF DIFFERENT HEMOPROTEINS IN RELATION TO THEIR STABILITY

IN THE PRESENCE OF CUMENE HYDROPEROXIDE

Halina Zajworoniuk

, Wiesława Mickiewicz

, Dorota Budźko

, Beata Kalińska-Błach

, Donatella Fedeli

Giancarlo Falcioni

, Michał Woźniak

A: Katedra i Zakład Chemii Ogólnej, Akademia Medyczna w Gdańsku

B: Instytut Biologii Molekularnej, Uniwersytet w Camerino (Włochy)

Microperoxidases (MP) are able to catalyse peroxidase like and cytochrome p-450 like reactions due to the lack of

specific substrate binding cite. The same kinetic characteristic can be observed with hemoglobins. Major draw-

back for applicability of MP is their limited stability. It has been found that higher stability can be achieved when

attached peptide is longer. Bearing above in mind it is reasonable to anticipate some variable „private” features

of peroxidase activity and stability conferred by individual protein microenvironments displayed by different

protoporphyrin IX bearing carrier starting from peptide to monomeric and multimeric protein. It was therefore

of interest to compare different peroxidative activity of microperoxidase, cytochrome p-450 SCC and some dif-

ferent hemoglobins. Cyotchrome p-450 SCC has been found to stimulate TBAR-s formation in human term pla-

ODPOWIEDŹ ORGANIZMÓW NA CZYNNIKI BIOTYCZNE I ABIOTYCZNE

279

cental mitochondria in the presence of cumene hydroperoxide (CumOOH). Two different trout Hb-s (HbI and

HbIV) are different being no sensitive for Bohr effect over pH range 5–9 for former HbI and displaying strong pH

dependence of cooperativity and autooxidazibity. In the presence of lipid model membrane and CumOOH capa-

bility to act as peroxidase has been found to be greater in cytochrome p-450 SCC at 0,01mikroM concentration.

HbIV has been found to be most efficient compared to HbI, Hb A and MP. The value of tetramer-dimer dissocia-

tion constant has been found to be 50 times less than human Hb A. About 60% of cytochrome p-450 SCC has

been found to be destroyed after 30 sec. of exposition on CumOOH. In conclusion tertiary and quaternary struc-

ture of catalyst seems to be of great importance in their peroxidase efficiency.

P10-79

EFEKT ANTYOKSYDACYJNY SYNTETYCZNYCH AMINOOKSYLI TEMPO I TEMPOL NA STRES

OKSYDACYJNY WYWOŁANY PRZEWLEKŁĄ ESTROGENIZACJĄ

T. Stefaniak

, J. Krajewski

, Ł. Kaska

, W. Makarewicz

, A. Stanek

, J. Głowacki

, Z. Gruca

, Z. Wypych

M. Woźniak

A: II Klinika Chirurgii Ogólnej, Gastroenterologiczej i Endokrynologiczej

B: Katedra i Zakład Chemii Ogólnej AM w Gdańsku

Przewlekła ekspozycja na estradiol wywołuje u samca chomika syryjskiego nowotwór nerki charakteryzujący się

zależnością od estrogenów jako czynnika indukującego i podtrzymującego rozwój. Wzrost poziomu reszt karbo-

nylowych białek wywołany peroksydacją obserwowany był w czasie trwającego 12 miesięcy eksperymentu opisy-

wanego przez nas uprzednio. Znamienny statystycznie wzrost stężenia reszt karbonylowych stwierdzono już po

1 miesiącu trwania estrogenizacji. Celem pracy było przeanalizowanie wpływu syntetycznych aminooksyli jako

reduktorów wolnych rodników tlenowych w modelu eksperymentalnej nefrokarcinogenezy samca chomika sy-

ryjskiego. 60 samców chomika syryjskiego podzielono na trzy grupy: 20 zwierząt stanowiło grupębadaną. Otrzy-

mały one jednorazową implantację25 mg estradiolu podskórnie, a następnie codziennie otrzymywały 70 mg/kg

m.c. dootrzewnowo: grupa I (n=10) – TEMPO oraz grupa II (n=10) – 4-OH TEMPO; 20 zwierząt stanowiło kontro-

lęz TEMPO i TEMPOL, zaś 20 kolejnych kontrolęz estradiolem oraz bez oddziaływania żadnych substancji. Po 1

miesiącu eksperymentu zwierzęta poddano autopsji. Do badań biochemicznych pobrano nerki zwierząt, ocenio-

no także masętych narządów oraz masy całkowite zwierząt. Stwierdzono statystycznie znamienne obniżenie po-

ziomu reszt karbonylowych i wzrost poziomu reszt sulfhydrylowych w wyniki oddziaływania aminooksyli na ba-

dany model. Efekt oddziaływania TEMPO był silniejszy od 4-OH TEMPO. Podawanie TEMPO przez 1 miesiąc umo-

żliwiło zmniejszenie stresu oksydacyjnego do poziomu obserwowanego w grupie kontrolnej.

P10-80

INDOLINOLIC AND GUINOLINIC AMINOXYLS AS MOLECULAR TOOL FOR EVALUATION OF

PEROXIDASE ACTIVITY OF METMYOGLOBIN

Wiesława Mickiewicz

, Halina Zajworoniuk

, Zbigniew Heleniak

, Jerzy Nowak

, Giancarlo Falcioni

Lucedio Greci

, Michał Woźniak

A: Katedra i Zakład Chemii Ogólnej AM w Gdańsku

B: Katedra i Zakład Biofizyki AM w Gdańsku

C: Dipartimento di Biologia molecolare cellulare animale, Universita degli studi di Camerino-Italy

D: Dipartimento di Scienze dei Materiali e della Terra, Universita di Ancona-Italy

Myocytes expressing high requirement for energy utilise myoglobin as molecular reservoir for oxygen providing ad-

equate amount of it for efficient conversion of chemical energy of oxidizable substrates to mechanical work via

ATP. On the other hand as a part of mechanism of myocardial ischemic insult oxidative damage to myocytes medi-

ated by myoglobin has been observed. Under ischemic conditions myoglobin could be oxidised to ferrylmyoglobin

by peroxides other than H

i.e. by lipid hydroperoxides. It has been shown that HPETE/ arachinonic acid

hydroperoxide can oxidise virtually all myoglobin in isolated cardiomyocytes. Cumyl hydroperoxide (CumOOH) can

substitute for natural lipid hydroperoxide in peroxidative reaction of hemoproteins. In this investigation we utilised

ESR spectroscopy using aromatic aminoxyls namely:1,2-dihydro-2,2-diphenyl-4-ethoxy-quinoliny-1-oxyl (QAL),

1,1-dihydro-2-ethyol-2-phenyl-3H-indol-3-phenyl-amino-1-oxyl (IAL) to investigate the kinetics of peroxidative ac-

tivity of metmyoglobin in the presence of CumOOH. Binding of QAL and IAL into metmyoglobin changed the ESR

spectrum of aminoxyls. Addition of CumOOH resulted in time and concentration dependent experimental decay of

280

SESJA 10 PLAKATY

ESR picks signal. In conclusion aromatic aminoxyls can be used as a good tool to investigate peroxidative activity of

hemoproteins during oxidative stress.

ODPOWIEDŹ ORGANIZMÓW NA CZYNNIKI BIOTYCZNE I ABIOTYCZNE

281

Wyszukiwarka

Podobne podstrony:

więcej podobnych podstron