Wydzia  Chemiczny Politechniki Gda!skiej 

Katedra Technologii Leków i Biochemii 

 

Kultury tkankowe i komórkowe ro"lin i zwierz#t 

 

IZOLACJA DNA Z KOMÓREK ZWIERZ$CYCH 

 

Wst%p 

 

Izolacja  i  oczyszczanie  DNA  jest  kluczowym  etapem  wi kszo!ci 

procedur  stosowanych  w  biologii  molekularnej,  diagnostyce  i  innych 
badaniach.  G"ównym  celem  tego  etapu  jest  uzyskanie  wysokiej  jako!ci  i 
czysto!ci  materia"u  biologicznego,  niezale#nie  od  $ród"a  jego  pochodzenia. 
Aktualnie  dysponujemy  bardzo  zró#nicowanymi  i  licznymi  metodami 
otrzymywania 

kwasów 

nukleinowych, 

od 

z"o#onych, 

wieloetapowych 

procedur,  wykorzystuj %cych  rozpuszczalniki  organiczne  do  szybszych, 
prostszych  i  bezpieczniejszych.  Wybór  odpowiedniej  metody  izolacji  zale#y 
od  rodzaju  badanego  kwasu  nukleinowego  jaki  chcemy  uzyska&  (DNA 
genomowe,  mitochondrialne,  plazmidowe,  RNA  itd.),  pochodzenia  (ro!linne, 
zwierz ce, 

bakteryjne, 

wirusowe 

itd.), 

rodzaju 

materia"u 

z 

jakiego 

przeprowadzamy  izolacj   (z  tkanek,  organu,  hodowli  komórkowej  itd.), 
oczekiwanych  rezultatów  (czysto!&,  jako!&,  czas  izolacji  itd.)  i  przeznaczenia 
(PCR, klonowanie, blotting, synteza cDNA itd.).  

Ogólne zasady izolacji DNA 

 

Znanych  jest  wiele  procedur  izolacji  DNA,  w  wyniku  których  otrzymuje 

si   DNA  biologicznie  aktywny,  chemicznie  stabilny  oraz  wolny  od  RNA  i 
bia"ek. Jednak#e ze wzgl du na wielko!& i wra#liwo!& chromosomalnego DNA 
praktycznie  niemo#liwa  jest  jego  izolacja  w  formie  niezmienionej.  Cz !& 
DNA ulega mechanicznym uszkodzeniom. 

Opracowanie  procedury  izolacji  DNA  wymaga  szerokiej  wiedzy  na  temat  jego 

chemicznej  stabilno!ci  i  warunków  w  jakich  znajduje  si   w  swoim  naturalnym  !rodowisku 
(komórka).  Czynniki  eksperymentalne,  które  musz%  by&  wzi te  pod  uwag   i  ich  wp"yw  na 
ró#ne aspekty strukturalne natywnego DNA s% zestawione w tabeli 1. 

 

Tabela. 1 Parametry warunkuj%ce zachowanie natywnej struktury DNA podczas izolacji 

Lp. 

Czynniki 

Wp yw na struktur% DNA 

1.  pH 

 !wi%zania  wodorowe  pomi dzy  komplementarnymi 

"a'cuchami s% stabilne w !rodowisku o pH = 4 ÷ 10, 

 !wi%zania  fosfodiestrowe  w  szkielecie  DNA  s%  trwa"e  w 

zakresie pH = 3 ÷ 12, 

 !wi%zania  N-glikozydowe  z  zasadami  purynowymi 

(adenin% i guanin%) ulegaj% hydrolizie przy pH < 3; 

2.  temperatura 

 !istniej%  znaczne  ró#nice  w  stabilno!ci  termicznej 

wi%za' 

wodorowych 

w 

podwój nej 

spirali, 

ale 

wi kszo!&  DNA  ulega  rozpleceniu  w  temperaturze  80 ÷ 

 

1 

Lp. 

Czynniki 

Wp yw na struktur% DNA 

90 °C, 

 !wi%zania  N-glikozydowe  i  fosfodiestrowe  s%  trwa"e  do 

100 °C; 

3.  si"a jonowa 

 !DNA  jest  bardziej  trwa"y  i  rozpuszczalny  w 

roztworach  soli;  w  st #eniu  soli  mniejszym  ni#  0,1  M 
os"abiaj% 

si  

wi%zania 

wodorowe 

pomi dzy 

komplementarnymi "a'cuchami; 

4.  warunki 

komórkowe 

 !przed uwolnieniem DNA konieczne jest rozbicie !ciany 

komórkowej  (komórki  grzybowe,  bakteryjne  i  in.)  i 
liza  b"on  komórkowych  (komórki  zwierz ce  i  in.); 
"atwo!&  rozbicia  !ciany  zale#y  od  rodzaju  organizmu, 
w  niektórych  przypadkach  konieczne  jest  intensywne 
ucieranie  lub  dzia"anie  ultrad$wi kami  (komórki 
dro#d#y,  tytoniu),  podczas  gdy  w  innych  (E.  coli) 
mo#liwa 

jest 

enzymatyczna 

hydroliza 

!ciany 

komórkowej, 

 !w 

komórce 

wyst puje 

kilka 

enzymów, 

które 

hydrolizuj% 

DNA; 

najistotniejszymi 

z 

nich 

s% 

deoksyrybonukleazy, 

które 

hydrolizuj% 

wi%zania 

fosfodiestrowe, 

 !natywny  DNA  wyst puje  w  komórkach  w  kompleksie  z 

bia"kami  (histony,  helikazy,  polimerazy  i  in.);  bia"ka 
te musz% by& oddzielone podczas ekstrakcji; 

5.  odporno!&  

mechaniczna 
DNA 

 !"agodne  manipulowanie  nie  zawsze  jest  mo#liwe 

podczas 

izolacji 

DNA; 

ucieranie, 

wytrz%sanie, 

mieszanie 

i 

inne 

czynno!ci 

mechaniczne 

mog% 

spowodowa& 

rozszczepienie 

DNA, 

zwykle 

nie 

powoduje  to  zniszczenia  drugorz dowej  struktury 
DNA, ale zmniejsza d"ugo!& cz%steczki (fragmentacja). 

Etapy izolacji DNA 

Niezale#nie  od  zastosowanej  procedury  wi kszo!&  metod  opiera  si   na 

kilku podstawowych i niezmiennych etapach izolacji. 

Tabela. 2 Etapy izolacji DNA 

Lp. 

Etap 

Cel etapu i jego przeprowadzenie 

1.  wst pne przygotowanie 

materia"u biologicznego 
do izolacji DNA 

 !oczyszczenie,  homogenizacja,  zawieszenie  w 

buforze 
Materia"em  wyj!ciowym  do  izolacji  DNA  mo#e 
by&  niemal  ka#dy  materia"  biologiczny  (tkanka, 
organ, 

zawiesina 

komórkowa 

i 

in.). 

W 

zale#no!ci  od  rodzaju,  jak  i  pochodzenia 
materia"u, 

wst pne 

przygotowanie 

mo#e 

obejmowa&  oczyszczenie  z  ró#nego  rodzaju 
zanieczyszcze' 

zewn trznych, 

po#ywki 

i 

pozosta"o!ci 

innych 

komórek 

(przemywanie 

buforami 

stabilizuj%cymi), 

rozdrobnienie 

i 

homogenizacj , 

a 

nast pnie 

zawieszanie 

 

2 

Lp. 

Etap 

Cel etapu i jego przeprowadzenie 

jednolitej  masy  komórkowej  w  odpowiednim 
buforze. 

2.  dezintegracja  

i liza komórek 

 !rozbicie !ciany i b"ony komórkowej 

Dezintegracj  

komórek 

prowadzi 

si  

w 

zale#no!ci  od  rodzaju  komórek  i  tkanek,  np. 
poprzez 

homogenizacj  

(mi kkie 

tkanki 

zwierz ce),  sonifikacj   (zawiesiny  komórek), 
rozcieranie  (komórki  ro!linne,  bakteryjne),  liz  
detergentami  (komórki  z  hodowli  komórkowej), 
liz  

enzymatyczn% 

(komórki 

bakteryjne, 

dro#d#owe) i in.  

 !uwolnienie 

DNA 

i 

innych 

komponentów 

wewn%trzkomórkowych do roztworu  
Destrukcji 

b"on 

zewn trznych 

towarzyszy 

uwolnienie  DNA  oraz  innych  komponentów 
wewn%trzkomórkowych.  St%d  bardzo  istotne  jest 
zachowanie  odpowiednich  warunków,  aby  kwas 
nukleinowy nie uleg" uszkodzeniom.  
Do  rozpuszczenia  DNA  i  lizy  komórek  s"u#y 
roztwór  soli,  najcz !ciej  NaCl,  zawieraj%cy  Tris 
i  EDTA.  DNA  b d%c  zwi%zkiem  jonowym  jest 
bardziej  stabilny  i  rozpuszczalny  w  roztworze 
soli  ni#  w  wodzie  destylowanej.  Tris  ma  za 
zadanie  utrzyma&  sta"e  pH  roztworu  (lekko 
zasadowe).  EDTA  wi%#e  jony  metali  Cd

2 +

,  Mg

2 +

, 

Mn

2 +

,  które  mog"yby  tworzy&  sole  z  anionowymi 

grupami  fosforanowymi  DNA  oraz  hamuje 
dzia"anie  deoksyrybonukleaz,  które  wymagaj% 
dla swojej aktywno!ci obecno!ci jonów Mg

2 +

 lub 

Mn

2 +

. 

3.  inaktywacja nukleaz 

komórkowych  

 !zabezpieczenie 

DNA 

przed 

enzymami  

nukleolitycznymi 
Uwalniaj%cy  si   z  komórki  kwas  nukleinowy  jest 
nara#ony  na  dzia"anie  degraduj%ce  nukleaz  – 
enzymów  katalizuj%cych  hydroliz   1-  i  2-
niciowych  kwasów  nukleinowych  (endo-,  egzo-, 
detoksy-,  rybonukleazy  i  in.),  przecinaj%cych 
wi%zania  fosfodiestrowe.  Unieczynnienie  ich 
prowadzi 

si  

silnymi 

enzymami  

proteolitycznymi (np. proteinaz% K lub pronaz%). 

4.  oddzielenie kwasu  

nukleinowego od  
pozosta"ych 
komponentów 
komórkowych 

 !dysocjacja kompleksów DNA-bia"ko 

Celem  zniesienia  oddzia"ywa'  jonowych  pomi dzy 
na"adowanymi  dodatnio  histonami  i  innymi  bia"kami  a 
ujemnie  na"adowanym  szkieletem  DNA  stosuje  si  
ró#nego rodzaju detergenty oraz sole. Z czego sól sodowa 
siarczanu dodecylu (SDS) wi%#e si  z bia"kami i nadaje im 
silnie  anionowy  charakter,  a  tak#e  dzia"a  jako  czynnik 
denaturuj%cy  deoksyrybonukleazy  i  inne  bia"ka. (agodnie 
alkaliczne 

!rodowisko 

(pH 

= 

8,0) 

zmniejsza 

 

3 

Lp. 

Etap 

Cel etapu i jego przeprowadzenie 

oddzia"ywania 

elektrostatyczne 

pomi dzy 

DNA 

a 

zasadowymi  histonami  i  polikationowymi  aminami, 
przyczynia si  tak#e do zmniejszenia aktywno!ci nukleaz i 
denaturacji innych bia"ek. Za! sole w wysokich st #eniach 
(NaCl,  NaClO

4

  lub  inn%  sól)  zapewniaj%  ca"kowit% 

dysocjacj  

kompleksów 

DNA-bia"ko  

i usuwaj% zwi%zane kationowe poliaminy; 

 !oddzielenie  DNA  od  innych  rozpuszczalnych 

komponentów komórkowych  
Ca"kowite 

odbia"czanie 

roztworu, 

przed 

wytr%ceniem  DNA,  przeprowadza  si   poprzez 
ekstrakcj   rozpuszczalnikami  organicznymi,  np. 
dzia"aniem 

mieszanin% 

fenolu 

(powoduje 

denaturacj   bia"ek),  chloroformu  (powoduje 
powierzchniow%  denaturacj   bia"ek  i  stabilizuje 
granic   fazow%,  gdzie  koncentruje  si   bia"ko)  i 
alkoholu  izoamylowego  (zapobiega  parowaniu 
chloroformu), a nast pnie odwirowanie. 

5.  zag szczenie 

preparatu DNA i 
usuni cie  
zanieczyszcze'  
ma"ocz%steczkowych 

 !uzyskanie roztworu DNA o po#%danej czysto!ci i 

g sto!ci 
Po  ekstrakcji  kwasy  nukleinowe  znajduj%  si , 
przewa#nie  w  du#ym  rozcie'czeniu,  w  fazie 
wodnej,  zanieczyszczonej  ma"ocz%steczkowymi 
zwi%zkami.  Dodaj%c  rozpuszczalnik  organiczny 
(np.  etanol  lub  izopropanol)  zmniejsza  si  
polarno!& 

!rodowiska, 

co 

powoduje 

zmniejszenie 

rozpuszczalno!ci 

DNA, 

posiadaj%cego  struktur   jonow%  i  DNA  tworzy 
nitkowate  osady,  które  mo#na  zebra&  poprzez 
odwirowanie. 

RNA 

w 

obecno!ci 

alkoholu 

etylowego    zwykle  nie  str%ca  si   tak  jak  DNA  i 
wyst puje  jedynie  jako  drobne  zanieczyszczenie, 
za!  przy  precypitacji    izopropanolem  pozostaje 
w  roztworze.  Efektywno!&  wytr%cania  kwasów 
nukleinowych  zwi ksza  si   poprzez  dodatek  soli 
(np. 

NaCl, 

CH

3

COOH, 

LiCl, 

MgCl, 

czy 

CH

3

COONH

4

). 

 !Po  wytr%ceniu  i  przemyciu  70  %  etanolem,  DNA 

pozostawia  si   do  wyschni cia  i  nast pnie 
zawiesza  w  ma"ej  obj to!ci  buforu  o  niskiej  sile 
jonowej (np. bufor TE) lub w wodzie. 

Materia y i sprz%t 

1.  Komórki nowotworowe pochodzenia ludzkiego linii HCT-8 (komórki raka  

jelita grubego), MOLT4 (komórki bia"aczki) lub innego typu   

[5 

mln] 

2.  Bufor lizuj%cy, stosowany podczas izolacji ca"kowitego DNA 

komórkowego  

 

4 

(10 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA, 0,5 % SDS; pH 7,4)  [1 
mln] 

3.  Bufor TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA; pH 8,0)  

 

 

[120 

µl] 

4.  Mieszanina chloroform-alkohol izoamylowy (24:1)  

 

 

  [1,2 mln] 

5.  Roztwór alkoholu etylowego (70 %)   

 

 

 

 

[1 

ml] 

6.  Roztwór alkoholu etylowego (96 %)   

 

 

 

 

[1 

ml] 

7.  Roztwór buforowany PBS (0,14 M NaCl, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH

2

PO

4

, 

8,1 mM Na

2

HPO

4

; pH 7,2) 

 

 

 

 

 

 

[10 

mln] 

8.  Roztwór NaCl (5 M);  

 

 

 

 

 

 

 

[50 

µl] 

9.  Roztwór RNazyA (1 mg/ml)  

 

 

 

 

 

 

[25 

µl] 

10. Roztwór wodny proteinazy K (1 mg/ml) 

 

 

 

 

[120 

µl] 

 
1.  Probówka wirówkowa 50 ml z korkiem 

 

 

 

 

[l] 

2.  Probówki typu Eppendorf 1,5 ml 

 

 

 

 

 

[6] 

3.  Pipety automatyczne; 5 ml, 1 ml, 0,1 ml, 0,02 ml   

 

 

 

4.  Tipsy do pipet automatycznych 
5.  Wytrz%sarka typu wortex   

 

 

 

 

 

 

6.  SpeedVac, model 5301 firmy Eppendorf, Niemcy   

 

 

 

7.  Wirówka, typ 5417 R firmy Eppendorf, Niemcy 
8.  (a$nia wodna lub termoblok 

Wykonanie &wiczenia 

Praca w grupach 3 – 4-osobowych 
Czas trwania &wiczenia: 3 godziny 

 !Osad  komórek  nowotworowych  w  ilo!ci  5  milionów,  uwolniony  od 

po#ywki 

i  

2-krotnie  przemyty  buforem  PBS,  zawiesi&  w  100  µl  sterylnego 
roztworu  TE  i  przenie!&  powsta"%  zawiesin   do  2  probówek  eppendorfa 
o obj to!ci 1,5 ml; 

 !Do  ka#dej  próbówki  doda&  po  0,5  ml  buforu  lizuj%cego  oraz  12   l 

roztworu  RNazy  A  o  st #eniu  1  mg/ml,  a  nast pnie  inkubowa&  przez  1 
godzin  w 37 !C; 

 !Do  lizatu  doda&  60   l  roztworu  proteinazy  K  o  st #eniu  1  mg/ml  i 

równie# inkubowa& co najmniej przez 1 godzin  w 50 !C; 

 !Po  inkubacji  roztwór  rozcie'czy&  wod%  do  600  µl  i  doda&  równ% 

obj to!&  mieszaniny  chloroform-alkohol  izoamylowy  (600  µl)  i  ca"o!& 
miesza& 

a# 

do 

powstania 

emulsji  

(5  minut  na  worteksie).  Uzyskan%  mieszanin   rozdzieli&  przez 
wirowanie  
(14000 RPM/25 !C/10 min); 

 

5 

 !Faz   wodn%  (500  µl)  przenie!&  do  nowej  probówki  i  doda&  równ% 

obj to!& 

mieszaniny 

chloroform-alkohol 

izoamylowy, 

5 

minut 

wytrz%sa& i wirowa& jw.; 

 !Do  uzyskanej  fazy  wodnej  (400  µl)  doda&  roztworu  NaCl,  do  st #enia 

ko'cowego  
0,3  M  (24  µl),  dwie  obj to!ci  zimnego  96  %  EtOH  (900  µl)  i  prowadzi& 
wytr%canie  poprzez  kilkukrotne  obrócenie  probówki  do  momentu 
pojawienia si  nitek DNA; 

 !Wytr%cony  DNA  zwirowa&  (14000  RPM/4  !C/10  min).  Supernatant 

odrzuci& i osad przep"uka& 1 ml 70 % EtOH i powtórzy& wirowanie; 

 !Tak  uzyskany  osad  osuszy&  za  pomoc%  SpeedVac  w  30  !C  przez  5 

minut,  a  nast pnie  zawiesi&  w  10   l  buforu  TE,  wymiesza&,  pozostawi& 
w  lodówce  do  nast pnego  dnia  i  po"%czy&  oba  roztwory  wyizolowanego 
DNA. Probówk  z roztworem DNA przechowywa& w zamra#alniku. 

Opracowanie wyników 

1)  Zapisa&  wszystkie  obserwacje  dotycz%ce  procedury  oczyszczania. 

Wyja!ni&  jakiego  rodzaju  b" dy  mog"y  zosta&  pope"nione  i  jakiego  typu 
zanieczyszcze' preparatu DNA mo#na si   spodziewa&. 

2)  Zaproponowa&  inne  metody  izol acji  DNA  z  uwzgl dnieniem  rodzaju 

materia"u biologicznego i omówieniem zasady izolacji. 

Literatura uzupe niaj#ca 

[1] Brown T. A.:  Genomy, Warszawa: PWN 2001; 

[2] Bryszewska  M.,  Leyko  W.:  Biofizyka  kwasów  nukleinowych  dla  biologów, 

Warszawa: PWN 2000; 

[3] K"yszejko-Stefanowicz L.:  wiczenia z biochemii, Warszawa: PWN 1999; 

[4] Stryer L.: Biochemia, Warszawa: PWN 2000. 

 

 

6