Microsoft Word - Immunodiagnostyka WL IV semestr zimowy 2011-2012.doc

Ćwiczenie 1

Układ odporności. Odporność humoralna.

METODY JAKOŚCIOWE OCENY REAKCJI ANTYGEN-PRZECIWCIAŁO.

Zagadnienia:

antygeny, hapteny, antygenowość, immunogenność, epitop, powinowactwo, awidność,
przeciwciała,  monoklonalność,  poliklonalność,  monowalentność,  poliwalentność,
precypitacja,  krzywa  precypitacji,  obszar  ekwiwalentny,  warunki  reakcji  precypitacji,
metody oparte o zjawisko precypitacji, immunoelektroforezy, immunofiksacja, złożone
techniki  serologiczne,  immunoblotting,  immunoprecypitacja,  aglutynacja,  warunki
reakcji aglutynacji, metody oparte o zjawisko aglutynacji

Metody oparte o zjawisko precypitacji:
−

podwójna dyfuzja w agarze (PDA) - metoda Outcherlony’ego, immunodyfuzja.

Do wyciętych w żelu agarozowym studzienek nanosi się badane surowice i roztwory
przeciwciał, które dyfundują w nośniku. W miejscu spotkania obu składników
badanego układu tworzą się łuki precypitacyjne.

−

immunoelektroforeza prosta (IM-EL) – metoda umożliwia ocenę białek zawartych

w surowicy, łączy elektroforezę i immunodyfuzję.

W  pierwszym  etapie  mieszaninę  białek  zawartą  w  surowicy,  umieszczoną  w  żelu
agarozowym  rozdziela  się  przy  pomocy  prądu  elektrycznego.  Następnie  wycina  się
w żelu  równoległy  do  kierunku  migracji  białek  rowek,  który  wypełnia  się
odpowiednimi przeciwciałami. Dyfundujące w żelu składniki układu (badane białka
i przeciwciała)  tworzą  łuki  precypitacyjne  o  charakterystycznym  kształcie
i wielkości.

Złożone techniki serologiczne:
−

immunoblotting

Poszukiwane  przeciwciała  zawarte  w  badanych  surowicach  wykrywane  są  przy
pomocy  immobilizowanych  w  nitrocelulozie  białek  antygenu.  W  skład  systemu
detekcyjnego  wchodzi  także  antyglobulinowy  koniugat  wyznakowany  enzymem
(np.  peroksydaza  chrzanowa  lub  alkaliczna  fosfataza).  Dodanie  substratu  dla
odpowiedniego enzymu powoduje powstanie nierozpuszczalnego w wodzie produktu
widocznego jako barwny prążek na nitrocelulozie.

Preparatyka:

Podwójna dyfuzja w agarze (PDA)

Sprzęt i odczynniki:

−

wypoziomowany stolik

−

odtłuszczone w alkoholu płytki szklane 6 × 9 cm lub szkiełka podstawowe

−

metalowa sztanca do PDA

−

pipeta szklana 10 – 25 ml

−

mikropipeta regulowana 10 – 200 µl

−

1 % agar lub agaroza w soli zbuforowanej pH 7,6 (PBS)

−

łaźnia wodna lub kuchenka mikrofalowa

−

wilgotna komora

−

próbki badanych antygenów i odpowiednie surowice odpornościowe (zwierzęce)

Materiał badany:

surowica pacjenta lub inny roztwór białka do analizy (min. ilość 50

µl, opt. ~ 1 ml)

Zasada metody:

Podczas  24 h  inkubacji  w  komorze  wilgotnej  dochodzi  do  swobodnej  dyfuzji  białek
próbki  badanej  i  zastosowanych  do  identyfikacji  przeciwciał  zwierzęcych.  W miejscu
zetknięcia  się  obu  składników  układu  dochodzi  do  powstania  kompleksów
immunologicznych,  a  następnie  (w  strefie  ekwiwalencji,  tzn.  równowagi  stężeń
Ag-Ab) wytrącenia się precypitatu, który można analizować wizualnie

Wykonanie

−

gorący agar wylać przy pomocy ogrzanej pipety na płytkę szklaną do uzyskania

warstwy grubości ok. 1 mm,

−

po zastygnięciu wyciąć studzienki w żelu przy pomocy sztancy,

−

napełnić przeciwstawne studzienki roztworami antygenu i odpowiednio dobranych

surowic odpornościowych lub seryjnymi rozcieńczeniami tej samej surowicy
odpornościowej,

−

umieścić płytkę w komorze wilgotnej w temperaturze pokojowej na 24 lub 48 h.

Ocena i interpretacja wyników:

PDA jest techniką jakościową; powstanie łuku precypitacyjnego świadczy o obecności
poszukiwanego białka w próbce badanej; stosując podwójne rozcieńczenia
analizowanej surowicy odpornościowej można określić jej miano (tzn. największe
rozcieńczenie , przy którym tworzy się prążek precypitatu).

Immunoelektroforeza prosta (IM-EL)

Sprzęt i odczynniki:

−

wypoziomowany stolik

−

odtłuszczone w alkoholu płytki szklane 6 × 9 cm lub szkiełka podstawowe

−

metalowa sztanca do IM-EL

−

pipeta szklana 10 – 25 ml

−

mikropipeta regulowana 10 – 200 µl

−

1 % agaroza w buforze weronalowym 0,01M pH 8,6

−

łaźnia wodna lub kuchenka mikrofalowa

−

aparat do elektroforezy

−

zasilacz

−

wilgotna komora

−

wzorcowa surowica ludzka

−

królicze przeciwciała przeciw ludzkim Ig GAM

Materiał badany:

surowica ludzka (min. ilość 50

µl, opt. ~ 1 ml)

Zasada metody:

etap I – elektroforeza: rozdział białek badanej surowicy w polu elektrycznym,

etap II – 24 h inkubacja: białka surowicy badanej i dodane po elektroforezie
przeciwciała zwierzęce kontaktują się ze sobą w żelu, tworząc najpierw kompleksy
Ag-Ab, a następnie w strefie ekwiwalencji, prążki precypitatu.

Wykonanie:

−

przygotować bufor weronalowy:

weronal

184 g

weronal sodu

10,3 g

rozpuścić w wodzie, doprowadzić pH do 8,6, uzupełnić do 1L objętości.

−

gorący agar wylać na płytkę szklaną do uzyskania warstwy ~ 1 mm

−

po zastygnięciu wyciąć studzienki w żelu i napełnić je próbkami badanych surowic

(nierozcieńczonych); do jednej ze studzienek podać wzorcową surowicę ludzką;

−

umieścić płytkę w aparacie do elektroforezy, połączyć żel na płytce z buforem

w zbiornikach aparatu przy pomocy „kluczy” z bibuły Whatman 3,

−

przeprowadzić elektroforezę w warunkach: 120 V; 0,1 A; 80 min; przewidywana

wędrówka immunoglobulin w kierunku elektrody (–)

−

po wyłączeniu z prądu płytkę wyjąć z aparatu, wyciąć rowki równoległe do

przewidywanego rozdziału białek, usunąć z nich żel,

−

wypełnić rowki odpowiednio dobranymi surowicami zwierzęcymi (po 50 µl),

−

umieścić płytkę w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.

Ocena i interpretacja wyników:

−

tworzące się w żelu łuki precypitacyjne oceniamy wizualnie po 24 h inkubacji

odnosząc długość, grubość i kształt poszczególnych linii do linii uzyskanych
z ludzką surowicą wzorcową; ocena ma charakter jakościowy

−

poziom danej immunoglobuliny uważa się za prawidłowy („norma”) jeśli uzyskany

w  trakcie  testu  łuk  precypitacyjny  nie  różni  się  zasadniczo  od  uzyskanego  w  tym
samym  teście  łuku  dla  surowicy  wzorcowej.  W  przeciwnym  przypadku  poziom
ocenianej immunoglobuliny podaje się jako obniżony lub podwyższony („wzrost”,
„spadek”).  Białko  monoklonalne  uważa  się  za  obecne  jeśli  wyraźnemu  wzrostowi
poziomu jednego z łańcuchów lekkich immunoglobulin towarzyszy istotny spadek
poziomu  drugiego  łańcucha  lekkiego  (odpowiednio  kappa  lub  lambda)  i  temu
obrazowi  towarzyszy  wyraźna  dysproporcja  w  poziomach  łańcuchów  ciężkich
immunoglobulin  (istotny  wzrost  poziomu  jednej  klasy  immunoglobuliny  przy
jednoczesnym spadku poziomu pozostałych).

II.

Immunoblotting

Sprzęt i odczynniki:

−

pipety nastawne 1 – 1000 µl

−

probówki 1,5 ml

−

zestaw typu dot-blott do oceny przeciwciał przeciwjądrowych.

Materiał badany:

surowica ludzka (min. ilość 50

µl, opt. ~ 1 ml)

Zasada metody:

Opakowanie zawiera 16 pasków testowych (membrany) z naniesionymi w postaci linii
scharakteryzowanymi  biochemicznie  antygenami.  Każdy  pasek  pozwala  na  wykrycie
in  vitro  14  różnych  antygenów:  nRNP,  Sm,  SS-A  (SS-A  natywne  i  Ro 52),  SS-B,
Scl-70,  Jo-1,  CENP  B,  PCNA,  dsDNA,  nukleosomy,  histony,  rybosomalne  białko  P
oraz  AMA-M2  w  surowicy  lub  plazmie.  W  pierwszym  etapie  paski  membrany
inkubuje  się  z  rozcieńczonymi  surowicami  pacjentów.  W  pozytywnych  przypadkach
przeciwciała klasy IgG (a także IgA i IgM) wiążą się podczas drugiego etapu inkubacji
z  przeciwciałami  przeciwko  ludzkiej  IgG  znakowanymi  enzymem  (koniugat
enzymatyczny), który następnie katalizuje reakcję barwną.

Wykonanie:

−

Przeznaczone do badania próbki surowicy oraz kontrolę dodatnią należy

rozcieńczać w stosunku 1:101 w buforze do próbek (np. 15

µl surowicy + 1,5 ml

buforu do próbek). Bufor do próbek jest gotowy do użycia; koniugat enzymatyczny
należy rozcieńczyć w stosunku 1:10 (np. 150

µl + 1,35 ml buforu do próbek).

Bufor do płukania należy rozcieńczyć wodą destylowaną w stosunku 1:10 (1 ml
buforu do płukania + 9 ml wody/pasek)

−

Potrzebną ilość pasków (odpowiadającą liczbie pacjentów + kontrola pozytywna)

należy umieścić w rynienkach płytki do płukania w taki sposób by numer paska był
widoczny. Inkubować 5 min w 1,5 ml buforu do rozcieńczenia. Po usunięciu płynu
do rynienek podać po 1,5 ml rozcieńczonych surowic pacjentów.

−

Inkubować 30 min w temperaturze pokojowej (+ 18 − 25°C) z ostrożnym

mieszaniem (kołyska laboratoryjna).

−

Płukanie: opróżnić rynienki reakcyjne i trzykrotnie płukać, za każdym razem

używając 1,5 ml buforu płuczącego (3

× 1 min, kołyska laboratoryjna).

−

Inkubacja koniugatu: odpipetować do każdej rynienki reakcyjnej po 1,5 ml

roztworu koniugatu enzymatycznego (znakowana alkaliczną fosfatazą kozia Ig
anty- ludzka IgG). Inkubować 30 min w temperaturze pokojowej z mieszaniem.

−

Płukanie: opróżnić rynienki inkubacyjne. Płukać jak wyżej.

−

Inkubacja substratu: odpipetować do każdej rynienki inkubacyjnej po 1,5 ml

roztworu substratu/chromogenu (NBT/BCIP). Inkubować 10 min w temperaturze
pokojowej na kołysce laboratoryjnej.

−

Przerwanie reakcji: opróżnić rynienki i trzykrotnie płukać wodą destylowaną

× 1 min, kołyska laboratoryjna).

−

Pomiar: Paski należy umieścić w arkuszu protokołu oceny testu, wysuszyć. Arkusz

zeskanować i dokonać oceny półilościowej testu przy pomocy programu
komputerowego.

Ocena i interpretacja wyników:

Zależnie od intensywności wybarwienia prążka wynik dla poszczególnych antygenów
podaje się jako negatywny, słabo dodatni, dodatni, silnie dodatni.

METODY ILOŚCIOWE OCENY REAKCJI ANTYGEN-PRZECIWCIAŁO.

Zagadnienia:

elektroforeza

rakietkowa,

immunodyfuzja

Mancini’ego,

turbidymetria,

nefelometria, metody wykorzystujące odczynniki znakowane, RIA, ELISA,
wiarygodność

metody

diagnostycznej,

przykłady

zastosowania

testów

diagnostycznych

Metody oceny ilościowej:

−

ocena turbidymetryczna

Pomiar zmętnienia próbki, będącego wynikiem reakcji antygen-przeciwciało, przy
jednoczesnej kontroli prędkości zachodzenia reakcji zmętnienia oraz czasu po którym
prędkość zachodzącej reakcji była maksymalna.

−

odczyn immunoenzymatyczny ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay)

W  metodzie  ELISA  studzienki  reakcyjne  mikropłytek  (faza  stała)  opłaszczone  są
antygenem. W pierwszym etapie przeciwciała obecne w badanych surowicach łączą
się  z  zaadsorbowanym  antygenem.  W  drugim  etapie  do  układu  dodaje  się
wyznakowanego  enzymem  koniugatu  antyglobulinowego.  Następnie  dodawany  jest
substrat  dla  enzymu,  który  w  reakcji  z  enzymem  daje  barwny  produkt.  Przy  użyciu
odpowiedniego czytnika można mierzyć różnice w zabarwieniu reakcji w zależności
od stężenia poszukiwanej substancji.

Preparatyka:

Ocena turbidymetryczna

Sprzęt i odczynniki:

−

turbidymetr

−

kuwety plastikowe z mieszadełkiem

−

zestaw regulowanych mikropipet 10 –1000 µl

−

0,9 % roztwór soli fizjologicznej

−

Zestaw gotowych do użycia (rozcieńczonych) przeciwciał zwierzęcych przeciw

składowym dopełniacza C3c i C4

Materiał badany:

surowica pacjenta (min. ilość 50 µl, opt. ~ 1 ml)

Zasada metody:

Aparat mierzy zmętnienie próbki, będące wynikiem reakcji Ag-Ab, kontrolując
jednocześnie prędkość zachodzenia reakcji oraz czas, po którym ta prędkość jest
maksymalna.

Wykonanie

−

Ogrzać przeciwciała i surowice do temperatury pokojowej.

−

Rozcieńczyć badane surowice w soli fizjologicznej 1:21 (50 µl surowicy + 1000 µl

0,9 % NaCl).

−

Podać odpowiednią ilość rozcieńczonej surowicy do kuwet (wg wskazań aparatu).

−

Po włączeniu aparatu umieścić kolejne buteleczki z przeciwciałami w aparacie tak,

by odczytał on kod paskowy na etykiecie; w razie konieczności wprowadzić kod
paskowy ręcznie.

−

Umieścić kuwetę z badaną surowicą w aparacie.

−

Podać do kuwety 500 µl roztworu odpowiedniego przeciwciała.

−

Mieszanie próbek, odczyt i wydruk następują automatycznie w ciągu ~ 30 sek.

−

Sprawdzić uzyskany wynik z normą dla poszczególnych białek.

−

W razie dużych odstępstw od normy powtórzyć pomiar po rozcieńczeniu surowicy

badanej wg wskazań aparatu.

Ocena i interpretacja wyników:

W zależności od ustawienia aparatu uzyskujemy wynik w mg/ml, mg/dl
lub w jednostkach międzynarodowych; uzyskany wynik nie wymaga żadnych dalszych
przeliczeń; należy go odnieść do płci i wieku pacjenta (szczególnie ważne w przypadku
dzieci).

II.

Odczyn immunoenzymatyczny ELISA

Sprzęt i odczynniki:

−

pipety nastawne 1 – 1000 µl

−

probówki 1,5 ml

−

statyw do probówek

−

zestaw ELISA

Materiał badany:

−

surowica ludzka (min. ilość 50 µl, opt. ~ 1 ml)

Zasada metody:

Opakowanie  zawiera  mikropłytkę  ze  studzienkami  reakcyjnymi  opłaszczonymi
antygenem.  W  pierwszym  etapie  studzienki  reakcyjne  inkubuje  się  z  rozcieńczonymi
surowicami pacjentów. W pozytywnych przypadkach przeciwciała klasy IgG wiążą się
z  obecnymi  na  powierzchni  studzienki  antygenami.  Związane  przeciwciała  wykrywa
się  podczas  drugiego  etapu  inkubacji  z  przeciwciałami  skierowanymi  przeciwko
ludzkiej  IgG  znakowanymi  enzymem  (koniugat  enzymatyczny),  który  następnie
katalizuje reakcję barwną.

Wykonanie

−

Przeznaczone do badania próbki surowicy należy rozcieńczyć w stosunku 1:101

w buforze do próbek (np. 10

µl surowicy + 1 ml buforu do próbek). Bufor do

próbek, koniugat enzymatyczny, kalibratory i kontrole gotowe są do użycia. Bufor
do płukania należy rozcieńczyć destylowaną wodą w stosunku 1:10
(np. 5 ml buforu do płukania + 45 ml wody).

−

Inkubacja próbek surowicy: zgodnie ze schematem odpipetować do studzienek

reakcyjnych po 100

µl surowicy kalibracyjnej, pozytywnej i negatywnej surowicy

kontrolnej

oraz

rozcieńczone

surowice

pacjentów.

Inkubować

30 min

w temperaturze pokojowej (+ 18 – 25

°C).

−

Płukanie: opróżnić studzienki reakcyjne i trzykrotnie płukać, za każdym razem

używając 300

µl rozcieńczonego buforu płuczącego. Po każdym płukaniu płytkę

mikrotitracyjną należy odwrócić studzienkami w dół i silnie wytrząsnąć nad
papierem filtracyjnym, aby całkowicie usunąć resztki buforu płuczącego.

−

Inkubacja koniugatu: odpipetować do każdej studzienki reakcyjnej po 100 µl

roztworu koniugatu enzymatycznego (znakowana peroksydazą królicza Ig
anty- ludzka IgG). Inkubować 30 min w temperaturze pokojowej.

−

Płukanie: opróżnić studzienki reakcyjne. Płukać jak wyżej.

−

Inkubacja substratu: Odpipetować do każdej studzienki reakcyjnej po 100 µl

roztworu substratu/chromogenu. Inkubować 15 min. W temperaturze pokojowej;
chronić przed światłem.

−

Przerwanie reakcji: Odpipetować do każdej studzienki reakcyjnej, w tej samej

kolejności i z tą samą szybkością co przy pipetowaniu substratu, po 100

µl

roztworu przerywającego reakcję.

−

Pomiar: fotometryczna ocena intensywności barwy powinna być przeprowadzona

w ciągu 30 min. Od zastopowania reakcji, przy długości fali

λ = 450 nm

i referencyjnej dłogości fali > 620 nm.

Ocena i interpretacja wyników:

−

Odwzorowując w linearnym układzie współrzędnych wartości ekstynkcji 3 surowic

kalibracyjnych i odpowiadające im względne jednostki (RU/ml), a następnie łącząc
naniesione punkty, wykreśla się krzywą wzorcową, z której można odczytać
stężenie przeciwciał w surowicy. Krzywą można wykreślić także za pomocą
programu komputerowego.

−

Do akceptowania i dokumentowania wyników wykorzystuje się program

komputerowy.

−

Górna granica normy (cut-off) testu wynosi 20 jednostek relatywnych (R/ml).

Rekomenduje się następującą interpretację wyników:

< 16 RU/ml

negatywny

16 – 22 RU/ml

graniczny

> 22 RU/ml

pozytywny

Ćwiczenie 2

Immunologia komórkowa – badania immunofenotypowe.

Zagadnienia:

pojęcie  immunofenotypu,  cytofluorymetria  przepływowa,  cytometr  przepływowy,
względna  wielkość  komórki,  względna  ziarnistość  komórki,  średnia  intensywność
fluorescencji,  zjawisko  fluorescencji,  markery  różnicowania,  immunofenotyp  krwi
obwodowej

Ocena immunofenotypu:

−

immunofluorescencja bezpośrednia – oznaczanie z pełnej krwi obwodowej

Określenie  antygenów  tzw.  markerów  różnicowania  (ang.  cluster  of  differentiation;
CD)    przy  użyciu  przeciwciał  monoklonalnych,  celem  zróżnicowania  komórek
immunologicznie kompetentnych.

Preparatyka:

Immunofluorescencja bezpośrednia

Sprzęt i odczynniki:

−

cytometr przepływowy

−

zestaw regulowanych mikropipet 10 –1000 µl

−

probówki cytometryczne

−

statyw do probówek

−

tryskawka do PBS

−

zlewka

−

10 × stężony bufor lizujący

−

roztwór PBS pH 7,4

−

przeciwciała monoklonalne znakowane fluorochromem

−

płyn lizujący

−

woda destylowana

Materiał badany:

krew obwodowa pobrana do probówki z antykoagulantem EDTA (min. ilość 500

µl)

Zasada metody:

Określenie przy pomocy cytofluorymetru przepływowego zespołu charakterystycznych
cech antygenowych komórki, które pozwalają zidentyfikować populacje komórek o
istotnym znaczeniu diagnostycznym.

Wykonanie

−

Do probówek wprowadzić po 2 µl odpowiednich przeciwciał.

−

Następnie do każdej probówki dodać po 50 µl dokładnie wymieszanej krwi.

−

Inkubować 15 – 20 min w temperaturze pokojowej chroniąc przed światłem.

−

Do każdej probówki dodać po 500 µl roztworu buforu lizującego, rozcieńczonego

wodą destylowaną 1 : 10 i dokładnie wymieszać.

−

Inkubować 10 min w temperaturze pokojowej chroniąc przed światłem.

−

Przerwać lizę dodając do probówki ~2 ml PBS z tryskawki.

−

Wirować probówki 5 min z prędkością 1500 obr./min.

−

Zlać supernatant.

−

Ponownie do probówki dodać PBS i wirować jak wyżej.

−

Zlać supernatant i zawiesić osad w 150 µl PBS, próbki gotowe do akwizycji.

Ocena i interpretacja wyników:

Ocenę wykonanych próbek przeprowadza się przy użyciu cytometru przepływowego
stosując odpowiedni program komputerowy. W trakcie oceny immunofenotypowej
określa się odsetek komórek wykazujących fluorescencję danego fluorochromu.

Ćwiczenie 3

Immunologia komórkowa - ocena czynnościowa.

Zagadnienia:

komórki  immunologicznie  czynne,  komórki  pomocnicze,  metody  izolacji  komórek,
testy  czynnościowe,  reakcje  nadwrażliwości,  testy  skórne,  metody  oceny  funkcji
limfocytów,  test  transformacji  blastycznej,  metody  oceny  aktywacji  komórek,
mitogeny,  testy  cytotoksyczne,  metody  oceny  wydzielania  cytokin,  metody  oceny
funkcji  komórek  żernych,  ocena  adhezji,  ocena  zdolności  do  chemotaksji,  zaburzenia
chemotaksji,  ocena  zdolności  do  fagocytozy,  indeks  fagocytarny,  zaburzenia
fagocytozy,  ocena  zdolności  do  zabijania  wewnątrzkomórkowego,  wybuch  tlenowy,
zaburzenia wybuchu tlenowego, zaburzenia zabijania wewnątrzkomórkowego

Izolacja komórek na gradiencie i oznaczanie żywotności komórek.
−

−

metoda izolacji w gradientach gęstości

Wykorzystuje  różnice  w  wielkości  i  ciężarze  właściwym  poszczególnych  komórek.
Stosuje  się  mieszaniny  rozdzielające:  Ficoll  (Percoll)  –  Isopaque  (Uropolina)  –
[metoda  Boyum’a],  Gradisol  (mieszanina  Uropoliny  i  dekstranu)  o  różnej  gęstości.
Krew pobraną na antykoagulant i wymieszaną z PBS nawarstwia się na odpowiedni
gradient i wiruje. Po wirowaniu komórki zbiera się powstałej interfazy.

−

ocena żywotności izolowanych komórek

W  celu  oceny  żywotności  komórek  wykorzystuje  się  np.  roztwór  błękitu  trypanu.
Dodanie  tego  barwnika  pozwala  ocenić  przepuszczalność  błony  komórkowej,  w
teście  martwe  komórki  barwią  się  na  niebiesko.  Oceniane  komórki  liczy  się  na
kamerze pod mikroskopem świetlnym.

Ocena cyklu komórkowego jednojądrzastych komórek krwi obwodowej.

Do uzyskanych na gradiencie limfcytów dodaje się 100

µl roztworu 0,1% saponiny w

celu  permabilizacji  komórek.  Po  inkubacji  i  wirowaniu  do  permabilizowanych
komórek  dodaje  się  roztwór  jodku  propidyny.  Wyznakowane  jodkiem  propidyny
preparaty poddaje się akwizycji przy pomocy cytometru przepływowego.  W trakcie
analizy ocenia się poszczególne fazy cyklu komórkowego.

Preparatyka:

Izolacja jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) w gradiencie
gęstości

Sprzęt i odczynniki:

−

probówki plastikowe 15 ml i 50 ml

−

zestaw regulowanych mikropipet 10 –1000 µl

−

Gradisol L (FICOLL o d = 1,077 g/cm

)

−

Bufor PBS

Materiał badany:

krew obwodowa pobrana do probówki z antykoagulantem heparyną (min. ilość 500

µl)

Zasada metody:

Na  określoną  objętość  gradientu  gęstości  nawarstwia  się  rozcieńczoną  PBS  krew
obwodową.  Po  odwirowaniu  zbiera  się  interfazę  bogatą  w  komórki  limfoidalne.  Na
dnie  probówki  zbierają  się  erytrocyty  i  granulocyty,  które  przedostały  się  przez
warstwę Ficollu.

Wykonanie

−

Pobraną na heparynę krew rozcieńczyć w probówce 50 ml roztworem PBS w

stosunku 1 : 3.

−

Do probówki 15 ml wprowadzić Gradisol L i krew zawieszoną w PBS w stosunku

1:1 (3:1) tak aby zachować granicę faz.

−

Wirować probówki w ciągu 20 min, w temperaturze 20°C, przy 2000 obr./min.

−

Zebrać z interfazy pierścień komórek jednojądrzastych.

−

Płukać dwa razy w PBS. Wirować w temperaturze 4°C przy 200 g.

−

Komórki zawiesić w PBS.

Ocena i interpretacja wyników:

Ocenę izolacji PBMC przeprowadza się pod mikroskpem świetlnym.

II.

Liczenie komórek na hemacytometrze oraz określenie żywotności komórek

przy pomocy błękitu trypanu.

Sprzęt i odczynniki:

−

hemacytometr (kamera do liczenia komórek, np. Burkera)

−

zestaw regulowanych mikropipet 10 –1000 µl

−

probówki plastikowe

−

mikroskop świetlny

−

błękit trypanu 0,05 %

Materiał badany:

jednojądrzaste komórki krwi obwodowej izolowane w gradiencie gęstości

Zasada metody:

W wyniku barwienia błękitem trypanu komórki martwe wybarwiają się na niebiesko,
do wnętrza komórek żywych barwnik nie wnika.

Wykonanie

−

Zmieszać 10 µl zawiesiny komórek z 10 µl 0,05 % błękitu trypanu (stosunek 1:1).

−

Nałożyć 10 µl mieszaniny komórek i błękitu trypanu na hemacytometr pod

szkiełko nakrywkowe.

−

Umieścić kamerę do liczenia komórek pod mikroskopem świetlnym.

−

Obliczyć ilość żywych (niewybarwionych) i martwych (niebieskich) komórek

zawartych na powierzchni 1 mm

. Powtórzyć liczenie dla 3 – 4 różnych pól i

obliczyć średnią liczbę komórek na 1 mm

−

Po zakończeniu liczenia wyczyścić kamerę i szkiełko nakrywkowe wodą oraz 70%

alkoholem, a następnie osuszyć.

Ocena i interpretacja wyników:

−

Przeliczyć całkowitą liczbę żywych komórek wg wzoru:

# żywych komórek = średnia # żywych komórek

× rozcieńczenie × 2 × 1⋅10

(np. # komórek

× 10 ml × 2 × 10 000)

−

Obliczyć % żywych komórek wg wzoru:

komórek

wszystkich

policzonyc

komórek

żywych

policzonyc

× 100 = % żywych komórek

III.

Ocena cyklu komórkowego jednojądrzastych komórek krwi obwodowej.

Sprzęt i odczynniki:

−

cytometr przepływowy

−

zestaw regulowanych mikropipet 10 –1000 µl

−

probówki cytometryczne

−

statyw do probówek

−

tryskawka do PBS

−

zlewka

−

roztwór PBS pH 7,4

−

1 % roztwór saponiny w RPMI + 10% surowicy FBS

−

roztwór jodku propidyny 100 µg/ml w PBS

Materiał badany:

−

PBMC uzyskane w trakcie izolacji na gradiencie.

Zasada metody:

Jodek propidyny jest barwnikiem fluorescencyjnym, który barwi jądra komórkowe
badanych komórek interkalując z helisą DNA. Barwnik ten emituje czerwone światło
fluorescencji w zakresie możliwym do oceny przy pomocy cytometru przepływowego.

Wykonanie

−

Do badanych komórek dodać 200 µl 1 % roztworu saponiny.

−

Próbkę inkubować 30 min w lodówce.

−

Po tym czasie wirować próbkę 10 min przy prędkości 1500 obr./min w

temperaturze 4

°C.

−

Supernatant odrzucić, a uzyskany osad zawiesić w 150 µl schłodzonego buforu

PBS zawierającego 100

µg/ml jodku propidyny.

−

Próbę inkubowanć 30 min w temperaturze 4°C chroniąc przed światłem (w

lodówce).

−

Po tym czasie próbę poddać akwizycji przy użyciu cytometru przepływowego.

Ocena i interpretacja wyników:

W trakcie przeprowadzanej analizy ocenia się średnią intensywność fluorescencji
(MFI) emitowaną przez jodek propidyny interkalujący z DNA badanych komórek.
Ocenę intensywności fluorescencji przeprowadza się przy pomocy histogramu.

Ćwiczenie 4

Wykrywanie białek i kwasów nukleinowych in situ.

METODY IMMUNOMORFOLOGICZNE

Zagadnienia:

sposoby  detekcji  reakcji  antygen-przeciwciało,  reakcje  immunoenzymatyczne,
reakcja  APAAP,  reakcja  ABC,  reakcja  LAB,  reakcje  z  użyciem  barwnika
fluorescencyjnego,  immunofluorescencja  wielokolorowa,  mikroskopia  konfokalna,
mikroskopia  wielofotonowa,  reakcje  z  użyciem  metali  ciężkich,  mikroskopia
elektronowa, technologia ImageStream

Reakcje z użyciem barwnika fluorescencyjnego:

−

zamrażanie materiału tkankowego

Szybkie zamrażanie zapobiega powstawaniu niszczących strukturę tkanki dużych
kryształów lodu.

−

reakcja pośredniej immunofluorescencji IMF

Wykrywanie autoprzeciwciał w surowicy w chorobach autoimmunologicznych.

Zamrażanie materiału tkankowego.

Sprzęt i odczynniki:

−

termos z cienkościennym naczyńkiem metalowym

−

penseta

−

worek foliowy

−

mieszanina zamrażająca (suchy lód + aceton)

−

płyn oziębiający (eter naftowy)

−

płyn o dużej gęstości zamrażany razem z tkanką (tzw. Tissue-tek)

Materiał badany:

−

blok tkankowy

Zasada metody:

Wiele antygenów w przebiegu rutynowego utrwalania i zatapiania w parafinie bloków
tkankowych ulega zniszczeniu. W związku z tym materiał tkankowy przewidziany do
rekcji immunomorfologicznych należy w większości przypadków przygotowywać w
osobny sposób, zwykle przez zamrażanie. Zamrażanie tego materiału powinno
odbywać się jak najkrótszym czasie, aby zapobiec tworzeniu się w tkance kryształów
lodu, które mogą uszkodzić fizycznie tkankę.

Wykonanie

−

Zamrażany blok tkankowy zanurza się w mieszaninie zamrażającej przygotowanej

wcześniej w termosie

−

Po kilku-kilkunastu sekundach następuje wyraźne i trwałe zblednięcie tkanki,

wiadczące o zamrożeniu materiału.

−

Zamrożony blok tkankowy, przy pomocy pensety wyjmuje się z mieszaniny

zamrażającej, umieszcza w opisanym woreczku foliowym i przechowuje w
zamrażarce (opt.

− 70°C).

II.

Oznaczanie autoprzeciwciał metodą immunofluorescencji pośredniej.

Sprzęt i odczynniki:

−

szkiełka z preparatami wątroby szczura (substrat antygenowy dla wykrywanych

autoprzeciwciał)

−

kriostat

−

odtłuszczone w alkoholu szkiełka nakrywkowe

−

pipety jednorazowe i regulowane

−

probówki plastikowe

−

statyw do probówek

−

płuczka szklana

−

komora wilgotna

−

bufor PBS o pH 7,6

−

przeciwciała królicze anty ludzkie IgG, A, M znakowane FITC

−

surowica kontrolna

−

90% buforowana gliceryna

−

błękit Evansa

Materiał badany:

−

surowica badana w ilości ~ 2 ml.

Zasada metody:

Autoprzeciwciała obecne w badanych surowicach przyłączają się w pierwszym etapie
do substratu antygenowego (antygenów w skrawkach wątroby szczurzej) na szkiełkach
podstawowych. W drugim etapie następuje detekcja autoprzeciwciał przy pomocy
wyznakowanej fluoresceiną antyglobuliny.

Wykonanie

−

wyjąć szkiełka z antygenami z lodówki i doprowadzić je do temperatury pokojowej

pod wentylatorem.

−

przygotować rozcieńczenia badanych surowic w roztworze PBS (rozc. od 1:80)

−

nałożyć po 25 µl surowic (kontrolnych i badanych) na szkiełko ze skrawkami.

−

inkubować 30 min, przepłukać w PBS-Tween, płukać w płuczce 3 × 5 min.

−

nałożyć 20 µl anty-ludzkiej IgG, A, M/FITC na szkiełko.

−

inkubować 30 min, przepłukać w PBS-Tween, płukać w płuczce 3 × 5 min.

−

zamknąć w glicerolu/PBS pod szkiełkiem nakrywkowym

−

do ostatniego płukania można dodać błękit Evansa (10 kropli na 150 ml PBS-

Tween)

Ocena i interpretacja wyników:

Ocenę preparatów przeprowadza się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Za reakcję
dodatnią uznaje się obecność żółtozielonej fluorescencji (w odpowiednim substracie
komórkowym w zależności od rodzaju autoprzeciwciał).

LITERATURA:

Żeromski J. Immunologia dla studentów wydziału lekarskiego. Wyd. AM, Poznań

2008;

Żeromski J. Metody immunologiczne. Przewodnik do ćwiczeń z immunologii dla

studentów Wydziału Lekarskiego. Wyd. AM, Poznań 1997;

Kątnik-Prastowska I. Immunochemia w biologii medycznej. Metody Laboratoryjne.

PWN, Warszawa 2009;

Dembińska-Kieć A., Naskalski J.W. Diagnostyka laboratoryjna z elementami

biochemii klinicznej. Podręcznik dla studentów medycyny. Elsevier Urban&Partner,
Wrocław 2009

Luft S. Metody diagnostyki serologicznej w reumatologii. PWN, Warszawa 1996;

Roitt I., Brostoff J., Male D. Immunologia. Elsevier Urban & Partner, Wrocław 2008;

Gołąb J., Jakóbisiak M., Lasek W. Stokłosa T. Immunologia. PWN, Warszawa 2008;

Ptak W., Ptak M., Szczepanik M. Podstawy immunologii. PZWL, Warszawa 2009;

Zeman K. Zaburzenia odporności u dzieci. PZWL, Warszawa 2002;

10.

Zabel M. Immunocytochemia. PWN, Warszawa 1999;

11.

Zuba-Surma E.K., Kucia M., Ratajczak M.Z. Post. Biol. Kom. 2007; 34(2): 361- 376.

12.

Porcedury ANA Profile 3 EUROLINE i Anty- Borrelia plus VlsE (IgG) ELISA firmy

EUROIMMUN