IMMUNODIAGNOSTYKA

Wydział Lekarski, rok IV

ĆWICZENIA LABORATORYJNE

dr Mariusz Kaczmarek

semestr zimowy

2011/2012

2

Ćwiczenie 1

Układ odporności. Odporność humoralna.

METODY JAKOŚCIOWE OCENY REAKCJI ANTYGEN-PRZECIWCIAŁO.

Zagadnienia:

antygeny, hapteny, antygenowość, immunogenność, epitop, powinowactwo, awidność,
przeciwciała, monoklonalność, poliklonalność, monowalentność, poliwalentność,
precypitacja, krzywa precypitacji, obszar ekwiwalentny, warunki reakcji precypitacji,
metody oparte o zjawisko precypitacji, immunoelektroforezy, immunofiksacja, złożone
techniki serologiczne, immunoblotting, immunoprecypitacja, aglutynacja, warunki
reakcji aglutynacji, metody oparte o zjawisko aglutynacji

1.

Metody oparte o zjawisko precypitacji:
−

podwójna dyfuzja w agarze (PDA) - metoda Outcherlony’ego, immunodyfuzja.

Do wyciętych w żelu agarozowym studzienek nanosi się badane surowice i roztwory
przeciwciał, które dyfundują w nośniku. W miejscu spotkania obu składników
badanego układu tworzą się łuki precypitacyjne.

−

immunoelektroforeza prosta (IM-EL) – metoda umożliwia ocenę białek zawartych

w surowicy, łączy elektroforezę i immunodyfuzję.

W pierwszym etapie mieszaninę białek zawartą w surowicy, umieszczoną w żelu
agarozowym rozdziela się przy pomocy prądu elektrycznego. Następnie wycina się
w żelu równoległy do kierunku migracji białek rowek, który wypełnia się
odpowiednimi przeciwciałami. Dyfundujące w żelu składniki układu (badane białka
i przeciwciała) tworzą łuki precypitacyjne o charakterystycznym kształcie
i wielkości.

2.

Złożone techniki serologiczne:
−

immunoblotting

Poszukiwane przeciwciała zawarte w badanych surowicach wykrywane są przy
pomocy immobilizowanych w nitrocelulozie białek antygenu. W skład systemu
detekcyjnego wchodzi także antyglobulinowy koniugat wyznakowany enzymem
(np. peroksydaza chrzanowa lub alkaliczna fosfataza). Dodanie substratu dla
odpowiedniego enzymu powoduje powstanie nierozpuszczalnego w wodzie produktu
widocznego jako barwny prążek na nitrocelulozie.

3

Preparatyka:

I.

Podwójna dyfuzja w agarze (PDA)

1.

Sprzęt i odczynniki:

−

wypoziomowany stolik

−

odtłuszczone w alkoholu płytki szklane 6 × 9 cm lub szkiełka podstawowe

−

metalowa sztanca do PDA

−

pipeta szklana 10 – 25 ml

−

mikropipeta regulowana 10 – 200 µl

−

1 % agar lub agaroza w soli zbuforowanej pH 7,6 (PBS)

−

łaźnia wodna lub kuchenka mikrofalowa

−

wilgotna komora

−

próbki badanych antygenów i odpowiednie surowice odpornościowe (zwierzęce)

2.

Materiał badany:

surowica pacjenta lub inny roztwór białka do analizy (min. ilość 50

µl, opt. ~ 1 ml)

3.

Zasada metody:

Podczas 24 h inkubacji w komorze wilgotnej dochodzi do swobodnej dyfuzji białek
próbki badanej i zastosowanych do identyfikacji przeciwciał zwierzęcych. W miejscu
zetknięcia się obu składników układu dochodzi do powstania kompleksów
immunologicznych, a następnie (w strefie ekwiwalencji, tzn. równowagi stężeń
Ag-Ab) wytrącenia się precypitatu, który można analizować wizualnie

4.

Wykonanie

−

gorący agar wylać przy pomocy ogrzanej pipety na płytkę szklaną do uzyskania

warstwy grubości ok. 1 mm,

−

po zastygnięciu wyciąć studzienki w żelu przy pomocy sztancy,

−

napełnić przeciwstawne studzienki roztworami antygenu i odpowiednio dobranych

surowic odpornościowych lub seryjnymi rozcieńczeniami tej samej surowicy
odpornościowej,

−

umieścić płytkę w komorze wilgotnej w temperaturze pokojowej na 24 lub 48 h.

5.

Ocena i interpretacja wyników:

PDA jest techniką jakościową; powstanie łuku precypitacyjnego świadczy o obecności
poszukiwanego białka w próbce badanej; stosując podwójne rozcieńczenia
analizowanej surowicy odpornościowej można określić jej miano (tzn. największe
rozcieńczenie , przy którym tworzy się prążek precypitatu).

4

Immunoelektroforeza prosta (IM-EL)

1.

Sprzęt i odczynniki:

−

wypoziomowany stolik

−

odtłuszczone w alkoholu płytki szklane 6 × 9 cm lub szkiełka podstawowe

−

metalowa sztanca do IM-EL

−

pipeta szklana 10 – 25 ml

−

mikropipeta regulowana 10 – 200 µl

−

1 % agaroza w buforze weronalowym 0,01M pH 8,6

−

łaźnia wodna lub kuchenka mikrofalowa

−

aparat do elektroforezy

−

zasilacz

−

wilgotna komora

−

wzorcowa surowica ludzka

−

królicze przeciwciała przeciw ludzkim Ig GAM

2.

Materiał badany:

surowica ludzka (min. ilość 50

µl, opt. ~ 1 ml)

3.

Zasada metody:

etap I – elektroforeza: rozdział białek badanej surowicy w polu elektrycznym,

etap II – 24 h inkubacja: białka surowicy badanej i dodane po elektroforezie
przeciwciała zwierzęce kontaktują się ze sobą w żelu, tworząc najpierw kompleksy
Ag-Ab, a następnie w strefie ekwiwalencji, prążki precypitatu.

4.

Wykonanie:

−

przygotować bufor weronalowy:

weronal

184 g

weronal sodu

10,3 g

rozpuścić w wodzie, doprowadzić pH do 8,6, uzupełnić do 1L objętości.

−

gorący agar wylać na płytkę szklaną do uzyskania warstwy ~ 1 mm

−

po zastygnięciu wyciąć studzienki w żelu i napełnić je próbkami badanych surowic

(nierozcieńczonych); do jednej ze studzienek podać wzorcową surowicę ludzką;

−

umieścić płytkę w aparacie do elektroforezy, połączyć żel na płytce z buforem

w zbiornikach aparatu przy pomocy „kluczy” z bibuły Whatman 3,

−

przeprowadzić elektroforezę w warunkach: 120 V; 0,1 A; 80 min; przewidywana

wędrówka immunoglobulin w kierunku elektrody (–)

−

po wyłączeniu z prądu płytkę wyjąć z aparatu, wyciąć rowki równoległe do

przewidywanego rozdziału białek, usunąć z nich żel,

−

wypełnić rowki odpowiednio dobranymi surowicami zwierzęcymi (po 50 µl),

5

−

umieścić płytkę w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej.

5.

Ocena i interpretacja wyników:

−

tworzące się w żelu łuki precypitacyjne oceniamy wizualnie po 24 h inkubacji

odnosząc długość, grubość i kształt poszczególnych linii do linii uzyskanych
z ludzką surowicą wzorcową; ocena ma charakter jakościowy

−

poziom danej immunoglobuliny uważa się za prawidłowy („norma”) jeśli uzyskany

w trakcie testu łuk precypitacyjny nie różni się zasadniczo od uzyskanego w tym
samym teście łuku dla surowicy wzorcowej. W przeciwnym przypadku poziom
ocenianej immunoglobuliny podaje się jako obniżony lub podwyższony („wzrost”,
„spadek”). Białko monoklonalne uważa się za obecne jeśli wyraźnemu wzrostowi
poziomu jednego z łańcuchów lekkich immunoglobulin towarzyszy istotny spadek
poziomu drugiego łańcucha lekkiego (odpowiednio kappa lub lambda) i temu
obrazowi towarzyszy wyraźna dysproporcja w poziomach łańcuchów ciężkich
immunoglobulin (istotny wzrost poziomu jednej klasy immunoglobuliny przy
jednoczesnym spadku poziomu pozostałych).

II.

Immunoblotting

1.

Sprzęt i odczynniki:

−

pipety nastawne 1 – 1000 µl

−

probówki 1,5 ml

−

zestaw typu dot-blott do oceny przeciwciał przeciwjądrowych.

2.

Materiał badany:

surowica ludzka (min. ilość 50

µl, opt. ~ 1 ml)

3.

Zasada metody:

Opakowanie zawiera 16 pasków testowych (membrany) z naniesionymi w postaci linii
scharakteryzowanymi biochemicznie antygenami. Każdy pasek pozwala na wykrycie
in vitro 14 różnych antygenów: nRNP, Sm, SS-A (SS-A natywne i Ro 52), SS-B,
Scl-70, Jo-1, CENP B, PCNA, dsDNA, nukleosomy, histony, rybosomalne białko P
oraz AMA-M2 w surowicy lub plazmie. W pierwszym etapie paski membrany
inkubuje się z rozcieńczonymi surowicami pacjentów. W pozytywnych przypadkach
przeciwciała klasy IgG (a także IgA i IgM) wiążą się podczas drugiego etapu inkubacji
z przeciwciałami przeciwko ludzkiej IgG znakowanymi enzymem (koniugat
enzymatyczny), który następnie katalizuje reakcję barwną.

4.

Wykonanie:

−

Przeznaczone do badania próbki surowicy oraz kontrolę dodatnią należy

rozcieńczać w stosunku 1:101 w buforze do próbek (np. 15

µl surowicy + 1,5 ml

buforu do próbek). Bufor do próbek jest gotowy do użycia; koniugat enzymatyczny
należy rozcieńczyć w stosunku 1:10 (np. 150

µl + 1,35 ml buforu do próbek).

Bufor do płukania należy rozcieńczyć wodą destylowaną w stosunku 1:10 (1 ml
buforu do płukania + 9 ml wody/pasek)

6

−

Potrzebną ilość pasków (odpowiadającą liczbie pacjentów + kontrola pozytywna)

należy umieścić w rynienkach płytki do płukania w taki sposób by numer paska był
widoczny. Inkubować 5 min w 1,5 ml buforu do rozcieńczenia. Po usunięciu płynu
do rynienek podać po 1,5 ml rozcieńczonych surowic pacjentów.

−

Inkubować 30 min w temperaturze pokojowej (+ 18 − 25°C) z ostrożnym

mieszaniem (kołyska laboratoryjna).

−

Płukanie: opróżnić rynienki reakcyjne i trzykrotnie płukać, za każdym razem

używając 1,5 ml buforu płuczącego (3

× 1 min, kołyska laboratoryjna).

−

Inkubacja koniugatu: odpipetować do każdej rynienki reakcyjnej po 1,5 ml

roztworu koniugatu enzymatycznego (znakowana alkaliczną fosfatazą kozia Ig
anty- ludzka IgG). Inkubować 30 min w temperaturze pokojowej z mieszaniem.

−

Płukanie: opróżnić rynienki inkubacyjne. Płukać jak wyżej.

−

Inkubacja substratu: odpipetować do każdej rynienki inkubacyjnej po 1,5 ml

roztworu substratu/chromogenu (NBT/BCIP). Inkubować 10 min w temperaturze
pokojowej na kołysce laboratoryjnej.

−

Przerwanie reakcji: opróżnić rynienki i trzykrotnie płukać wodą destylowaną

(3

× 1 min, kołyska laboratoryjna).

−

Pomiar: Paski należy umieścić w arkuszu protokołu oceny testu, wysuszyć. Arkusz

zeskanować i dokonać oceny półilościowej testu przy pomocy programu
komputerowego.

5.

Ocena i interpretacja wyników:

Zależnie od intensywności wybarwienia prążka wynik dla poszczególnych antygenów
podaje się jako negatywny, słabo dodatni, dodatni, silnie dodatni.

7

METODY ILOŚCIOWE OCENY REAKCJI ANTYGEN-PRZECIWCIAŁO.

Zagadnienia:

elektroforeza

rakietkowa,

immunodyfuzja

Mancini’ego,

turbidymetria,

nefelometria, metody wykorzystujące odczynniki znakowane, RIA, ELISA,
wiarygodność

metody

diagnostycznej,

przykłady

zastosowania

testów

diagnostycznych

Metody oceny ilościowej:

−

ocena turbidymetryczna

Pomiar zmętnienia próbki, będącego wynikiem reakcji antygen-przeciwciało, przy
jednoczesnej kontroli prędkości zachodzenia reakcji zmętnienia oraz czasu po którym
prędkość zachodzącej reakcji była maksymalna.

−

odczyn immunoenzymatyczny ELISA (Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay)

W metodzie ELISA studzienki reakcyjne mikropłytek (faza stała) opłaszczone są
antygenem. W pierwszym etapie przeciwciała obecne w badanych surowicach łączą
się z zaadsorbowanym antygenem. W drugim etapie do układu dodaje się
wyznakowanego enzymem koniugatu antyglobulinowego. Następnie dodawany jest
substrat dla enzymu, który w reakcji z enzymem daje barwny produkt. Przy użyciu
odpowiedniego czytnika można mierzyć różnice w zabarwieniu reakcji w zależności
od stężenia poszukiwanej substancji.

Preparatyka:

I.

Ocena turbidymetryczna

1.

Sprzęt i odczynniki:

−

turbidymetr

−

kuwety plastikowe z mieszadełkiem

−

zestaw regulowanych mikropipet 10 –1000 µl

−

0,9 % roztwór soli fizjologicznej

−

Zestaw gotowych do użycia (rozcieńczonych) przeciwciał zwierzęcych przeciw

składowym dopełniacza C3c i C4

2.

Materiał badany:

1.

surowica pacjenta (min. ilość 50 µl, opt. ~ 1 ml)

3.

Zasada metody:

Aparat mierzy zmętnienie próbki, będące wynikiem reakcji Ag-Ab, kontrolując
jednocześnie prędkość zachodzenia reakcji oraz czas, po którym ta prędkość jest
maksymalna.

8

4.

Wykonanie

−

Ogrzać przeciwciała i surowice do temperatury pokojowej.

−

Rozcieńczyć badane surowice w soli fizjologicznej 1:21 (50 µl surowicy + 1000 µl

0,9 % NaCl).

−

Podać odpowiednią ilość rozcieńczonej surowicy do kuwet (wg wskazań aparatu).

−

Po włączeniu aparatu umieścić kolejne buteleczki z przeciwciałami w aparacie tak,

by odczytał on kod paskowy na etykiecie; w razie konieczności wprowadzić kod
paskowy ręcznie.

−

Umieścić kuwetę z badaną surowicą w aparacie.

−

Podać do kuwety 500 µl roztworu odpowiedniego przeciwciała.

−

Mieszanie próbek, odczyt i wydruk następują automatycznie w ciągu ~ 30 sek.

−

Sprawdzić uzyskany wynik z normą dla poszczególnych białek.

−

W razie dużych odstępstw od normy powtórzyć pomiar po rozcieńczeniu surowicy

badanej wg wskazań aparatu.

5.

Ocena i interpretacja wyników:

W zależności od ustawienia aparatu uzyskujemy wynik w mg/ml, mg/dl
lub w jednostkach międzynarodowych; uzyskany wynik nie wymaga żadnych dalszych
przeliczeń; należy go odnieść do płci i wieku pacjenta (szczególnie ważne w przypadku
dzieci).

II.

Odczyn immunoenzymatyczny ELISA

1.

Sprzęt i odczynniki:

−

pipety nastawne 1 – 1000 µl

−

probówki 1,5 ml

−

statyw do probówek

−

zestaw ELISA

2.

Materiał badany:

−

surowica ludzka (min. ilość 50 µl, opt. ~ 1 ml)

3.

Zasada metody:

Opakowanie zawiera mikropłytkę ze studzienkami reakcyjnymi opłaszczonymi
antygenem. W pierwszym etapie studzienki reakcyjne inkubuje się z rozcieńczonymi
surowicami pacjentów. W pozytywnych przypadkach przeciwciała klasy IgG wiążą się
z obecnymi na powierzchni studzienki antygenami. Związane przeciwciała wykrywa
się podczas drugiego etapu inkubacji z przeciwciałami skierowanymi przeciwko
ludzkiej IgG znakowanymi enzymem (koniugat enzymatyczny), który następnie
katalizuje reakcję barwną.

9

4.

Wykonanie

−

Przeznaczone do badania próbki surowicy należy rozcieńczyć w stosunku 1:101

w buforze do próbek (np. 10

µl surowicy + 1 ml buforu do próbek). Bufor do

próbek, koniugat enzymatyczny, kalibratory i kontrole gotowe są do użycia. Bufor
do płukania należy rozcieńczyć destylowaną wodą w stosunku 1:10
(np. 5 ml buforu do płukania + 45 ml wody).

−

Inkubacja próbek surowicy: zgodnie ze schematem odpipetować do studzienek

reakcyjnych po 100

µl surowicy kalibracyjnej, pozytywnej i negatywnej surowicy

kontrolnej

oraz

rozcieńczone

surowice

pacjentów.

Inkubować

30 min

w temperaturze pokojowej (+ 18 – 25

°C).

−

Płukanie: opróżnić studzienki reakcyjne i trzykrotnie płukać, za każdym razem

używając 300

µl rozcieńczonego buforu płuczącego. Po każdym płukaniu płytkę

mikrotitracyjną należy odwrócić studzienkami w dół i silnie wytrząsnąć nad
papierem filtracyjnym, aby całkowicie usunąć resztki buforu płuczącego.

−

Inkubacja koniugatu: odpipetować do każdej studzienki reakcyjnej po 100 µl

roztworu koniugatu enzymatycznego (znakowana peroksydazą królicza Ig
anty- ludzka IgG). Inkubować 30 min w temperaturze pokojowej.

−

Płukanie: opróżnić studzienki reakcyjne. Płukać jak wyżej.

−

Inkubacja substratu: Odpipetować do każdej studzienki reakcyjnej po 100 µl

roztworu substratu/chromogenu. Inkubować 15 min. W temperaturze pokojowej;
chronić przed światłem.

−

Przerwanie reakcji: Odpipetować do każdej studzienki reakcyjnej, w tej samej

kolejności i z tą samą szybkością co przy pipetowaniu substratu, po 100

µl

roztworu przerywającego reakcję.

−

Pomiar: fotometryczna ocena intensywności barwy powinna być przeprowadzona

w ciągu 30 min. Od zastopowania reakcji, przy długości fali

λ = 450 nm

i referencyjnej dłogości fali > 620 nm.

5.

Ocena i interpretacja wyników:

−

Odwzorowując w linearnym układzie współrzędnych wartości ekstynkcji 3 surowic

kalibracyjnych i odpowiadające im względne jednostki (RU/ml), a następnie łącząc
naniesione punkty, wykreśla się krzywą wzorcową, z której można odczytać
stężenie przeciwciał w surowicy. Krzywą można wykreślić także za pomocą
programu komputerowego.

−

Do akceptowania i dokumentowania wyników wykorzystuje się program

komputerowy.

−

Górna granica normy (cut-off) testu wynosi 20 jednostek relatywnych (R/ml).

Rekomenduje się następującą interpretację wyników:

< 16 RU/ml

negatywny

16 – 22 RU/ml

graniczny

> 22 RU/ml

pozytywny

10

Ćwiczenie 2

Immunologia komórkowa – badania immunofenotypowe.

Zagadnienia:

pojęcie immunofenotypu, cytofluorymetria przepływowa, cytometr przepływowy,
względna wielkość komórki, względna ziarnistość komórki, średnia intensywność
fluorescencji, zjawisko fluorescencji, markery różnicowania, immunofenotyp krwi
obwodowej

Ocena immunofenotypu:

−

immunofluorescencja bezpośrednia – oznaczanie z pełnej krwi obwodowej

Określenie antygenów tzw. markerów różnicowania (ang. cluster of differentiation;
CD) przy użyciu przeciwciał monoklonalnych, celem zróżnicowania komórek
immunologicznie kompetentnych.

Preparatyka:

Immunofluorescencja bezpośrednia

1.

Sprzęt i odczynniki:

−

cytometr przepływowy

−

zestaw regulowanych mikropipet 10 –1000 µl

−

probówki cytometryczne

−

statyw do probówek

−

tryskawka do PBS

−

zlewka

−

10 × stężony bufor lizujący

−

roztwór PBS pH 7,4

−

przeciwciała monoklonalne znakowane fluorochromem

−

płyn lizujący

−

woda destylowana

2.

Materiał badany:

krew obwodowa pobrana do probówki z antykoagulantem EDTA (min. ilość 500

µl)

3.

Zasada metody:

Określenie przy pomocy cytofluorymetru przepływowego zespołu charakterystycznych
cech antygenowych komórki, które pozwalają zidentyfikować populacje komórek o
istotnym znaczeniu diagnostycznym.

11

4.

Wykonanie

−

Do probówek wprowadzić po 2 µl odpowiednich przeciwciał.

−

Następnie do każdej probówki dodać po 50 µl dokładnie wymieszanej krwi.

−

Inkubować 15 – 20 min w temperaturze pokojowej chroniąc przed światłem.

−

Do każdej probówki dodać po 500 µl roztworu buforu lizującego, rozcieńczonego

wodą destylowaną 1 : 10 i dokładnie wymieszać.

−

Inkubować 10 min w temperaturze pokojowej chroniąc przed światłem.

−

Przerwać lizę dodając do probówki ~2 ml PBS z tryskawki.

−

Wirować probówki 5 min z prędkością 1500 obr./min.

−

Zlać supernatant.

−

Ponownie do probówki dodać PBS i wirować jak wyżej.

−

Zlać supernatant i zawiesić osad w 150 µl PBS, próbki gotowe do akwizycji.

5.

Ocena i interpretacja wyników:

Ocenę wykonanych próbek przeprowadza się przy użyciu cytometru przepływowego
stosując odpowiedni program komputerowy. W trakcie oceny immunofenotypowej
określa się odsetek komórek wykazujących fluorescencję danego fluorochromu.

12

Ćwiczenie 3

Immunologia komórkowa - ocena czynnościowa.

Zagadnienia:

komórki immunologicznie czynne, komórki pomocnicze, metody izolacji komórek,
testy czynnościowe, reakcje nadwrażliwości, testy skórne, metody oceny funkcji
limfocytów, test transformacji blastycznej, metody oceny aktywacji komórek,
mitogeny, testy cytotoksyczne, metody oceny wydzielania cytokin, metody oceny
funkcji komórek żernych, ocena adhezji, ocena zdolności do chemotaksji, zaburzenia
chemotaksji, ocena zdolności do fagocytozy, indeks fagocytarny, zaburzenia
fagocytozy, ocena zdolności do zabijania wewnątrzkomórkowego, wybuch tlenowy,
zaburzenia wybuchu tlenowego, zaburzenia zabijania wewnątrzkomórkowego

1.

Izolacja komórek na gradiencie i oznaczanie żywotności komórek.
−

−

−

−

metoda izolacji w gradientach gęstości

Wykorzystuje różnice w wielkości i ciężarze właściwym poszczególnych komórek.
Stosuje się mieszaniny rozdzielające: Ficoll (Percoll) – Isopaque (Uropolina) –
[metoda Boyum’a], Gradisol (mieszanina Uropoliny i dekstranu) o różnej gęstości.
Krew pobraną na antykoagulant i wymieszaną z PBS nawarstwia się na odpowiedni
gradient i wiruje. Po wirowaniu komórki zbiera się powstałej interfazy.

−

ocena żywotności izolowanych komórek

W celu oceny żywotności komórek wykorzystuje się np. roztwór błękitu trypanu.
Dodanie tego barwnika pozwala ocenić przepuszczalność błony komórkowej, w
teście martwe komórki barwią się na niebiesko. Oceniane komórki liczy się na
kamerze pod mikroskopem świetlnym.

2.

Ocena cyklu komórkowego jednojądrzastych komórek krwi obwodowej.

Do uzyskanych na gradiencie limfcytów dodaje się 100

µl roztworu 0,1% saponiny w

celu permabilizacji komórek. Po inkubacji i wirowaniu do permabilizowanych
komórek dodaje się roztwór jodku propidyny. Wyznakowane jodkiem propidyny
preparaty poddaje się akwizycji przy pomocy cytometru przepływowego. W trakcie
analizy ocenia się poszczególne fazy cyklu komórkowego.

Preparatyka:

I.

Izolacja jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC) w gradiencie
gęstości

1.

Sprzęt i odczynniki:

−

probówki plastikowe 15 ml i 50 ml

−

zestaw regulowanych mikropipet 10 –1000 µl

−

Gradisol L (FICOLL o d = 1,077 g/cm

3

)

−

Bufor PBS

13

2.

Materiał badany:

krew obwodowa pobrana do probówki z antykoagulantem heparyną (min. ilość 500

µl)

3.

Zasada metody:

Na określoną objętość gradientu gęstości nawarstwia się rozcieńczoną PBS krew
obwodową. Po odwirowaniu zbiera się interfazę bogatą w komórki limfoidalne. Na
dnie probówki zbierają się erytrocyty i granulocyty, które przedostały się przez
warstwę Ficollu.

4.

Wykonanie

−

Pobraną na heparynę krew rozcieńczyć w probówce 50 ml roztworem PBS w

stosunku 1 : 3.

−

Do probówki 15 ml wprowadzić Gradisol L i krew zawieszoną w PBS w stosunku

1:1 (3:1) tak aby zachować granicę faz.

−

Wirować probówki w ciągu 20 min, w temperaturze 20°C, przy 2000 obr./min.

−

Zebrać z interfazy pierścień komórek jednojądrzastych.

−

Płukać dwa razy w PBS. Wirować w temperaturze 4°C przy 200 g.

−

Komórki zawiesić w PBS.

5.

Ocena i interpretacja wyników:

Ocenę izolacji PBMC przeprowadza się pod mikroskpem świetlnym.

II.

Liczenie komórek na hemacytometrze oraz określenie żywotności komórek

przy pomocy błękitu trypanu.

1.

Sprzęt i odczynniki:

−

hemacytometr (kamera do liczenia komórek, np. Burkera)

−

zestaw regulowanych mikropipet 10 –1000 µl

−

probówki plastikowe

−

mikroskop świetlny

−

błękit trypanu 0,05 %

2.

Materiał badany:

jednojądrzaste komórki krwi obwodowej izolowane w gradiencie gęstości

3.

Zasada metody:

W wyniku barwienia błękitem trypanu komórki martwe wybarwiają się na niebiesko,
do wnętrza komórek żywych barwnik nie wnika.

14

4.

Wykonanie

−

Zmieszać 10 µl zawiesiny komórek z 10 µl 0,05 % błękitu trypanu (stosunek 1:1).

−

Nałożyć 10 µl mieszaniny komórek i błękitu trypanu na hemacytometr pod

szkiełko nakrywkowe.

−

Umieścić kamerę do liczenia komórek pod mikroskopem świetlnym.

−

Obliczyć ilość żywych (niewybarwionych) i martwych (niebieskich) komórek

zawartych na powierzchni 1 mm

2

. Powtórzyć liczenie dla 3 – 4 różnych pól i

obliczyć średnią liczbę komórek na 1 mm

2

.

−

Po zakończeniu liczenia wyczyścić kamerę i szkiełko nakrywkowe wodą oraz 70%

alkoholem, a następnie osuszyć.

5.

Ocena i interpretacja wyników:

−

Przeliczyć całkowitą liczbę żywych komórek wg wzoru:

# żywych komórek = średnia # żywych komórek

× rozcieńczenie × 2 × 1⋅10

5

(np. # komórek

× 10 ml × 2 × 10 000)

−

Obliczyć % żywych komórek wg wzoru:

komórek

wszystkich

h

policzonyc

komórek

żywych

h

policzonyc

#

#

× 100 = % żywych komórek

III.

Ocena cyklu komórkowego jednojądrzastych komórek krwi obwodowej.

1.

Sprzęt i odczynniki:

−

cytometr przepływowy

−

zestaw regulowanych mikropipet 10 –1000 µl

−

probówki cytometryczne

−

statyw do probówek

−

tryskawka do PBS

−

zlewka

−

roztwór PBS pH 7,4

−

1 % roztwór saponiny w RPMI + 10% surowicy FBS

−

roztwór jodku propidyny 100 µg/ml w PBS

2.

Materiał badany:

−

PBMC uzyskane w trakcie izolacji na gradiencie.

15

3.

Zasada metody:

Jodek propidyny jest barwnikiem fluorescencyjnym, który barwi jądra komórkowe
badanych komórek interkalując z helisą DNA. Barwnik ten emituje czerwone światło
fluorescencji w zakresie możliwym do oceny przy pomocy cytometru przepływowego.

4.

Wykonanie

−

Do badanych komórek dodać 200 µl 1 % roztworu saponiny.

−

Próbkę inkubować 30 min w lodówce.

−

Po tym czasie wirować próbkę 10 min przy prędkości 1500 obr./min w

temperaturze 4

°C.

−

Supernatant odrzucić, a uzyskany osad zawiesić w 150 µl schłodzonego buforu

PBS zawierającego 100

µg/ml jodku propidyny.

−

Próbę inkubowanć 30 min w temperaturze 4°C chroniąc przed światłem (w

lodówce).

−

Po tym czasie próbę poddać akwizycji przy użyciu cytometru przepływowego.

5.

Ocena i interpretacja wyników:

W trakcie przeprowadzanej analizy ocenia się średnią intensywność fluorescencji
(MFI) emitowaną przez jodek propidyny interkalujący z DNA badanych komórek.
Ocenę intensywności fluorescencji przeprowadza się przy pomocy histogramu.

16

Ćwiczenie 4

Wykrywanie białek i kwasów nukleinowych in situ.

METODY IMMUNOMORFOLOGICZNE

Zagadnienia:

sposoby detekcji reakcji antygen-przeciwciało, reakcje immunoenzymatyczne,
reakcja APAAP, reakcja ABC, reakcja LAB, reakcje z użyciem barwnika
fluorescencyjnego, immunofluorescencja wielokolorowa, mikroskopia konfokalna,
mikroskopia wielofotonowa, reakcje z użyciem metali ciężkich, mikroskopia
elektronowa, technologia ImageStream

Reakcje z użyciem barwnika fluorescencyjnego:

−

zamrażanie materiału tkankowego

Szybkie zamrażanie zapobiega powstawaniu niszczących strukturę tkanki dużych
kryształów lodu.

−

reakcja pośredniej immunofluorescencji IMF

Wykrywanie autoprzeciwciał w surowicy w chorobach autoimmunologicznych.

I.

Zamrażanie materiału tkankowego.

1.

Sprzęt i odczynniki:

−

termos z cienkościennym naczyńkiem metalowym

−

penseta

−

worek foliowy

−

mieszanina zamrażająca (suchy lód + aceton)

−

płyn oziębiający (eter naftowy)

−

płyn o dużej gęstości zamrażany razem z tkanką (tzw. Tissue-tek)

2.

Materiał badany:

−

blok tkankowy

3.

Zasada metody:

Wiele antygenów w przebiegu rutynowego utrwalania i zatapiania w parafinie bloków
tkankowych ulega zniszczeniu. W związku z tym materiał tkankowy przewidziany do
rekcji immunomorfologicznych należy w większości przypadków przygotowywać w
osobny sposób, zwykle przez zamrażanie. Zamrażanie tego materiału powinno
odbywać się jak najkrótszym czasie, aby zapobiec tworzeniu się w tkance kryształów
lodu, które mogą uszkodzić fizycznie tkankę.

17

4.

Wykonanie

−

Zamrażany blok tkankowy zanurza się w mieszaninie zamrażającej przygotowanej

wcześniej w termosie

−

Po kilku-kilkunastu sekundach następuje wyraźne i trwałe zblednięcie tkanki,

ś

wiadczące o zamrożeniu materiału.

−

Zamrożony blok tkankowy, przy pomocy pensety wyjmuje się z mieszaniny

zamrażającej, umieszcza w opisanym woreczku foliowym i przechowuje w
zamrażarce (opt.

− 70°C).

II.

Oznaczanie autoprzeciwciał metodą immunofluorescencji pośredniej.

1.

Sprzęt i odczynniki:

−

szkiełka z preparatami wątroby szczura (substrat antygenowy dla wykrywanych

autoprzeciwciał)

−

kriostat

−

odtłuszczone w alkoholu szkiełka nakrywkowe

−

pipety jednorazowe i regulowane

−

probówki plastikowe

−

statyw do probówek

−

płuczka szklana

−

komora wilgotna

−

bufor PBS o pH 7,6

−

przeciwciała królicze anty ludzkie IgG, A, M znakowane FITC

−

surowica kontrolna

−

90% buforowana gliceryna

−

błękit Evansa

2.

Materiał badany:

−

surowica badana w ilości ~ 2 ml.

3.

Zasada metody:

Autoprzeciwciała obecne w badanych surowicach przyłączają się w pierwszym etapie
do substratu antygenowego (antygenów w skrawkach wątroby szczurzej) na szkiełkach
podstawowych. W drugim etapie następuje detekcja autoprzeciwciał przy pomocy
wyznakowanej fluoresceiną antyglobuliny.

18

4.

Wykonanie

−

wyjąć szkiełka z antygenami z lodówki i doprowadzić je do temperatury pokojowej

pod wentylatorem.

−

przygotować rozcieńczenia badanych surowic w roztworze PBS (rozc. od 1:80)

−

nałożyć po 25 µl surowic (kontrolnych i badanych) na szkiełko ze skrawkami.

−

inkubować 30 min, przepłukać w PBS-Tween, płukać w płuczce 3 × 5 min.

−

nałożyć 20 µl anty-ludzkiej IgG, A, M/FITC na szkiełko.

−

inkubować 30 min, przepłukać w PBS-Tween, płukać w płuczce 3 × 5 min.

−

zamknąć w glicerolu/PBS pod szkiełkiem nakrywkowym

−

do ostatniego płukania można dodać błękit Evansa (10 kropli na 150 ml PBS-

Tween)

5.

Ocena i interpretacja wyników:

Ocenę preparatów przeprowadza się pod mikroskopem fluorescencyjnym. Za reakcję
dodatnią uznaje się obecność żółtozielonej fluorescencji (w odpowiednim substracie
komórkowym w zależności od rodzaju autoprzeciwciał).

19

LITERATURA:

1.

Żeromski J. Immunologia dla studentów wydziału lekarskiego. Wyd. AM, Poznań

2008;

2.

Żeromski J. Metody immunologiczne. Przewodnik do ćwiczeń z immunologii dla

studentów Wydziału Lekarskiego. Wyd. AM, Poznań 1997;

3.

Kątnik-Prastowska I. Immunochemia w biologii medycznej. Metody Laboratoryjne.

PWN, Warszawa 2009;

4.

Dembińska-Kieć A., Naskalski J.W. Diagnostyka laboratoryjna z elementami

biochemii klinicznej. Podręcznik dla studentów medycyny. Elsevier Urban&Partner,
Wrocław 2009

5.

Luft S. Metody diagnostyki serologicznej w reumatologii. PWN, Warszawa 1996;

6.

Roitt I., Brostoff J., Male D. Immunologia. Elsevier Urban & Partner, Wrocław 2008;

7.

Gołąb J., Jakóbisiak M., Lasek W. Stokłosa T. Immunologia. PWN, Warszawa 2008;

8.

Ptak W., Ptak M., Szczepanik M. Podstawy immunologii. PZWL, Warszawa 2009;

9.

Zeman K. Zaburzenia odporności u dzieci. PZWL, Warszawa 2002;

10.

Zabel M. Immunocytochemia. PWN, Warszawa 1999;

11.

Zuba-Surma E.K., Kucia M., Ratajczak M.Z. Post. Biol. Kom. 2007; 34(2): 361- 376.

12.

Porcedury ANA Profile 3 EUROLINE i Anty- Borrelia plus VlsE (IgG) ELISA firmy

EUROIMMUN