2013

CHROMATOGRAFIA KOLUMNOWA I CIENKOWARSTWOWA

Chromatografia (z gr. chromatos - barwa + grapho - piszę) to analityczna lub

preparatywna metoda rozdziału związków chemicznych wykorzystująca różnicę w

powinowactwie składników rozdzielonej mieszaniny do dwóch faz: ruchomej i stacjonarnej.

W zależności od stosowanych technik, natury powinowactwa związku do obu faz i rodzaju

fazy ruchomej (gaz, ciecz) istnieje bardzo dużo rodzajów chromatografii; omawiane

ć

wiczenie

ma

na

celu

zaznajomienie

z

dwoma

podstawowymi

technikami

chromatograficznymi stosowanymi w laboratorium: cieczową chromatografią kolumnową i

chromatografią cienkowarstwową.

Rozdział mieszaniny barwników metodą chromatografii kolumnowej

Chromatografię kolumnową prowadzi się w kolumnach chromatograficznych -

najczęściej mają one postać szklanej rurki zakończonej kranikiem (Rys. 16b). Kolumnę

wypełnia się fazą stacjonarną (adsorbentem), którą jest najczęściej tlenek glinu, żel

krzemionkowy, celuloza itp. Fazę mobilną stanowi rozpuszczalnik lub mieszanina

rozpuszczalników zwanych eluentami.

Rozdzielaną mieszaninę nanosi się na wypełnienie kolumny chromatograficznej, a

następnie wymywa (inaczej eluuje) składniki z kolumny za pomocą odpowiednich eluentów.

W rozpatrywanym na ćwiczeniach układzie chromatograficznym faza stacjonarna jest

bardziej polarna niż faza ruchoma, zatem związki o mniejszej polarności opuszczą kolumnę

szybciej – mają mniejsze powinowactwo do fazy stacjonarnej. Następuje oddzielenie

składników mieszaniny.

Cel ćwiczenia

Celem

ć

wiczenia

jest

przeprowadzenie

rozdziału

mieszaniny

barwników

syntetycznych na poszczególne składniki metodą chromatografii kolumnowej.

Substancjami, które wchodzą w skład analizowanej mieszaniny są (Rys. 16a):

•

błękit metylenowy (chlorek 3,7-bis(dimetyloamino)feno-5-tioazynowy)

•

oranż metylowy (4-N,N-dimetyloaminoazobenzenosulfonian sodu)

Poszczególne frakcje wypływające z kolumny zbiera się do osobnych kolbek stożkowych.

2013

Rys. 16 a) Wzory rozdzielanych barwników: 1-błękit metylenowy,

2-oranż metylowy b) Kolumna chromatograficzna z wypełnieniem

Przebieg ćwiczenia:

1. Na dno kolumny chromatograficznej wprowadza się mały kłębek waty, a następnie

kolumnę wypełnia się tlenkiem glinu na wysokość ok. 10 cm. Wypełnienie przemywa

się eluentem I (etanolem) przy otwartym kraniku wlewając go za pomocą cylindra.

Eluent grawitacyjnie spływa w dół kolumny zwilżając wypełnienie. Kran zamyka się,

gdy eluent znajdzie się kilka milimetrów nad poziomem tlenku glinu. Nie wolno dopuścić

do "zapowietrzenia" kolumny!

2. Następnie bardzo ostrożnie za pomocą pipety wprowadza się po wewnętrznej ściance

kolumny ok. 1 cm

3

roztworu przeznaczonego do rozdziału. Otwiera się kran kolumny i

gdy roztwór barwnika zostanie zaadsorbowany w górnej części wypełnienia, wkrapla się

pipetą po ściance kilka mililitrów eluentu I. Gdy pierwsza porcja eluentu wsiąknie w

wypełnienie, wlewa się pipetą kolejną porcję eluentu I (ok. 10 cm

3

) i rozpoczyna

wymywanie pierwszego z barwników, zbierając przesącz do małej kolbki stożkowej.

3. Gdy zebrane zostaną frakcje zawierające pierwszy z barwników, należy zmienić eluent

na

eluent II - 1M NaOH (pamiętać o ZAŁOŻENIU OKULARÓW

OCHRONNYCH!!!) oraz odbieralnik.

4. Chromatografię kończy się w momencie wymycia z kolumny drugiego barwnika.

S

N

N

N

Cl

N

N

N

S

O

O

O

Na

----

+

----

+

a)

1

2

2013

W sprawozdaniu:

1. Narysować i opisać poszczególne elementy kolumny chromatograficznej. Podać, jaka

substancja stanowi fazę ruchomą, a jaka fazę stacjonarną w omawianym układzie

chromatograficznym.

2. Podać, który z rozdzielanych barwników ma mniejszą, a który większą polarność.

Odpowiedź uzasadnić.

Analiza jakościowa mieszaniny związków steroidowych metodą chromatografii

cienkowarstwowej. Dobór warunków podziału.

Chromatografia cienkowarstwowa (TLC - z ang. Thin Layer Chromatography) polega

na rozdziale analizowanej mieszaniny na aluminiowej płytce pokrytej adsorbentem

stanowiącym fazę stacjonarną, najczęściej żelem krzemionkowym. Fazę ruchomą stanowi

mieszanina rozpuszczalników organicznych w różnych proporcjach. W rozpatrywanym na

ć

wiczeniu układzie chromatograficznym faza ruchoma jest mniej polarna od fazy

stacjonarnej. Związek lub mieszaninę związków nanosi się na płytkę, którą następnie

umieszcza się w zamkniętym naczyniu zwanym komorą chromatograficzną zawierającym

niewielką ilość eluentu. Eluent sukcesywnie zwilża płytkę, wymywając składniki mieszaniny

z linii startu – następuje tzw. rozwijanie chromatogramu. Związek mniej polarny zostaje

wymyty wcześniej i zaadsorbuje się w wyżej położonym miejscu płytki aniżeli związek o

większej polarności i tym samym większym powinowactwie do fazy stacjonarnej. W ten

sposób następuje rozdział składników mieszaniny na płytce; ich obecność (wizualizację

czyli wywołanie chromatogramu) stwierdza się spryskując płytkę odpowiednim

odczynnikiem (zwanym wywoływaczem), który z analizowanymi związkami daje reakcję

barwną związki obserwujemy wtedy na płytce w postaci plamek (Rys. 17). Na podstawie

porównania na płytce wysokości plamek pochodzących od substancji wzorcowych oraz od

składników mieszaniny, ustala się skład analizowanej próbki (analiza jakościowa).

Wartością charakterystyczną dla danego związku w danych warunkach chromatograficznych

(faza stacjonarna, eluent) jest współczynnik opóźnienia R

f

(z ang. retardation factor). Jest on

zdefiniowany jako stosunek drogi, jaką na płytce przebył dany związek (a), do drogi, jaką w

tym czasie przebyło czoło rozpuszczalnika (b).

2013

Rys. 17 Płytka chromatograficzna (Źródło:

http://chorg.p.lodz.pl/preparatyka/tlc.html

)

Cel ćwiczenia

Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie analizy jakościowej roztworu mieszaniny

związków steroidowych metodą chromatografii cienkowarstwowej oraz dobór optymalnych

warunków podziału.

Substancjami, które wchodzą w skład analizowanej mieszaniny są:

• cholesterol

• octan cholesterolu

Przebieg ćwiczenia:

1. Przygotowanie płytki chromatograficznej.

Na płytce chromatograficznej (Rys. 17) zaznacza się delikatnie ołówkiem w

odległości ok. 1 cm od jej krótszej krawędzi tzw. linię startu (s). Na linii startu zaznacza

się krzyżykiem i oznacza literką w równych odległościach trzy punkty (co ok. 7 mm), w

których naniesione zostaną substancje wzorcowe i badana mieszanina. Przy pomocy

włosowatych kapilar (każda do innego związku!) nanosi się roztwory wzorcowe i

roztwór badany, tak aby plamki miały nie więcej niż 2 mm średnicy. Analizowany

roztwór należy umieścić w środkowym miejscu, dotykając jeden raz kapilarą

powierzchnię płytki. Roztwory wzorcowe nanosi się w identyczny sposób po bokach,

każdy raz w danym miejscu. Należy pamiętać, aby nie dopuścić do uszkodzenia

powierzchni adsorbentu, a plamki nie były zbyt duże, ani położone zbyt blisko siebie.

W żadnym momencie nie można dotknąć powierzchni płytki palcami! Każdy zespół

przygotowuje trzy płytki chromatograficzne, które będą rozwijane w trzech różnych

eluentach.

2. Rozwijanie chromatogramu w trzech różnych eluentach.

2013

Do komór chromatograficznych wlewa się niewielką ilość odpowiedniego eluentu

tak, aby po włożeniu płytki poziom eluentu znajdował się poniżej linii startu (poziom s na

rys. 17) na płytce.

Komora 1 – eluent: heksan : aceton, 10:1

Komora 2 – eluent: heksan : aceton, 10:4

Komora 3 – eluent: heksan : aceton, 10:10

Każdą z płytek umieszcza się za pomocą pincety (pęsety) w komorze z odpowiednim

eluentem. Płytkę wstawia się do komory pionowo - linią startową do dołu i zakrywa się

pokrywką. Należy pamiętać aby poziom rozpuszczalnika znajdował się poniżej linii

startowej. Po umieszczeniu płytki w komorze nie wolno nią poruszać, do czasu

zakończenia rozwijania! Gdy rozpuszczalnik osiągnie wysokość ok. 0,5 cm od górnej

krawędzi płytki (poziom f na rys. 17), wyjmuje się ją z komory, zaznacza ołówkiem

miejsce, do którego dotarł rozpuszczalnik (tzw. czoło rozpuszczalnika) i pozostawia do

wyschnięcia (odparowania rozpuszczalnika).

3. Wywołanie chromatogramu.

Aby wykryć plamki pochodzące od cholesterolu i octanu cholesterolu (związki te są

bezbarwne) płytkę spryskuje się odczynnikiem, który daje barwne reakcje z

wywoływanymi substancjami. Wywoływacz, który zawiera stężony H

2

SO

4

znajduje się

w spryskiwaczu umieszczonym pod dygestorium. Po spryskaniu płytki

wywoływaczem umieszcza się ją pod lampą promiennikową i wygrzewa do czasu, gdy

na płytce pojawią się barwne plamy pochodzące od analizowanych substancji

organicznych.

W sprawozdaniu podać:

1.

Podaj wzory strukturalne związków rozdzielanych na płytce.

2.

Co jest odpowiednikiem tlenku glinu oraz etanolu i 1M NaOH (użytych w

chromatografii kolumnowej) w poznanej metodzie TLC ?

3.

Obliczyć wartości R

f

dla analizowanych związków w poszczególnych eluentach i

uzupełnić poniższą tabelę.

2013

Wartości współczynników R

f

rozdzielanych związków w różnych eluentach

Eluent

cholesterol

octan

cholesterolu

heksan:aceton 10:1

heksan:aceton 10:4

heksan:aceton 10:10

4.

Odpowiedzieć na pytanie, co jest miarą efektywności rozdziału dwóch związków

metodą chromatografii kolumnowej w określonym eluencie ?

5.

Wiedząc, że aceton jest bardziej polarny niż heksan i wykorzystując dane z powyższej

tabeli, sformułować wniosek o zależności efektywności rozdziału analizowanych

związków od polarności użytego eluentu.

6.

Który z zastosowanych eluentów okazał się najbardziej efektywny w procesie rozdziału

cholesterolu i octanu cholesterolu. Odpowiedź uzasadnić.