2013
CHROMATOGRAFIA KOLUMNOWA I CIENKOWARSTWOWA
Chromatografia (z gr. chromatos - barwa + grapho - piszę) to analityczna lub
preparatywna metoda rozdziału związków chemicznych wykorzystująca różnicę w
powinowactwie składników rozdzielonej mieszaniny do dwóch faz: ruchomej i stacjonarnej.
W zależności od stosowanych technik, natury powinowactwa związku do obu faz i rodzaju
fazy ruchomej (gaz, ciecz) istnieje bardzo dużo rodzajów chromatografii; omawiane
ć
wiczenie
ma
na
celu
zaznajomienie
z
dwoma
podstawowymi
technikami
chromatograficznymi stosowanymi w laboratorium: cieczową chromatografią kolumnową i
chromatografią cienkowarstwową.
Rozdział mieszaniny barwników metodą chromatografii kolumnowej
Chromatografię kolumnową prowadzi się w kolumnach chromatograficznych -
najczęściej mają one postać szklanej rurki zakończonej kranikiem (Rys. 16b). Kolumnę
wypełnia się fazą stacjonarną (adsorbentem), którą jest najczęściej tlenek glinu, żel
krzemionkowy, celuloza itp. Fazę mobilną stanowi rozpuszczalnik lub mieszanina
rozpuszczalników zwanych eluentami.
Rozdzielaną mieszaninę nanosi się na wypełnienie kolumny chromatograficznej, a
następnie wymywa (inaczej eluuje) składniki z kolumny za pomocą odpowiednich eluentów.
W rozpatrywanym na ćwiczeniach układzie chromatograficznym faza stacjonarna jest
bardziej polarna niż faza ruchoma, zatem związki o mniejszej polarności opuszczą kolumnę
szybciej – mają mniejsze powinowactwo do fazy stacjonarnej. Następuje oddzielenie
składników mieszaniny.
Cel ćwiczenia
Celem
ć
wiczenia
jest
przeprowadzenie
rozdziału
mieszaniny
barwników
syntetycznych na poszczególne składniki metodą chromatografii kolumnowej.
Substancjami, które wchodzą w skład analizowanej mieszaniny są (Rys. 16a):
•
błękit metylenowy (chlorek 3,7-bis(dimetyloamino)feno-5-tioazynowy)
•
oranż metylowy (4-N,N-dimetyloaminoazobenzenosulfonian sodu)
Poszczególne frakcje wypływające z kolumny zbiera się do osobnych kolbek stożkowych.
2013
Rys. 16 a) Wzory rozdzielanych barwników: 1-błękit metylenowy,
2-oranż metylowy b) Kolumna chromatograficzna z wypełnieniem
Przebieg ćwiczenia:
1. Na dno kolumny chromatograficznej wprowadza się mały kłębek waty, a następnie
kolumnę wypełnia się tlenkiem glinu na wysokość ok. 10 cm. Wypełnienie przemywa
się eluentem I (etanolem) przy otwartym kraniku wlewając go za pomocą cylindra.
Eluent grawitacyjnie spływa w dół kolumny zwilżając wypełnienie. Kran zamyka się,
gdy eluent znajdzie się kilka milimetrów nad poziomem tlenku glinu. Nie wolno dopuścić
do "zapowietrzenia" kolumny!
2. Następnie bardzo ostrożnie za pomocą pipety wprowadza się po wewnętrznej ściance
kolumny ok. 1 cm
3
roztworu przeznaczonego do rozdziału. Otwiera się kran kolumny i
gdy roztwór barwnika zostanie zaadsorbowany w górnej części wypełnienia, wkrapla się
pipetą po ściance kilka mililitrów eluentu I. Gdy pierwsza porcja eluentu wsiąknie w
wypełnienie, wlewa się pipetą kolejną porcję eluentu I (ok. 10 cm
3
) i rozpoczyna
wymywanie pierwszego z barwników, zbierając przesącz do małej kolbki stożkowej.
3. Gdy zebrane zostaną frakcje zawierające pierwszy z barwników, należy zmienić eluent
na
eluent II - 1M NaOH (pamiętać o ZAŁOŻENIU OKULARÓW
OCHRONNYCH!!!) oraz odbieralnik.
4. Chromatografię kończy się w momencie wymycia z kolumny drugiego barwnika.
S
N
N
N
Cl
N
N
N
S
O
O
O
Na
----
+
----
+
a)
1
2
2013
W sprawozdaniu:
1. Narysować i opisać poszczególne elementy kolumny chromatograficznej. Podać, jaka
substancja stanowi fazę ruchomą, a jaka fazę stacjonarną w omawianym układzie
chromatograficznym.
2. Podać, który z rozdzielanych barwników ma mniejszą, a który większą polarność.
Odpowiedź uzasadnić.
Analiza jakościowa mieszaniny związków steroidowych metodą chromatografii
cienkowarstwowej. Dobór warunków podziału.
Chromatografia cienkowarstwowa (TLC - z ang. Thin Layer Chromatography) polega
na rozdziale analizowanej mieszaniny na aluminiowej płytce pokrytej adsorbentem
stanowiącym fazę stacjonarną, najczęściej żelem krzemionkowym. Fazę ruchomą stanowi
mieszanina rozpuszczalników organicznych w różnych proporcjach. W rozpatrywanym na
ć
wiczeniu układzie chromatograficznym faza ruchoma jest mniej polarna od fazy
stacjonarnej. Związek lub mieszaninę związków nanosi się na płytkę, którą następnie
umieszcza się w zamkniętym naczyniu zwanym komorą chromatograficzną zawierającym
niewielką ilość eluentu. Eluent sukcesywnie zwilża płytkę, wymywając składniki mieszaniny
z linii startu – następuje tzw. rozwijanie chromatogramu. Związek mniej polarny zostaje
wymyty wcześniej i zaadsorbuje się w wyżej położonym miejscu płytki aniżeli związek o
większej polarności i tym samym większym powinowactwie do fazy stacjonarnej. W ten
sposób następuje rozdział składników mieszaniny na płytce; ich obecność (wizualizację
czyli wywołanie chromatogramu) stwierdza się spryskując płytkę odpowiednim
odczynnikiem (zwanym wywoływaczem), który z analizowanymi związkami daje reakcję
barwną związki obserwujemy wtedy na płytce w postaci plamek (Rys. 17). Na podstawie
porównania na płytce wysokości plamek pochodzących od substancji wzorcowych oraz od
składników mieszaniny, ustala się skład analizowanej próbki (analiza jakościowa).
Wartością charakterystyczną dla danego związku w danych warunkach chromatograficznych
(faza stacjonarna, eluent) jest współczynnik opóźnienia R
f
(z ang. retardation factor). Jest on
zdefiniowany jako stosunek drogi, jaką na płytce przebył dany związek (a), do drogi, jaką w
tym czasie przebyło czoło rozpuszczalnika (b).
2013
Rys. 17 Płytka chromatograficzna (Źródło:
http://chorg.p.lodz.pl/preparatyka/tlc.html
)
Cel ćwiczenia
Celem ćwiczenia jest przeprowadzenie analizy jakościowej roztworu mieszaniny
związków steroidowych metodą chromatografii cienkowarstwowej oraz dobór optymalnych
warunków podziału.
Substancjami, które wchodzą w skład analizowanej mieszaniny są:
• cholesterol
• octan cholesterolu
Przebieg ćwiczenia:
1. Przygotowanie płytki chromatograficznej.
Na płytce chromatograficznej (Rys. 17) zaznacza się delikatnie ołówkiem w
odległości ok. 1 cm od jej krótszej krawędzi tzw. linię startu (s). Na linii startu zaznacza
się krzyżykiem i oznacza literką w równych odległościach trzy punkty (co ok. 7 mm), w
których naniesione zostaną substancje wzorcowe i badana mieszanina. Przy pomocy
włosowatych kapilar (każda do innego związku!) nanosi się roztwory wzorcowe i
roztwór badany, tak aby plamki miały nie więcej niż 2 mm średnicy. Analizowany
roztwór należy umieścić w środkowym miejscu, dotykając jeden raz kapilarą
powierzchnię płytki. Roztwory wzorcowe nanosi się w identyczny sposób po bokach,
każdy raz w danym miejscu. Należy pamiętać, aby nie dopuścić do uszkodzenia
powierzchni adsorbentu, a plamki nie były zbyt duże, ani położone zbyt blisko siebie.
W żadnym momencie nie można dotknąć powierzchni płytki palcami! Każdy zespół
przygotowuje trzy płytki chromatograficzne, które będą rozwijane w trzech różnych
eluentach.
2. Rozwijanie chromatogramu w trzech różnych eluentach.
2013
Do komór chromatograficznych wlewa się niewielką ilość odpowiedniego eluentu
tak, aby po włożeniu płytki poziom eluentu znajdował się poniżej linii startu (poziom s na
rys. 17) na płytce.
Komora 1 – eluent: heksan : aceton, 10:1
Komora 2 – eluent: heksan : aceton, 10:4
Komora 3 – eluent: heksan : aceton, 10:10
Każdą z płytek umieszcza się za pomocą pincety (pęsety) w komorze z odpowiednim
eluentem. Płytkę wstawia się do komory pionowo - linią startową do dołu i zakrywa się
pokrywką. Należy pamiętać aby poziom rozpuszczalnika znajdował się poniżej linii
startowej. Po umieszczeniu płytki w komorze nie wolno nią poruszać, do czasu
zakończenia rozwijania! Gdy rozpuszczalnik osiągnie wysokość ok. 0,5 cm od górnej
krawędzi płytki (poziom f na rys. 17), wyjmuje się ją z komory, zaznacza ołówkiem
miejsce, do którego dotarł rozpuszczalnik (tzw. czoło rozpuszczalnika) i pozostawia do
wyschnięcia (odparowania rozpuszczalnika).
3. Wywołanie chromatogramu.
Aby wykryć plamki pochodzące od cholesterolu i octanu cholesterolu (związki te są
bezbarwne) płytkę spryskuje się odczynnikiem, który daje barwne reakcje z
wywoływanymi substancjami. Wywoływacz, który zawiera stężony H
2
SO
4
znajduje się
w spryskiwaczu umieszczonym pod dygestorium. Po spryskaniu płytki
wywoływaczem umieszcza się ją pod lampą promiennikową i wygrzewa do czasu, gdy
na płytce pojawią się barwne plamy pochodzące od analizowanych substancji
organicznych.
W sprawozdaniu podać:
1.
Podaj wzory strukturalne związków rozdzielanych na płytce.
2.
Co jest odpowiednikiem tlenku glinu oraz etanolu i 1M NaOH (użytych w
chromatografii kolumnowej) w poznanej metodzie TLC ?
3.
Obliczyć wartości R
f
dla analizowanych związków w poszczególnych eluentach i
uzupełnić poniższą tabelę.
2013
Wartości współczynników R
f
rozdzielanych związków w różnych eluentach
Eluent
cholesterol
octan
cholesterolu
heksan:aceton 10:1
heksan:aceton 10:4
heksan:aceton 10:10
4.
Odpowiedzieć na pytanie, co jest miarą efektywności rozdziału dwóch związków
metodą chromatografii kolumnowej w określonym eluencie ?
5.
Wiedząc, że aceton jest bardziej polarny niż heksan i wykorzystując dane z powyższej
tabeli, sformułować wniosek o zależności efektywności rozdziału analizowanych
związków od polarności użytego eluentu.
6.
Który z zastosowanych eluentów okazał się najbardziej efektywny w procesie rozdziału
cholesterolu i octanu cholesterolu. Odpowiedź uzasadnić.