Podstawy cytometrii - oznaczanie
subpopulacji komórek
1
Przeciwciała (Ab)
- białka należące do frakcji gammaglobulin
syntetyzowane przez komórki plazmatyczne (pobudzone limfocyty
B) w przebiegu odpowiedzi immunologicznej, swoiste dla
rozpoznawanego Ag.
Przeciwciała monoklonalne (mAb)
- skierowane przeciwko jednej
determinancie antygenowej (determinanta=epitop, miejsce
wiązania Ag z Ab)
Schemat przeciwciała:
1. fragment wiążący antygen
2. region Fab
3. region Fc
niebieskie
- łańcuchy ciężkie
ż
ółte
- łańcuchy lekkie
ciemnoniebieskie/żółte - regiony zmienne
jasnoniebieskie/żółte - regiony stałe
szare
- mostki dwusiarczkowe
CYTOMETRIA PRZEPŁYWOWA
Odgrywa zasadniczą rolę w fenotypowaniu komórek
immunokompetentnych człowieka.
Jest to możliwe dzięki szerokiemu panelowi dostępnych
przeciwciał monoklonalnych (mAb) skierowanych
przeciwko obecnym na komórkach Ag różnicowania, CD
(cluster of differentiation), którymi znakuje się
struktury w zawiesinie komórek poddawanych analizie.
Ocena subpopulacji komórek tą techniką jest obiektywną
i powtarzalną metodą diagnostyczną.
CYTOMETR PRZEPŁYWOWY
CYTOMETRIA PRZEPŁYWOWA
Analiza wieloparametrowa jednej
komórki w aparacie, w momencie
gdy ruch komórek w cieczy jest
uporz
ą
dkowany
ִ
komórki si
ę
nie zlepi
ą
, b
ę
d
ą
oddzielne w słupie
ִ
na pojedyncz
ą
komórk
ę
pada
laser w komorze pomiarowej
PRZEPŁYW KOMÓREK W APARACIE
tu nakładamy
próbkę
fluorescencja
fluorescencja
promie
promie
ń
ń
lasera
lasera
ciecz osłaniająca
Purdue University Cytometry
Laboratories
MIERZONE PARAMETRY
Podstawowym pomiarem jest rejestrowanie światła
rozproszonego na komórce oraz światła wysyłanego przez
wzbudzony fluorochrom. Detektory mierzą światło rozproszone.
FSC (forward scatter)- pomiar światła rozproszonego, mierzonego w
przedłużeniu promienia lasera, światło pada prawie pod katem 0⁰-
charakteryzuje wielkość komórki
SSC (side scatter)- pomiar światła rozproszonego, mierzone pod kątem
90⁰- pozwala na analizę ziarnistości komórki
Oprócz parametrów opisujących rozproszenie światła, istotnym pomiarem
jest ocena intensywności fluorescencji FL (FL1, FL2…). Pomiar
fluorescencji zależy od autofluorescencji komórek oraz użytych fluorochromów.
Podstawy cytometrii - oznaczanie
subpopulacji komórek
2
BUDOWA CYTOMETRU
układ transportu cieczy powiązany z układem
powietrznym
układ optyczny: laser argonowy, filtry przepuszczające
promienie światła tylko o określonej długości
układ elektroniki: fotopowielacze, wzmaczniacze,
przetwornik analogowo- cyfrowy
DETEKTORY FLUORESCENCJI
laser
F
re
q
Fluorescence
detektor
przedni
detektory fluorescencji
(PMT3, PMT4 etc.)
STRUKTURALNE
STRUKTURALNE
rozmiar
rozmiar
kszta
kszta
ł
ł
t
t
cytoplazmatyczna ziarnisto
cytoplazmatyczna ziarnisto
ść
ść
zawarto
zawarto
ść
ść
barwnika np.: hemoglobina, barwniki
barwnika np.: hemoglobina, barwniki
fotosyntetyczne, porfiryny
fotosyntetyczne, porfiryny
aminokwasy fluoryzuj
aminokwasy fluoryzuj
ą
ą
ce w bia
ce w bia
ł
ł
kach
kach
np.:tryptofan
np.:tryptofan
,
,
tyrozyna
tyrozyna
zawarto
zawarto
ść
ść
DNA, RNA, wszystkich bia
DNA, RNA, wszystkich bia
ł
ł
ek, lipid
ek, lipid
ó
ó
w,
w,
cukr
cukr
ó
ó
w powierzchniowych, antygen
w powierzchniowych, antygen
ó
ó
w
w
OCENIANE PARAMETRY
FUNKCJONALNE
ł
ł
adunek powierzchniowy
adunek powierzchniowy
ekspresja receptor
ekspresja receptor
ó
ó
w powierzchniowych
w powierzchniowych
integralno
integralno
ść
ść
b
b
ł
ł
ony (
ony (
ż
ż
ywotno
ywotno
ść
ść
)
)
aktywno
aktywno
ść
ść
endocytarna
endocytarna
organizacja
organizacja
cytoszkieletu
cytoszkieletu
aktywno
aktywno
ść
ść
enzym
enzym
ó
ó
w
w
OCENIANE PARAMETRY
Zalety cytometrii:
- szybki, obiektywny i zautomatyzowany pomiar pojedynczych
komórek w du
ż
ych populacjach komórkowych, z du
żą
powtarzalno
ś
ci
ą
- wykrywanie
ś
ladowych subpopulacji
- równoległa ocena kilku parametrów
- ilo
ś
ciowa i jako
ś
ciowa ocena stanu układu immunologicznego,
poszczególnych populacji
Wady:
- niemo
ż
no
ść
korelacji wyników pomiarów fluorescencji z morfologi
ą
komórek
- technika przygotowania materiału do bada
ń
, wymagaj
ą
ca izolacji
z tkanki pojedynczych komórek
- wysoki koszt bada
ń
CYTOMETRIA PRZEPŁYWOWA
FL1 (izotiocyjanian
fluoresceiny FITC)
F
L
2
(
fi
k
o
e
ry
tr
y
n
a
PE)
Schematyczny rozkład leukocytów
na cytogramie FFC/SSC
Podstawy cytometrii - oznaczanie
subpopulacji komórek
3
CD
Występowanie
Funkcja
CD2
Limfocyty T, tymocyty, komórki
NK
Adhezja T do APC,
kostymulacja
CD2R
Aktywowane limfocyty, NK
Aktywacja lim focytów T
CD3
Limfocyty T
Przekazywanie sygnału do
lim focytów T
CD4
Limfocyty T pomocniczne (Th),
monocyty (Mo), makrofagi (MØ),
tymocyty
Koaktywacja lim focytów
Th
CD8
Limfocyty T cytotoksyczne (CTL),
tymocyty
Koaktywacja lim focytów
CTL
CD14
Monocyty (Mo), granulocyty,
kom órki Langerhansa, makrofagi
(MØ)
Białko wiąŜące LPS
CD19
Limocyty B, komórki pre-B
Aktywacja i proliferacja
lim ofocytów B
CD20
Limocyty B, komórki pre-B
Kanał Ca
2+
, regulacja,
aktywacja i proliferacja
lim focytów B
CD45
Leukocyty
Fosfataza tyrozynowa
biorąca udział w
przekazywaniu sygnałów
CD45RO
Aktywowane limfocyty T,
monocyty, makrofagi, granulocyty,
tymocyty
Markery limfocytów T
pamięci immunologicznej
Antygeny ró
ż
nicowania CD
SUBPOPULACJE KOMÓREK
JEDNOJ
Ą
DROWYCH KRWI OBWODOWEJ
Podstawowe markery i cechy fenotypowe linii komórkowych
CD45
- marker wszystkich leukocytów
CD19, CD20
- markery limfocytów B
CD3, CD7
- markery limfocytów T
CD4
- marker limfocytów T pomocniczych
CD8
- marker limfocytów T supresorowych
CD56
- marker komórek NK
CD25, CD71, CD69 - markery aktywacji limfocytów
CD13, CD33
- markery ró
ż
nicowania mieloidalnego
CD15
- marker granulocytów
CD14
- marker monocytów
CD34
- podstawowy marker komórek progenitorowych
(macierzystych)
MONOCYTY
ִ
mAb: CD45-FITC/CD14-PE
ִ
stanowi
ą
2-4% wszystkich leukocytów
ִ
maj
ą
zdolno
ść
do ruchu pe
ł
zakowatego i mog
ą
wydostawa
ć
si
ę
ze
ś
wiat
ł
a naczy
ń
krwiono
ś
nych
ִ
po przej
ś
ciu do tkanek dojrzewaj
ą
i przekształcaj
ą
si
ę
w MØ
ִ
komórki
ż
erne
ż
yj
ą
ce oko
ł
o 4 dni
SUBPOPULACJE KOMÓREK
JEDNOJ
Ą
DROWYCH KRWI OBWODOWEJ
LIMFOCYTY B
ִ
mAb: CD2-FITC/CD19-PE
ִ
postają i dojrzewają w szpiku
ִ
bardzo dużo limfocytów B występuje w czasie infekcji
bakteryjnych
ִ
wiążą Ag za pomocą receptora BCR, następnie przetwarzają go i
„wystawiają” na powierzchnię komórki w postaci kompleksu z
białkami MHC. Kompleks ten jest rozpoznawany przez swoisty
względem danego antygenu limfocyt T pomocniczy. Wtedy
dochodzi do transformacji blastycznej i powstaniu komórki
plazmatycznej produkującej Ab. Ag, które powodują taki typ
reakcji nazywamy
antygenami grasicozależnymi
. W odróżnieniu
od nich,
antygeny grasiconiezależne
nie wymagają obecności
limfocytów T pomocniczych i mogą bezpośrednio aktywować
limfocyty B.
SUBPOPULACJE KOMÓREK
JEDNOJ
Ą
DROWYCH KRWI OBWODOWEJ
LIMFOCYTY T
ִ
T pomocnicze - T helper (Th):
mAb: CD3-FITC/CD4-PE
wspomagają odpowiedź immunologiczną poprzez wydzielanie
mediatorów regulujących funkcje układu odpornościowego
(cytokin) lub poprzez bezpośredni kontakt z innymi
komórkami
trzy subpopulacje komórek Th: Th0, Th1 i Th2
ִ
T supresorowe (Ts):
mAb: CD3-FITC/CD8-PE
są odpowiedzialne za hamowanie reakcji immunologicznej
SUBPOPULACJE KOMÓREK
JEDNOJ
Ą
DROWYCH KRWI OBWODOWEJ
Podstawy cytometrii - oznaczanie
subpopulacji komórek
4
SUBPOPULACJE KOMÓREK
JEDNOJ
Ą
DROWYCH KRWI OBWODOWEJ
KOMÓRKI NATURAL KILLER (NK)
ִ
mAb: CD3-FITC/CD56-PE
ִ
posiadają właściwości cytotoksyczne
ִ
ważne w odporności przeciw komórkom nowotworowym oraz
komórkom zarażonym przez wirusy
ִ
działają nieswoiście (wykazują właściwości cytotoksyczne bez
wcześniejszej immunizacji)
OCENA FENOTYPÓW KOMÓREK UKŁADU
ODPORNO
Ś
CIOWEGO
monitorowanie chorób autoimmunizacyjnych, leczenia
immunosupresyjnego, po przeszczepach, niedoborów odporno
ś
ci,
głównie przez ocen
ę
struktur powierzchniowych komórek, rzadziej
antygenów wewn
ą
trzkomórkowych
IMMUNOFENOTYPOWANIE LIMFOCYTÓW
niezb
ę
dne w monitorowaniu:
-
wrodzonych zaburzeń odpowiedzi humoralnej, związanych z
niedoborem limfocytów B: określa się liczbę komórek cechujących
się występowaniem markerów CD19/CD20, będących wykładnikiem
tej populacji
IMMUNOFENOTYPOWANIE
LIMFOCYTÓW
niezbędne w monitorowaniu:
- kondycji immunologicznej chorych z
nabytym niedoborem odporności (HIV
pozytywnych): ocena subpopulacji
limfocytów CD4 i CD8 oraz
współczynnika CD4/CD8 np.:
44%/27% - zdrowy (1,63)
7,7%/54% - pacjent z pełnoobjawowym
niedoborem odporności (0,14)
OCENA FENOTYPÓW KOMÓREK UKŁADU
ODPORNO
Ś
CIOWEGO
CD8
C
D
4
LIMFOCYTY
CD4+CD8+
LIMFOCYTY CD4-
CD8+
Zakres wartości prawidłowych markerów komórek
jednojądrowych krwi obwodowej człowieka
Komórki-marker CD
Warto
ść
ś
rednia
[%]
Zakres warto
ś
ci
[%]
CD4+
45
35-50
CD8+
35
25-45
CD3+
50
35-65
CD2
55
45-65
CD22
25
20-30
CD56
15
10-20
CD14
18
10-25
Wska
ź
nik CD4/CD8
1,4
1,1-1,7
ANALIZA
ANALIZA
CYTOMETRYCZNA
CYTOMETRYCZNA
OCENA SUBPOPULACJI- pacjent1
Kontrola izotypowa
Limf.T CD4
Limf.T CD8
Limfocyty B
monocyty
Podstawy cytometrii - oznaczanie
subpopulacji komórek
5
OCENA SUBPOPULACJI- pacjent2
Kontrola izotypowa
LimfocytyT CD8
LimfocytyT CD4
Limfocyty B
monocyty
Komórki NK
(Natural Killer)