Instrumentalne metody analizy chemicznej egzamin

27.01.09

Problem

elucji

(wymywania)

chromatografie.
RYSUNEK

Trzy  pary  związków  oddziałują  podobnie  z
fazą  stacjonarną.    Jeśli  zoptymalizujemy
pomiar  względem  1.  pary  to  pozostałe  nie
będą zoptymalizowane, względem 2 lub 3 to
inne nie. Dlatego po wymyciu dwóch pików
następuje zmiana parametrów dynamicznych
wymywania

–

zastosowanie

elucji

gradientowej (zmienna w czasie)
Zastosowanie chromatografii
Czołowa  metoda  rozdzielania  i  wydzielania
substancji  ma  znaczenie  jakościowe  i
ilościowe.
Chromatograficzna

analiza

jakościowa:

identyfikacja substancji poprzez czasy elucji;
etam wstępny do dalszej identyfikacji.
Oczyszczona

substancja

chromatografia

może być sprzężona ze spektroskopią.
Jeśli związki są podobne ie jesteśmy w
stanie określić t

. W szczególności gdy

czasy  retencji  są  wykalibrowane  np.  dla
aminokwasów  od  1  zastrzyku  możemy
określić  z  jakimi  aminokwasami  mamy  do
czynienia.  Nieobecność  piku  może  nieść  w
sobie  informację  analityczne

ważne w

analizie antydopingowej.
Analiza  ilościowa:  właściwości  sprawiły  że
technika  ta  rozwija  się  bardzo  szybko,
oznaczania ilościowe są :
-szybkie
-stosunkowo proste
-niskie koszty
-szeroko

stosowane

jako

narzędzie

rozdzielania.
Aby  oznaczyć  ilościowo  potrzebna  jest
wysokość piku i jego pole powierzchni.
Zalety i wady stosowania wysokości piku:
-łatwiej zmierzyć wysokość niż pole.
-  pomiar  wysokości  jest  dokładną  miarą
ilościową  stężenia  składu  jeżeli  warunki
rozdzielania  są  stałe  w  trakcie  analizy  nie
zmienia

się

szerokość

piku

(miara

powtarzalności.

-jeżeli  piki  są  bardzo  mocne  to  pomiar
wysokości jest dokładniejszy niż  pola.
Warunki powtarzalności rozdziału:
- powtarzalność objętości zastrzyku
- T kolumny
-  szybkość przepływu fazy ruchomej
-  efekt  przeładowania  kolumny  nadmierne
ogrzewanie lub powstawanie frontu.
Analiza  ilościowa  za  pomocą  powierzchni
pod pikiem
-  efekt  poszerzenia  pasma  nie  odgrywa  roli
powierzchnia piku nie jest na to czuła.
Sposoby realizacji analizy ilościowej:

konstruowanie  krzywej  kalibracyjnej
substancje  o  kilku  stężeniach  –
wykreślamy  prostą  zależności  czasu
retencji  od  stężenia.  Krzywa  nadaje
się  jeśli  obejmuje  zakres  stężenia  w
badanych próbkach.

Metoda wzorca wewnętrznego –
najdokładniejsze

oznaczenia

ilościowe.

Można

skompresować

błędy,  warunki  poprawiane  stosując
wewnętrzny  wzorzec.    Wzorcem  nie
musi  być  substancja  oznaczana,  w
związku  z  tym  substancję  wzorcową
dobiera  się  w  tak  aby  wymywała  się
dostatecznie  blisko  naszego  piku  o
R

>1,25,precyzja lepsza niż 1%.

Normalizacja powierzchni piku –
prowadzi

wyznaczenia

bezwzględnego składu mieszaniny,
unika się niedokładności związanych
z

zastrzykiwaniem

próbki.

Warunkiem jest pełne wymycie.
Mierzymy

powierzchnię

pod

wszystkimi

pikami

(ZESZYT

STRONA

NIE

MOGĘ

ROZCZYTAĆ

JEST

NAWIASIE)

Wyznacza

się

względne stężenie w mieszaninie. Ile
%  substancji  x  pobranej  do  analizy.
Jeśli  mamy  c  bezwzględne  innych
substancji  to  możemy  podać  c
bezwzględne  substancji  x.  Źródła
błędu:

- niedokładne objętości zastrzykiwanej
próbki
- różna szybkość zastrzykiwania.

Podział chromatografii ze względu na
f. ruchomą
Chromatografia gazowa GC – odnosi się
do

dwóch

różnych

technik

zależnościom f. stacjonarnej:
Ciało  stałe-  mamy  do  czynienia  z  Gas
Solid Chromatography (GSC)
Ciecz – Gas liquid chromatography GLC
GSC  nie  jest  już  techniką  stosowaną
praktycznie. W GSC mechanizm retencji
opiera się na adsorpcji fizycznej.
Dlaczego GSC stosuje się szczątkowo:
Retencja

jest

prawie,

że

trwała,

występuje znaczne ogonowanie piku
wynikające

charakteru

izotermy

adsorpcji.
GC  –  podział  dotyczy  obecności
substancji  w  stanie  gazowym  lub
ciekłym  w  każdej  chromatografii  mamy
do  czynienia  z  faza    ruchomą  i
stacjonarną  oraz  próbką.  TU  JEST
RYSUNEK  ALE  GO  NIE  ROZUMIEM
WIĘC POMIJAM STRONA 4 ZESZYT
GLC
Parametrem  retencji  jest  V

- objętość

retencji
V

F-szybkość przepływu objętościowego.
V

- temperatura kolumny [K]

T – temperatura miernika

)

(

−

p-ciśnienie pary wodnej w temp. T
V

i V

zależą od średniego ciśnienia

panującego w kolumnie.

⋅

j- czynnik korygujący















−



























−













Specyficzna objętość retencji

⋅

−

273

(

)

273

⋅

−

⋅

Powiązanie współczynnika retencji ze
współczynnikiem rozdzielania:

−

;

jFt

273

⋅

;

273

⋅

Przepływ  pozostaje  stały  jeśli  ciśnienie
jest stałe:
RYSUNKI

Aparatura:
- Regulator ciśnienia gazu
- zbiornik gazu
-  miernik  szybkości  przepływu  (kontrola
przepływu
-  rotometr  pomiar  szybkości  przepływu
gazu
-  piec  w  piecu  kolumna  do  jej  czoła
przytwierdzone urządzenie dozujące.
-detektor

(czasami

potrzebny

tor

odniesienia)
-pomiar szybkości
- rejestrowany sygnał napięciowy.
Zbiornik  z  gazem-  od  czego  zależy
wybór  gazu?  W  większości  decyduje
charakter  detektora,  różne  detektory
wymagają różnych gazów. Cechą układu
podającego  gaz  nośny  jest  urządzenie
osuszające

gaz

(za

pomocą

sit

molekularnych).
Pomiar

szybkości

przepływu

–

urządzenie szydłowo bańkowe.
Sposób zastrzykiwania próbki-
Zastrzykujemy

komory

odparowania zawór dozujący najczęściej
pętlicowe sześciopozycyjne (LC i GC)
Szybkość 25-100 ml/min, 1-25ml/min
gołe ścianki kapilary.

Wymagania stawiane zastrzykiwaniem:
1)

dotyczą objętości próbki.

Kształt profilu zastrzyku w czasie

RYSUNEK
Parametry operacyjne na kolumnie:
Kolumny upakowane lub otwarte. Mała
średnica k. kapilarne, z reguły k. otwarte
Podstawowe parametry: długość

zależności od potrzeb; zbudowana z
różnych

materiałów

(szkło,

stal

kwasoodporna,   kwarc, teflon). Parametr
dynamicznej pracy kolumny w GC temp,
jak wpływa na sprawność kolumny.
Wprowadzono  elucję  gradientową  gdzie
zmianie ulega T kolumny od 30 do 18°C.
Nowoczesne  w  sposób  programowany.
Gdy  mamy  optymalną  temperaturę
kolumny  to  rozdzielczości  zadowalające
zalezą

temperatury

wrzenia

rozpuszczalnika i zadanej rozdzielczości.
T

wrz

opt

dvs

;

dvs – stopień pożądanego

rozdzielenia.
Optymalne  rozdzielenie  związane  jest  z
możliwe  najniższą  temperaturą  jednak
niska temperatura to koszt, i dłuższy czas
wymywania.
Detektor:
Cechy detektora do GC
1)

określona wykrywalność – wystarcza
adekwatna  czułość  różna  czułość  do
różnych    analiz,    czynniki  czułości
mogą  się  różnić  o  10

. Czułość

powinna zawierać się między 10

-7

-15

g/s substancji.

Stabilność i odwracalność pracy.

Liniowość dopowiedzi – sygnał
proporcjonalny

stężenia

szerokim zakresie wielkości kilka
rzędów 1-10 tys.

Zakres temperatury i łatwość obsługi

- nie można popsuć przy żadnej
nastawie.
-

toporny

nie

można

popsuć

mechanizmu.

5)  Czas  odpowiedzi  –  jak  najkrótszy,
niezależnie od szybkości przepływu.
6)  Wysoka  rzetelność  pracy  i  łatwość
obsługi.
7)Jego

odpowiedź

jest

jednakowa

względem

wszystkich

badanych

składników  mieszaniny  (ogólny)  lub
wybranych (selektywny).
8)  Nie  destrukcyjny  nie  rozwala  próbki
można  ją  poddać  analizie  na  innym
przyrządzie.
Nie  ma  idealnego  detektora  do  GC.
Oznaczamy stosując różne detektory.
Detektor

płomieniowo

jonizacyjny

FID.

–Istotą

jest

palnik

zasilany

wodorem i powietrzem po iskrowym
zapaleniu palnika - H

pali się, dysza

uziemiona  do  kolektora  jest  przyłożone
napięcie  kilkuset  V.  Spalaniu  substancji
organicznej  w  płomieniu  towarzyszy
jonizacja

–

wytwarzanie

jonów

elektrolitów.  Wyprodukowane  ładunki
poruszają się w polu elektrycznym( kilka
mA)  i  płynie  prąd.  Nie  wiemy  dlaczego
substancje  ulegają  jonizacje  w  trakcie
spalania.  Detektor  jest  czuły  na  masę
zastrzykiwanej  próbki.  Liczby  at.  C
przepływają

przez

detektor,

nie

morzymy    stężeń.  Jest  czuły  na  masę
jego  wskazania  nie  zalezą  od  szybkości
przepływu  fazy  ruchomej.  Wysoka
czułość

-13

g/s,

szeroki

zakres

liniowości 7 rzędów 10

. Szum jest niski,

odporny na głupotę, nie jest czuły na
substancję

które

się

nie

spalają.

(zawierające  metal  lub  niemetal  na
wysokim  stopniu  utlenienia)  Detektor
ogólnego  przeznaczenia  do  oznaczania
substancji  organicznych.  Wadą  tego
detektora jest to że jest on destrukcyjny.
Detektor termojonowy TID
Budowa  podobna  do  detektora  FID,
wyciek (dotyczy płynów) jest mieszany z
wodorem, przepuszczamy  nad palnikiem
i  spalamy,  gorący  gaz  przepływa  nad
elektrycznie  grzana  kulką  z  krzemianu
rubidu  –  podłączone  jest  też  napięcie
100mV  ta  kulka  ziarna  podgrzewana
wytwarza  plazmę  o  temperaturze  600-
800  C.  W  plazmie  nie  wiadomo  co  się
dzieje.  Powstaje  bardzo  dużo  jonów,
źródłem

są

związki

azotu,

fosforoorganiczne. Zaletami detektora
jest:
- tworzenie dużej ilości jonów, prądy o
dużym

natężeniu,

nadają

się

oznaczania  związków  zawierających  P  i
N. Selektywny 10x bardziej czuły niż na
inne  związki  organiczne  nie  zawierające
P,N.  Jest  500x  bardziej  czuły  na  P  niż
FID,  i  50x  na  N.  Stosowany  do
oznaczania pestycydów w glebie.
Detektor  płomieniowo  fotometryczny
FPD
Wyciek  z  kolumny  przepuszczamy  nad
niskotemperaturowym

płomieniem

wodorowym.

trakcie

spalania

przetwarza związki fosforoorganiczne na
związki

zawierające

HPO

się

charakteryzuje

emisją

(510-500nm),

siarka SO

394nm również halogenki,

związki metaloorganiczne Se,Ge.
Zastosowanie

szerokie

analizie

zanieczyszczeń

powietrza

wywołanych

pestycydami.

Detektor

selektywny reaguje na obecność S i P.
Detektor

przewodnictwa

cieplnego

TCD
Katharometr jeden z pierwszych wciąż
stosowany, zasada działania związana ze
zmianami przewodnictwa cieplnego gazu
związane z pojawieniem się próbki w
gazie.

Elementem

pracującym

jest

grzana spirala ogrzewana ze źródła
prądu

stałej

mocy,

powinna

przewodzić prąd o tej samej oporności
jest tak gdy otacza ją jednorodny gaz,
oporność

drutu

jest

miarą

przewodnictwa  cieplnego  gazu  nośnego.
Co  jeśli  w  gazie  będzie  próbka  ?
Dołączone  jest  urządzenie  pomiarowe
typu mostka. Jeśli w gazie będzie próbka
to

substancja

oznaczana

inaczej

odprowadza  ciepło  –  zmienia  się
oporność tego druciku. Mamy tor próbki
i  tor  odniesienia.  Układ  mostkowy
zapewnia  pomiar  porównawczy  zaletą
jest  to  że  wskutek  pomiaru  różnicowego
eliminowane  są  efekty  szybkości  zmian
przepływu  ciśnienia  zasilenia.  Gazem
nośnym  jest  H

lub He bo ich

przewodnictwo jest 6-10x większe niż
związków organicznych. Więc gdy w
gazie

jest

niewielka

ilość

próbki

organicznej

gwałtownie

spadnie

zdolność

odprowadzenia

ciepła,

temperatura drutu wzrośnie. Zaletami są
prostota

obsługi,

szeroki

zakres

liniowości

dynamicznej.

Detektor

ogólnego

przeznaczenia

substancje

organiczne  i  nieorganiczne  nie  jest
destrukcyjny.
Ograniczenia:  niska  czułość  10

-8

g/ml

gazu

nośnego,

inne

przewyższają

katharometr  o  4-7  rzędów  wielkości.
Przy  tak  niskiej  czułości  nie  nadaje  się
do  zastosowania  w  przypadku  kolumn
kapilarnych.
Detektor wychwytu elektrolitów
Wyciek  z  kolumny  przepuszczany  nad
substancją  emitującą  promieniowanie  β
najczęściej

Ni lub tryt, są one drogie,

naniesione

folie

platynową.

Promieniowanie    β  jonizuje  gaz  nośny
(azot) produkuje ogrom elektronów. Jeśli
nie  ma  substancji  oznaczanej  to  mierzy
się  stały  prąd  pomiędzy  parą  elektrod.
Jeśli

będzie

próbka

prąd

spadnie

substancje organiczne mają zdolność
wychwytu

elektronów.

Odpowiedź

detektora

jest

nieliniowa,

jeśli

przykładany

potencjał

nie

jest

impulsowy.

Selektywny

czuły

substancje  zawierające  elektroujemne
grupy  funkcyjne:  nadtlenki,  chinony,
grupy  nitrowe.  Nie  czuły  na  grupy
funkcyjne

węglowodory,

aminowe,

hydroksylowe. Zastosowanie: najczęściej
oznaczanie związków owadobójczych,
pochodnych

chlorowców.

Zalety:

czułość quasi nieniszczący charakter.
Nieliniowa

odpowiedź

–

zakres

liniowości  detektora  jest  ograniczony  do
dwóch rzędów wielkości.
Detektor emisji atomowej AED
Wyciek  wprowadzany  do  komory  pieca
mikrofalowego  gdzie  wytwarzana  jest
plazma,  komora  sprzężona  jest  ze
spektrometrem  jonowo  optycznym.  W
plazmie  następuje  atomizacja  próbki
ulegają

wzbudzeniu

mają

widmo

emisyjne. Mamy diody przy określonej
długości

fali

emisja

pierwiastków,

możemy  wykryć  to  co  chcemy  mierzyć.
Jeśli  nastawimy  na  zakres    węglowy
można  badać  benzyny.    Substancja

anstystukowa

MTBF,

zakresie

tlenowym.

19.02.09.

Detektor fotojonizacyjny PID
Jonizacja

dokonywana

pomocą

światła ultrafioletowego (149-196nm)
jonizuje się cząsteczki, wybija elektrony,
przykłada się różnice potencjału i
uzyskuje się prąd jonizacyjny i rejestruje
przez

krzywą.

Jest

detektor

selektywny,

wysokoczuły

względem

wybranych substancji.

Detektory służą do detekcji, ilościowego
oznaczania  substancji  a  na  podstawie
czasu  retencji  wzorca  możemy  oznaczyć
tę  substancję.  Często  należy  połączyć
chromatografię  z  innym  technikami
pozwalającymi

oznaczyć

badaną

substancję.

GC-MC
MS-  wyznaczanie  stosunku  masy  do
ładunku.

sposobie

fragmentacji

można rozróżnić z jaką cząsteczką ma
się

czynienia.

Zastosowano

urządzenie:
Separator  dyfuzyjny  –  w  separatorze
tego  typu  cząsteczki  gazu  nośnego
odpompowywane  przez  rurę  ze  spieku
szklanego.
Separator- rozdzielcza strumienia, lekkie
cząsteczki

gazu

nośnego

są

odparowywane  przy  przejściu  z  jednej
kapilary do drugiej a ciężkie gazy próbki
trafiają do drugiej kapilary i do MS.
Separator membranowy – membrana jest
organofilowa  i  związki  organiczne  są
transportowane przez membranę szybciej
aniżeli cząsteczki gazu nośnego.

Kolumny

kapilarne-

wymagają

stosowania  mniejszych  ciśnień  dlatego
mogą być bezpośrednio połączone z MS,
gdy  nie  możemy  zastosować  ich  to
stosujemy separator.
3 sposoby realizacji:

•

Kwadrupolowy MS

•

MS z transformatą Fouriera

•

Detektor pułapkowania jonów
ITD.

Zderzenia elektronowe

Jonizacja chemiczna

powstają jony

pułapkowane

polu

częstości

radiowej

są wrzucane do powielacza

eketronowego.

Zalety: niewielki,15 cm długości, tani.
Detektory  MS  mają  szereg  sposobów
prezentacji  wyników,  obróbka  sygnału  w
czasie  rzeczywistym  lub  rekonstrukcja
komputerowa  sygnału.  Możemy  wybrac  do
prezentacji  całkowity  prąd  (suma  prądów
wszystkich

jonów)

lub

wykreślany

selektywnie prąd jonów.

Zastosowania GC-MS
GC-IR – problem z połączeniem rozwiązany
za  pomocą  rury  świetlnej.  Grubościenna
rura  ze  szkła,  wewnątrz  pokryta  lustrem
złotym,  próbka  przechodząca  odbija  się  od
ściany,

światło

podczerwone

jest

absorbowane przez próbkę.
Detektor IR- rtęciowo-kadmowy/tlenowy
tzw

radiacyjny;

elucja

gradientowa,

kolejność wymywania określone przez masę
cząsteczki,

masa

cząsteczkowa

rośnie.

Selektywność

może

określić

różnica

temperatur wrzenia substancji oznaczanej.
Widmo tej samej substancji w fazie gazowej
różni się od widma w fazie skondensowanej
(możliwe oscylacje, wyhamowane rotacje).
W

fazie

gazowej

nie

występuje

oddziaływania

między

cząsteczkami

charakterystyczne  dla  fazy  skondensowanej
a  zwłaszcza  wiązanie  wodorowe;  nie  ma
rozpuszczalnika.

Kolumny – historycznie wypełnione złożem
(nośniki)  pokryte  ciekłą  fazą  stacjonarną.
Zdano

sobie

sprawę,

że

kolumny

niepakowne  o  małej  średnicy  powinny
wykazywać  znacznie  lepszą  sprawność  niż
k.  ze  złożem  (N  nawet  300  tyś).  Wady:
należało  zastrzykiwać  bardzo  małą  objętość
próbki  (  trudne  w  sposób  odwracalny),
bardzo  delikatne,  łamliwe.  Problemy  z
podaniem

próbki

taką

kapilarę,

połączenie jej z detektorem. Trudności z
odtwarzalnym pokryciem środka, niedługi

czas życia, tendencja do zapychania,
obłożone patentami.
Kolumny

upakowane-

wykonane

materiału  szklanego  lub  metalowego  (stal,
Cu)  lub  plastikowego.  Długość  2-4m,
średnica  wewnętrzna  2-4  mm.  Upakowane
wypełnieniem  cząsteczki  stałe  lub  warstwa
pokrywa wewnętrzną powierzchnię kolumny
do 1µm.
Cechy materiału wypełniania kolumn:

Małe drobiny

Jednorodne

Sferyczne – dynamika przepływu

Odporne mechanicznie

Powierzchnia

specyficzna

/g)

powinna być znaczna nie mniej niż
1m

/g.

Inertny nie oddziałuje z substancją
oznaczaną

Jednorodnie zwilżany przez ciecz
fazy stacjonarnej.

wielkością

ziarna

związane

są

ograniczenia wynikające z zależności max
ciśnienia ze średnicą ziarna.

≈

Jeśli  przyjmując  że  p>  5  atm  to  kapilara
rozsadzi się. Zakres średnic 150-250 µm.
Kolumny kapilarne:
WCOT  –  kolumny  otwarte  z  pokrytą
ścianką.  Ścianka  kapilary  pokryte  cieniutką
warstewką

fazy

stacjonarnej,

kolumny

stalowe lub plastikowe, później ze szkła
bromokrzemowego.

Ściany

kolumny

porowate.
SCOT  –  mogą  przyjąć  więcej  substancji  niż
WCOT,  wadą  jest  ich  niska  sprawność,
kolumny otwarte pokryte nośnikiem.
FSOT  -  kolumny  otwarte  kwarcowe.
Mechanicznie

trwałe,

znacznie

mniej

relatywne względem składników próbki
rozdzielanej, mechanicznie elastyczne.
Ograniczenia

150-200µm

średnica

wewnętrzne, charakteryzują się większą
rozdzielczością aby zmniejszyć wielkość
zastrzykiwanej

próbki

stosuje

się

rozdzielacze.
Kolumny  o  dużej  średnicy  ich  sprawność
jest  niższa  od  kolumn  o  małych  średnicach.
Można zastrzykiwać duże próbki.

Adsorpcja  na  materiale  upakowania
kolumny  i  ściankach  kapilary  oraz
sposoby zapobiegania.
Mechanizm  adsorpcji  psuje  mechanizm
rozdzielania.  Adsorpcja  fizyczna  substancji
polarnych

tj.

alkoholi

węglowodory

aromatyczne  na  powierzchni  krzemianów
wypełnienia  lub  ścianek.  Skutkuje  to
zniekształceniem  pików

poszerzenie,

ogonowanie. Kolumny kwarcowe lepsze od
szklanych

szkle

obecne

są

zanieczyszczenia (tlenki metali).
Wymagania względem fazy stacjonarnej:

Lotność – idealna faza stacjonarna
charakteryzuje się t

co najmniej o

100°C wyższą niż temperatura pracy
kolumny.

Trwała w wyższych temperaturach

Chemicznie obojętna (nie reaguje z
rozdzielanymi substancjami).

Charakteryzuje

się

pożądanymi

parametrami  rozdzielania  k’  i  α
wartości  powinny  zawierać  się  w
zakresie  współczynniki  referencji
rządzi współczynnik podziału.

Jakie ciecze jako faza stacjonarna?
Dobieramy  fazę  stacjonarną  która  jest
chemicznie  podobna,  wykazuje  podobna
polarność.
W  jaki  sposób  uzyskujemy  polarność  fazy
stacjonarnej wprowadzając grupy –CN, -CO,
-OH,

-CH

;

glikol

polietylenowy,

polisiloksany.
Krwawienie  kolumny-  wypłukuje  się  faza
stacjonarna – krwawi, sprawność spada.
Aby  faza  stacjonarna  nie  ulegała  zubożeniu
należy ją trwale umocować.
Usieciowanie cieczy:
-  sieciowanie  rodnikowe  –  dodajemy
nadtlenki i grzejemy tę warstwę indukujemy
mechanizm  reakcji  rodnikowej  powstaje
wiązanie C-C.
-  indukowanie  reakcji  wolnorodnikowej
radiacyjnie:

kolumnę

pokrytą

fazą

stacjonarną poddajemy promieniowaniu γ
wyzwalające wolne rodniki.
Cyklodekstryny:

tworza

kompleksy

supramolekularne

enancjomerami,

różniące się stałymi trwałości. Zbudowane
są z jednostek d-glukozy, α-CD 6 jednostek,

β-7

jednostek,

γ-8

jednostek.

Są

hydrofobowe  wewnątrz  hydrofilowa  na
zewnątrz.  Ze  względu  na  swoją  chiralność
mogą rozpoznawać enancjomery.
Rozdzielanie

aminokwasów

ich

pochodnych  aby  rozdzielić  związki  chiralne
należy zastosować fazą stacjonarną, która też
ma charakter chiralny.
Grubość  ma  wpływ  na  właściwości  retencji
kolumny 0,1 – 5 µm.
Warstwa

gruba-

czas

przenikania

wychodzenia dłuższy

rozmycie kolumny,

stosowana w przypadku analitów lotnych,
Cienka warstwa – anality o niższej lotności.
0,25 <d

<0,32mm to grubość l ≈ 0,25µm.

26.02.09

Zastosowania chromatografii gazowej:

Wyróżniamy dwie grupy zastosowań:

rozdzielanie mieszanin substancji
lotnych

oznaczanie jakościowe i ilościowe

Analiza ilościowa
- Zastosowanie chromatografii gazowej jako
kryterium czystości związków organicznych.
Wykonuje

się

chromatograf

gazowy-

nieobecność  pików  wskazuje  na  czystość
substancji.
-  Potwierdzenie  obecności  lub  nieobecności
związku pożądanego lub niepożądanego.

Współczynnik

selektywności

–

współczynnik

selektywności

miara

stosunku  współczynnika  podziału  dwóch
substancji  wymywanych  jeden  po  drugim.
Jeden  wybieramy  jako  standard  to  α  może
być stosowane jako indeks.
Α=k

-standard α- indeks dzięki

któremu identyfikujemy A.
Indeksy
log (t’

-t

)

alkany:

; z- liczba atomów węgla w łańcuchu

alkanowym, dla innych związków:

log

100

−

Chromatografia  adsorpcyjna  gaz-ciało
stałe
Mechanizm:  adsorpcja  gazu  na  fazie
stacjonarnej  –  ciele  stałym  ,  jak  GLC  nie
działa to wtedy bierzemy tą bo adsorpcja jest
procesem gorzej ….niż……
Zastosowanie:

rozdzielanie

małych

cząsteczek, zanieczyszczenia powietrza, HS,
CS

, CO, CO

Kolumny: zarówno

upakowane jak i

kapilarne

(adsorbujące

ziarenko

przymocowane do ścianek kapilary.
Adsorbenty -
- sita molekularne
Najczęściej

są

glinokrzemiany

jonowymienne;  od  czego  zależy  wielkość
porów  –  im  większy  kation  tym  większe
pory,  ziarno  wypełniamy  –  wielkość  sita
przez  które  zostało  przesiane.  Większy
numer

sita

tym

mniejsze

drobiny.

Porowatość mierzy się 4,5,10,13A°
Do  CO  stosuje  się  obejścia  bo  on  się
adsorbuje nieodwracalnie.
-  porowate  polimery  najczęściej  na  bazie
styrenu sieciowane diwinylobenzenem.

LC
Podstawą

klasyfikacji

jest

mechanizm

retencji:
Podział:

podziałowa  –  cząsteczki  o  masie100
–  10  tyś  o  charakterze  niejonowym
polarnym.  Realizowana  w    fazach
normalnych  i  odwróconych  :  faza
stacjonarna  –polarna  faza  ruchoma  –
niepolarna  układ  normalny  faza
ruchoma  polarna  faza  stacjonarna
niepolarna- układ odwrócony.

Mechanizm wymiany jonowej –
polarne

Mechanizm adsorpcyjny – niepolarne

Chromatografia

wykluczania

–

żelowa

przesiewania,

żelowa

przenikania.

Stosowane:
Wypełnienie hydrofobowe lub hydrofilowe
Cząsteczki o masie > 10

, chromatografia

faz odwróconych często stosowana w
wykluczania. Im mniejsza średnica ziarna
tym większa zdolność rozdzielcza

Przyczyny zagłady:

wykrywalność

adaptowalność

wykonywania

bardzo

dokładnych

oznaczeń

jakościowych

odpowiedność,

dogodność

oznaczania substancji nielotnych i
termoniestabilnych.

Niskocząsteczkowe – gazowe
Mniej lotne – cieczowe.
Najczęściej  rozdzielane  i  oznaczane  amidy,
białka,    kwasy  nukleinowe,  środki  ochrony
roślin-pestycydy,  związki  metaloorganiczne
związki nieorganiczne.
Na sprawność kolumny w LC ma wpływ:
- Średnica ziarna wypełnienia
Im  mniejsze  ziarno  tym  wysokość  półki  H
mniejsza

większa sprawność.

- Pozakolumnowe  poszerzanie pasm
Teoretyczny  pik  mamy  do  czynienia  z
naturalnym  rozmyciem  piku  na  kolumnie  w
wyniku chromatografowania.
RYSUNEK

Jeśli  będziemy  mieli  podobne  substancje
piki mogą się zlać.
Przyczyna powstawania:

od układu zastrzykującego (przyrząd,
sposób)

związane z detekcją

związane z układem przepływowym;
źródłem

jest

charakter/natura

przepływu im złączek więcej tym
poszerzenia więcej ; w oparach nie
bo mamy dyfuzję – dużo większe niż
aparaturowe rozmycie w cieczach.

;

Hex

↓

↑

tymH

- wielkość zastrzyku
Im zastrzyk mniejszy tym sprawność
większa.

Kolumny

faz

odwróconych

charakteryzują się najlepszą sprawnością.
Przyrządy: Kolumny o średnicy ziarna od 3-
10µm, jak mniejsze ziarno to kolumny 1 mm
jak  większe  ziarno  to  kolumny  445mm
rozdzielczość  izokratyczna  –  1  roztwór  –
skład fazy ruchomej jest stały. Gradientowa-
skład  fazy  ruchomej  zmienia  się  w  trakcie
elucji.

Powietrze  usuwamy  na  czole  kolumny
buduje się bardzo wysokie ciśnienie atm. Na
kolumnie mamy ogromny gradient ciśnienia.
Rozpuszczalność  gazów  w  cieczy  rośnie  ze
wzrostem ciśnienia za pomocą tlenowania.
2 doprowadzenie do wrzenia
3 podłączenie próżni
4 filtrowanie.
Układ  pompujący  w  LC  musi  spełniać
wymagania :

dostarczać ciśnienie rzędu 600 atm

przepływ fazy ruchomej powinien
być bezpulsacyjny

pompa powinna dostarczać roztwór
fazy ruchomej z prędkością 10µ L-
10mL

Szybkość przepływu fazy ruchomej i
odtwarzalność przepływu powinna
być nie gorsza niż 0,5%.

Odporność pompy na korozję

Pomimo ciśnień układy nie są niebezpieczne
z powodu ich wybuchowości.

Pompy:
-Pneumatyczne lub stałociśnieniowe
- wypierania (strzykawkowe)
- o tłoczkach poruszających się ruchem
posuwisto zwrotnym.
Zawór

obrotowy

szcześciopozycyjny

taksami jak w FIA tylko musi wytrzymywać
większe ciśnienia.
Próbki – na mikrokolumny ułamek 0,1 µ L
           - analityczne 5-100 µ L
           - półpraparatywne 1,2,3 mL

6.03.2009

Kolumny ogólne właściwości:
Długość [cm] 10-30 cm dawniej 1 m
Średnica

wewnętrzna:

preparatywna:

10mm-1m,  analityczna  pojedyncze  mm
najczęściej  4  lub  1  mm,  zależy  od  średnicy
ziarna  preparatywny  10µm,  analityczny
5,3µm. Typowe kolumny analityczne 4,6 µm
długość  25  cm.  Zwykle  charakteryzują  się
od 40 do 60 tyś  półek teoretycznych na metr
kolumny.  Czas  rozdzielania  w  sek,  l  =  4cm
śr  =  4mm  złoże  3µm.  Zalety  mikro  średniej
kolumny:
- wysoka sprawność 100 tyś półek na metr
- niespotykana szybkość
- niewielkie zużycie rozpuszczalników.

Im  wymagania  czystości  większe  tym  cena
wyższa.
Przedkolumny:
Między  zaworem  dozującym  a  kolumna  jest
przedkolumna  lub  kolumna  ochronna  –
spełnia zadania:

na niej osadzają się zaniczeszyczenia
stałe na przykład kurz który się
dostał.

Na kolumnie mogą się wytrącać
osady

(gdy

stosujemy

różne

rozpuszczalniki do rozpuszczania
próbki, a inny do elucji) np. ACN
+HEX

może się wytrącić, my o

tym nie wiemy czy się coś wytrąciło
bo kolumny są stalowe służy przy
przepuszczaniu

większych

ilości

próbki.

Zapobieganie  krwawieniu  kolumny
(faza stacjonarna w postaci cieczy na
nośniku  agresywne  fazy  ruchome
względem  fazy  stacjonarnej  będą  ją
rozpuszczać  i  jej  warstwa  będzie
malała  w  czasie,  przedkolumna
nasyca  fazę  stacjonarną  eluentem  (ta
sama faza stacjonarna).

Typy wypełnień z uwagi na porowatość:

wypełnienia

porowate

ziarna

zbudowane z różnych materiałów;
szklane

kulki

powierzchni

warstwa cieczy

nieporowate  błonkowe,  pelikularne
przedkolumna  wypełniona  złożem
pelikularnym

Materiały złóż porowatych :
- krzemionka
- żywice jonowymienne

Detektory:
W przeciwieństwie do GC nie ma ogólnego
detektora:
Wymagania takie jak w GC, oprócz:

W GC detektor powinien wykazywać
czułość    względem  substancji  w
szerokim  zakresie  temperatur  tu  nie
musi  operować  szerokim  zakresem
temperatur

Powinien

mieć

możliwie

małą

objętość detekcji.

Typy detektorów:
z

uwagi

właściwości

roztworu

przepływającego  przez  detektor  i  jego
odpowiedzi:
-  Detektory  które  wykrywają  zmianę
właściwości  całego  roztworu  np.  indeks
refrakcji,  δ.
-

detektory

wykrywające

zmiany

charakterystyczne

tylko

dla

substancji

rozpuszczonych (zmiana fluorescencji, abs
UV)
LOD

próg

wykrywalności

(limit

detection).
Detektory absorpcyjne:
Najczęściej  stosowane  SA  detek.  Pracujące
w  zakresie  UV-ViS.  Kuweta  przepływowa
tor  przepływa  w  kształcie  Z  –  przy
minimalnej  objętości  własnej  wprowadzenie
dłuższej  drogi  optycznej,  jeśli  przypadkowo
wejdzie  pęcherz  powietrza  to  już  on
zostanie,  dlatego  często  wprowadza  się  od
dołu;

okienka

kwarcowe.

Inne

analitycznej niż w preparatywnej. Droga
optyczna dłuższa w przypadku większego
rozcieńczenia

(analityczna).

preparatywnej  –  znaczna  ilość  próbki  (mL)
dlatego  droga  optyczna  jest  krótsza.  Pomiar
może  być  zaszumiany  ze  względu  na  fazę
ruchomą często faza ruchoma rozdzielany: w
jednym  torze  faza  ruchoma  w  drugim  torze
faza ruchoma z próbką . Detektor UV lampa
rtęciowa  (najtańsza,  254  nm  )  stosuje  się
filtry  dzięki  którym  można  wydzielić  inne
pasma.  Stosując  filtry  można  powiedzieć  o
pewnym  rodzaju  selektywności.  Oznaczanie
związków  aromatycznych.  Źródłem  światła
lampa  deuterowa  lub  włókno  wolframowe
do  tego  filtry  interferencyjne-  wydzielanie
światła o danej długości fali.
Detektory spektrofotometryczne:
Dysponują  monochromatorami  (najczęściej
siatka  dyfrakcyjna)  UV-ViS-NIR    250-
1200nm  możemy  wybrać  1  długość    fali
(oznaczanie  przy  konkretnej  długości  fali).
Służy

też

ilościowego

określania

analitów; możemy też zatrzymać przepływ,
aby zdjąć całe widmo, nadaje się do badania
czystości substancji. Przemiatanie widma
jest

stosunkowo

powolne,

należy

zatrzymywać przepływ, aby tego uniknąć

stosuje

się

detektory

matrycowe

–

rozdzielone  w  czasie.  Zaletą  detektora  jest
wymiar  szybkości  oznaczeń.  Wada  aby
rozświetlić  każdą  z  diód  światło  musi  być
wyższe  niż  w  spektrofotometrze  może  się
okazać  że  intensywność  jest  tak  duża,  że
rozkłada  próbkę;  dlatego  powinno  się
wykonywać

pomiar

przy

różnych

intensywnościach.
Detektor w IR mamy dwa typy

Przemiatana długość fali, do tego
służą 3 kliny optyczne, zakres od 2,5
do 14,5 µm

Detektor na IR z wykorzystaniem
transformaty Fouriera

Kuwety  przepływowe  –  okienka  nie  mogą
być  kwarcowe  okienka  z  NaCl,  CaCl,  ale
faza  ruchoma  nie  może  być  za  wilgotna.
Długość drogi optycznej od 0,2 do 1mm
V  det.kuwety  1,5-10µ L  detektor  może  być
jedno  lub  2  wiązkowy,  można  zatrzymywać
przepływ i zdejmować widmo.
Detektor z transformatą Fouriera – można
traktować

jako

analogi

detektorów

arejowych.

Ograniczenia

związane

rozpuszczalnikiem  w  fazie  ruchomej  ,
niektóre  składniki  nie  przepuszczają  IR  np.
grupy  karbonylowe.  W  fazie  ruchomej  nie
powinno  być  dwutlenku  węgla,  nie  wolno
stosować rozpuszczalników z tymi grupami ;
OH nie można jako fazę ruchomą.

Detektor fluorescencyjny : taki sam jak do
badań  fluorescencji,  detektor  pod  kątem  90°
do

promieniowania

wzbudzającego,

najprostszy zbudowany ze źródła światła
(lampa XE, Hg) przestrajane lasery

podwyższa czułość i selektywność oznaczeń.
Zalety – wynikają z natury sp. Fluorescencji
– wysoka wykrywalność (rząd wielkości
większa

niż

absorbancji)

Wada:

ograniczenie do próbek które świecą. Świecą
materiały farmaceutyczne, naturalne próbki
ropy naftowej, związki aromatyczne; jeśli
nie

świeci

poddajemy

próbkę

przedkolumnowej modyfikacji

dodajemy

znacznik. Fluor – chlorek dansylu : chlorek
5-dimethyloamino -1-naftylo-sulfonylowy;
reaguje

aminami

rzędowymi,

aminokwasami,

fenolami,

wyniku

otrzymujemy  związki  o  właściwościach
fluoryzujących.

Detektory ogólnego przeznaczenia:
- indeksu refrakcji RID
-  rozpraszania  światła  przy  odparowaniu
rozpuszczalnika ELSD

RID

CHROMATOGRAFIA GAZOWA ZE
SPEKTROMETRIĄ MAS (GC-MS)

Sposoby detekcji
- kwadrupolowy spektrometr masowy
-  spektrometr  masowy  z  transformatą
Fouriera
-  detektor  pułapkowania  jonów  (ITD)
(przystosowany  do  chromatografii  gazowej)
zalety: niewielki (15 cm), niedrogi
2 tryby wyświetlania danych:
- wyświetlanie w czasie rzeczywistym
-

wyświetlanie

rekonstrukcji

komputerowej
Możemy wybrać wyświetlanie:
-  wyświetlanie  prądu  pochodzącego  z
jonizacji wszystkich składników
-  wyświetlenie  prądów  tylko  niektórych
substancji oznaczanych
-  dla  danego  piku  można  wyświetlić  widmo
masowe
Sprzężenie  spektrometru  masowego  ze
spektrometrem mas.

Rys.1

Identyfikacji

dokonuje

się

porównując

widma masowe do tych, które znajdują się w
bibliotece.
Zastosowania:
- oznaczanie składu składników smakowych
i zapachowych produktów spożywczych.
- diagnoza medyczna stawiana w oparciu o
analizę wydychanego powietrza.
- oznaczanie składu metabolitu leków
-

identyfikacja

zanieczyszczeń

wód

naturalnych.

CHROMATOGRAFIA GAZOWA ZE
SPEKTROFOTOMETRIĄ

PODCZERWIENI (GC-FTIR)

Rurka świetlna

Rys.2

Rurka ma nie wprowadzać rozmycia pasu, a
światło podczerwone ma jak najintensywniej
oddziaływać

próbką.

Rurka

jest

ogrzewana.

Detektor radiacyjny (chłodzony ciekłym
azotem)

–

próbka

nie

ulegała

wykraplaniu.

KOLUMNY

STOSOWANE

CHROMATOGRAFII GAZOWEJ

1) Kapilarne
Wady pierwszych kolumn kapilarnych:
- niemożność zastrzykiwania dużych próbek
- kruche
-  problemy  związane  z  wprowadzeniem
próbki i połączeniem kolumny z detektorem.
-  czas  odtwarzalnego  działania  kolumny  był
krótki
- zapychały się
- opatentowane
2)  Upakowane  (wypełnione  całkowicie
jakimś materiałem)
Materiał kolumny:
- szkło
- metal
- stal nierdzewna
- miedź
- aluminium
- teflon
Długość:  2-3  m,  zamknięte  w  zwój  o
średnicy 15 cm.
Średnica wewnętrzna: 2-4 mm
Średnica ziarna: 150-250µm
Grubość warstwy stacjonarnej: 50nm-1µm
Bardzo  ściśle  upakowane,  a  złoże  w  nich
zawarte jest jednorodne.
Cechy idealnego wypełnienia:
- małe ziarno (150-250µm)
- jednorodne
- cząsteczki powinny być sferyczne
-

cząsteczki

powinny

być

odporne

mechanicznie
-

znaczna

powierzchnia

specyficzna

(przynajmniej 1m

/g)

- stabilne w podwyższonych temperaturach
- dobrze zwilżane przez fazę stacjonarną
Z czego wynika ograniczenie dotyczące
wielkości ziarna?
p≈1/d

więc jeżeli mamy jakieś ciśnienie, to

narzuca ono minimalną średnicę ziarna.
Typy kolumn:
WCOT-  kolumna  otwarta.  Zbudowana  ze
stali  nierdzewnej,  aluminium,  plastiku,
potem  szkło,  wewnętrzna  ściana  jest

trawiona chemicznie (po to by faza
stacjonarna lepiej się trzymała)
SCOT

– Stały

nośnik

przylega

wewnętrznej ścianki.
Zaleta:

możliwość

zatrzymania

dużej

objętości fazy stacjonarnej.
Wada: Niższa sprawność niż WCOT.
FCOT – Kwarcowa, cienkościenna kapilara,
pokryta na zewnątrz poliimidem (dzięki
temu jest elastyczna). Kwarc musi być
pozbawiony

tlenków

metali,

aby

wyeliminować

adsorpcję.

Średnica

wewnętrzna:

250-320µm

(kapilary

średnicy 150-200 µm są trudne w użyciu, bo
są  bardziej  wymagające  jeśli  chodzi  o
zastrzykiwanie próbek i sposoby detekcji).
Stosuje  się  czułe  detektory  o  krótkim  czasie
odpowiedzi i rozdzielacze.
Zalety:  odporne,  znacznie  mniej  reaktywne
względem

składników

zastrzykiwanej

próbki, elastyczne
Średnica wewnętrzna: > 500µm – kolumny
megabor.
Zaleta: można zastrzykiwać duże próbki
Wada: niska sprawność

FCOT

WCOT

SCOT

Upakowane

Odporność
chemiczna

Najlepsza

Najgorsza

Długość
(mm)

10-100

1-6

Wydajność
(półki/m)

2000-
4000

1000-
4000

600-
1200

500-1000

Rozmiar
próbki (ng)

10-75

10-1000

10-
1000

10-10

Szybkość
przepływu

Szybko

Wolno

Elastyczność

Tak

Nie

Sposoby

zapobiegania

adsorpcji

wypełnieniach i ścianach kolumn:
Adsorpcja wynika z oddziaływania z
polarnym podłożem (lub z polarnym
nośnikiem) – powodują to grupy siliniolowe.

Si O

ClH

Blokowanie powierzchni.

Faza stacjonarna:
Wymagania:

- niska lotność (temp wrzenia > o 100

C niż

temp wrzenia najmniej lotnego składnika
mieszaniny)
- trwałość termiczna
- odporność chemiczna
-

odpowiednia

charakterystyka

odniesieniu  do  współczynników  retencji  i
selektywności  (dobrane  do  rozdzielanej
mieszaniny  tek  aby  uzyskać  optymalne
wartości k’ i α)
Jakie

rozpuszczalniki

spełniają

wymagania?
Faza stacjonarna powinna wykazywać różne
współczynniki

podziału

dla

różnych

składników  rozdzielanej  próbki.  Różnice
współczynników podziału nie mogą być zbyt
duże,  bo  czas  retencji  będzie  za  długi.
Podstawą podziału faz stacjonarnych jest ich
polarność (najbardziej polarne grupy:  -CN, -
CO,  -OH;  niepolarne:  C

2n+1

). Podobne

rozpuszcza się w podobnym.
Od czego zależy kolejność wymywania?
Określana  przez  punkt  wrzenia  substancji
oznaczanej.
-  polidimetylosiloksan  (max  temp  350

C) –

dla najniższej polarności.
- polifenylometylodimetylosiloksan (max
temp 350

polifenylometylosiloksan

(max

temp

250

- glikol polietylenowy (max temp 250

C) –

dla najbardziej polarnych.
Związane i usieciowane fazy stacjonarne.
Stosuje się je po to by podwyższyć trwałość
fazy  stacjonarnej  (zapobiega  „krwawieniu”
kolumny).  Jeżeli  chcemy  odmyć  kolumnę  z
zanieczyszczeń,  a  faza  stacjonarna  jest
związana  lub  usieciowana,  to  krwawienie
jest wyeliminowane.
Związane

–

chemiczne

wiązanie

monowarstwy na nośniku.
Sieciowanie  –  wykorzystuje  się  mechanizm
wolnorodnikowy  (używa  się  nadtlenków).
Dodaje  się  je  do  ciekłej  fazy  stacjonarnej,
wtedy  rodnik  inicjuje  reakcję  polimeryzacji.
Produktem

takiego

sieciowania

jest

cząsteczka o dużej masie, a taką trudniej jest
wymyć z kolumny. Można też naświetlać
promieniami gamma co prowadzi do

powstawania  wolnych  rodników  (dalej  jak
wyżej)
Fazy chiralne
Zawierają  centra  asymetryczne.  Służą  do
rozdzielania enancjomerów.
2

sposoby

rozdzielania

związków

chiralnych:
- rozdzielane substancje modyfikuje się
chemicznie za pomocą reagenta czynnego
optycznie,

który

tworzy

parę

diastereoizomerów, które można rozdzielić
- zastosowanie fazy ciekłej chiralnej.
Kiedyś

rozdzielano

aminokwasami,

zawierającymi grupy siloksanowe połączone
wiązaniami aminowymi.
Obecnie stosuje się cyklodekstryny (od 6 do
12 członów d-glukozy, połączonych w
pierścień.

Wnętrz

pierścienia

–

hydrofobowe,

zewnętrzna

część

–

lipofilowa) Stosowane są do rozdzielania
związków optycznie czynnych.

18.04.08

Konstrukcja

detektora

elektrochemicznego

Rys.3

Jednoczesne

oznaczanie

siarczków

dwusiarczków – układ jak wyżej tylko z 2
elektrodami

obie

są

elektrodami

błonkowymi

rtęciowymi.

Elektrody

obmywana po kolei.
RSSR+2H

+2e

+Hg(nad strzałką)→2RSH

RSH+Hg→Hg(SR)

(S)+2H

+2e

Utleniane są siarczki z reakcji i te które były
w roztworze.
Obie elektrody obmywane jednocześnie-
można stosować do określania czystości
piku.

Można

jednocześnie

oznaczać

substancje  utlenione  i  zredukowane  (jedna
elektroda rtęciowa, druga z węgla szklistego
– pokrywają cały zakres potencjału)
DETEKTORY SPEKTROMETRII MAS.
Sposoby połączenia obu technik:
1) Stosowane są dzielniki przepływu. Z fazy
ruchomej  wydzielana  jest  mała  cześć,  która
idzie do spektrometru masowego.
2)  Zastosowanie  poruszającego  się  pasa
transmisyjnego  (np.  drut  na  który  kapie

wyciek z kolumny, drut przemieszcza się do
komory

gdzie

zostaje

odparowany

rozpuszczalnik,  dalej  przemieszcza  się  do
komory  ze  źródłem  jonów  co  prowadzi  do
jonizującej desorpcji)
3) Termospray – roztwór fazy ruchomej jest
odparowywany  w  trakcie  przepływu  przez
ogrzewaną,  metalową  kapilarę.  Tworzy  się
aerozol roztworu i analitu. Do fazy ruchomej
dodaje  się  octan  amonu,  który  w  wyniku
odparowywania  jonizuje  próbkę.  Dobra
metoda

oznaczania

peptydów

nukleotydów.
Zalety:
-

bezpośrednie

wprowadzenie

spektrometru  masowego  całego  roztworu
opuszczającego  kolumnę  (nie  potrzeba
dzielnika)
- widma masowe są proste
-  można  od  razu  z  widma  otrzymać  masę
oznaczanej substancji
Wady:
-  termospray  może  być  stosowany  tylko  dla
cząsteczek polarnych
- nieznana jest fragmentacja związku
4) Termiczne wytwarzanie mgły (aerozolu) i
jednoczesne  usuwanie  rozpuszczalnika.  W
postaci  gazowej  pozostaje  tylko  analit.
Otrzymuje  się  widma  powstałe  w  wyniku
chemicznej  jonizacji  próbki  lub  w  wyniku
oddziaływania między elektronami.

RODZAJE

KOLUMN

CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ.
1) Chromatografia podziałowa
Stosuje

się

rozdziału

substancji

niejonowych

polarnych

masie

cząsteczkowej 1000-3000.
a)  Ciecz-ciecz  (ciecz  na  stałym  nośniku,
adsorpcja)
Wady:
- faza stacjonarna jest wymywana
-  faza  stacjonarna  nie  nadaje  się  do  elucji
gradientowej
b)  Faz  związanych  (chemiczne  związanie
cząsteczek)
Nośnikiem są ziarna jednorodne, porowate o
średnicy  3,5  lub  5µm.  Są  one  odporne
mechanicznie.  Powierzchnia  ziarna  to  w
pełni

schydrolizowana

krzemionka

(hydrofilowa i polarna). Faza stacjonarna i
faza ruchoma różnią się polarnością.

Si O

Si R

R=C

, C

Fazy normalne
Polarność: A>B>C
Kolejność wymywania:
- niepolarna faza ruchoma:

- polarna faza ruchoma:

Fazy odwrócone
Polarność: A>B>C
Kolejność wymywania:
- polarna faza ruchoma:

- niepolarna faza ruchoma:

Wypełnienie kolumny faz normalnych:
- substancja związana z materiałem kolumny
ma charakter polarny.
Mechanizm

wymywania

fazach

związanych:
a) podziałowy
b) adsorpcji (opis retencji poprzez zjawiska
adsorpcji)
Zalety fazy związanej:
Faza stacjonarna C

może przyjąć więcej

analitu, czyli możemy zastrzykiwać większe
próbki.
Fazy odwrócone:
Faza ruchoma jest polarna.
Fazy normalne:
Stosuje się takie fazy stacjonarne jak łańcuch
alkilowy zakończony grupą: -nitrylową
(najmniejsza

polarność),

-diolową,

aminową,  -dimetyloaminową  (największa
polarność)
Rozpuszczalniki:  eter  etylowy,  chloroform,
n-heksan.
Czas  retencji  jest  tym  dłuższy  im  dłuższy
jest  łańcuch  alkilowy  fazy  stacjonarnej  (im
mniej polarna jest faza stacjonarna)

SPOSOBY

ROZDZIELANIA

POMOCĄ

CHROMATOGRAFII

PODZIAŁOWEJ.
Jak wybieramy kolumnę?
Kolumny

różnią

się

polarnością.

Polarnością

różnią

się

także

anality.

Najmniej

polarne

są

węglowodory<etery<estry<ketony<aldehydy
<Amidy<aminy<alkohole<woda.
Dobieranie

fazy

stacjonarnej

konkretnego rozdzielania.
Polarność fazy stacjonarnej powinna być
zgodna z polarnością analitu. Wtedy retencja
jest optymalna. Do wymywania stosuje się
fazę

ruchomą

polarności

znacznie

różniącej się.
Dobieranie fazy ruchomej do konkretnego
rozdzielania.
Bierzemy  pod  uwagę  parametry  (k’,  N,  α),
tak aby rozdzielanie było optymalne.
Jako  pierwsze  ustalamy  k’,  potem  α.  O  k’
decyduje moc rozpuszczalnika. Miarą k’ jest
indeks  polarności  (P’)  –  wyznaczany  przez
pomiar

rozpuszczalności

rozpuszczalnikach: dioksanie, nitrometanie,
etanolu. P’ jest ilościową miarą polarności.
P’

= Ф

P’

+ Ф

P’

\(V

)

\(V

)

Zmiana P o dwie jednostki zmienia
współczynniki retencji o rząd wielkości.
Wpływ fazy ruchomej na selektywność
(α):
- optymalizacja współczynnika retencji (k’)
- zmienia się α tak by uzyskać zadowalające
rozdzielenie.

24.04.08

Fazy

ruchome

chromatografii

podziałowej:
- eter etylowy
- dichlorometan
- n-heksan
- chloroform
Wszystkie te fazy są niepolarne.

Modyfikacja

przedkolumnowa

(derywatyzacja przedkolumnowa)

Stosuje

się

np.

rozdzielania

aminokwasów. Używa się np. C

, który

tworzy fluorescencyjne izoindole.
Wykrywalność 10

-12

mola (pH).

chromatografii

podziałowej

niejednokrotnie  wytwarza  się  pochodne
związków  a  dopiero  potem  się  je  rozdziela.
Robi się tak ponieważ:
- obniżenie polarności substancji
- niektóre substancje ciężko jest wykryć  (bo
np. nie mają chromoforów, grup redoks)
- selektywne wzmocnienie sygnału detekcji.
Zalety:
- szybka, niewielka objętość próbki (µl)

CHROMATOGRAFIA

PAR

JONOWYCH.
Odmiana  chromatografii  podzialowej  w
układzie faz odwróconych.
Stosowana  jest  do  rozdzielania  jonow.  Jony
te  są  parowane  za  pomocą  przeciwjonów
tak,  że  w  roztworze  utrzymywana  jest
obojetna  cząsteczka,  która  może  być
rozdzielana na zwykły nosniku.
Stosuje  się  ją  do  rozdzielania  chloranow  i
azotanów,  duzych  jonów  i  surfaktantów
(wszystko  to  można  rozdzielać  także  przy
pomocy  chromatografii  jonowej  ale  ta
technika jest mniej efektywna).
Najczęściej stosowane przeciwjony:
Aminy,  kwasy  karboksylowe  i  sulfonowe,
barwniki.
Rozdzielanie enecjomerów:
-  Stosuje  się  chiralne  fazy  stacjonarne  i
chromatografie

cieczową

można

rozdzielić

enancjomery

skalę

preparatywną,  im  niższa  jest  temperatura
tym lepszy jest współczynnik podziału.
-  Stosuje  się  cyklodekstryny  które  tworzą  z
enancjomerami kompleksy o różnych stałych
trwałości.

CHROMATOGRAFIA ADSORPCYJNA.
Fazy stacjonarne:
- Krzemionka (SiO

) – bardzo polarna

- Aluminium (AlO

) – bardzo polarna

Mechanizm rozdzielania:
W skutek adsorpcji kolejność wymywania z
kolumy:

Olefiny

(najszybciej),

węglowodory

aromatyczne,  halogenki  i  siarczki,  etery,
nitrozwiązki,  estry  i  ketony,  alkohole,
aminy,  sulfony,  sulfotlenki,  amidy,  kwasy
karboksylowe (najwolniej)

Fazy ruchome są polarne.
Moc rozpuszczalnika (moc elucyjna)
Miara  energii  adsorpcji  na  jednostkę
powierzchni [J/m

]

Optymalizacja pomiarow.
Aby zoptymalizować pomiar trzeba wybrać
rozpuszczalnik

optymalnej

mocy

elucyjnej. Robi się to metodą prób i błędów.
Wybiera się rozpuszczalnik zbyt slaby i zbyt
mocny,  a  następnie  miesza  sieje  w  takim
stosunku aby uzyskać optimum rozdzielenia.
Mieszając  rozpuszczalniki  wplywamy  na
współczynnik  selektywności  (α)  tak  aby  k’
było stałe, przy  czym k’ -  musi być na tyle
duże aby rozdzielenie było możliwe.
Najpierw

badamy

chromatografii

cienkowarstwowej

dopiero

potem

wprowadzamy na kolumnę.
Zastosowanie chromatografii adsorpcyjnej:
- zw. niepolarne o masie cząsteczkowej <
5000.
Zalety:
- zdolnośc do różnicownia izomerów
geometrycznych

homologów,

konformerów.

CHROMATOGRAFIA JONOWA.
HPLC

wypelnione

wymieniaczami

jonowymi

(kolumna

anionitowa,

kationitowa).
Detekcja: mierzy się przewodnictwo.
Na  kolumnę  podaje  się  bufor  (np.  roztwór
kwasu)  a  potem  zastrzykuje  się  probkę  z
jonami.
Grupy  funkyjne  slużące  do  wymiany
jonowej:
-  Kationity  (wymieniają  kationy):  grupa
sulfonowa  (-SO

-H

), kw. karboksylowe (-

COO-H

)

- Anionity (wymieniaja aniony): aminy (-
N(CH

)

-OH

Kationity: XRSO

+ M

= (RSO

)

+ MH

Anionity:

XRN(CH

)

[RH(CH

)

]

x-1

+ xOH

Stała wymiany K

opisuje równowagi

jonowymienne.
K

= {[ RSO

]s[H

]aq}/{[RSO

]s[B

]aq}

[ RSO

]s/[B

]aq = K

{[RSO

]s/[H

]aq } = const

W roztworach wodnych stężenie jonow H

jest duzo większe niż w roztworach
rozdzielanych. Wymieniacz jonowy ma duże
stężenie miejsc jonowymiennych, dużo
większe niż stężenie jonów H

w roztworze.

Dlatego

przyjmujemy,

że

{[RSO

]s/[H

]aq } = const.

Jeżeli:
[RSO

]>>>[ RSO

]aq>>>[B

]aq, to:

[ RSO

]s/[B

]aq = K = C

K = K

+ const, C

- stężenie w fazie

stacjonarnej, C

- stężenie w fazie ruchomej.

odpowiedzialna jest za powinowactwo

kationu do kationu oznaczanego względem
innego jonu. Jeżeli wartość K

jest duża to

znaczy to, że kation w przeważającym czasie
elucji przebywa w fazie stacjonarnej, jęzeli
K

jest małe tzn że kation w przeważającym

czasie elucji przebywa w fazie ruchomej.
Wartość

rośnie

następującej

kolejności:
LI

<NH

<Rb

<Cs

<Ag

<Tl

<HO

<Mg

<Zn

<Co

<Cu

<Cd

<Ni

<Ca

<Pb

<Ba

<OH

<CH

COO

<HCOO

<Cl

<Br

<NO

<I-<C

<SO

Fazy stacjonarne:
Kiedyś stosowano żywice (kiepskie bo
anality wykazywały bardzo powolną dyfuzję
przez ziarno, pod wpłwem ciśnienia ziarna
zgniataly

się

zapychały

kolumnę).

Zastosowano

więc

złoża

pelikularne

(średnica  30-40µm,  nieporowate,  sferyczne,
pokryte  warstwą  zywicy  jonowymiennej),
ale duże ziarna powodowały małą sprawność
kolumny.  Obecnie  stosuje  się  ziarna  z
krzemionki

pokryte

materiałem

jonowymiennym (porowate, szybka dyfuzja)
o średnicy 3,5-10µl. Zastrzykiwana probka
musi bć niewielka.

Faza ruchoma:
- powinna rozpuszczać próbkę
- musi mieć taką moc elucyjną aby czasy
retencji były akceptowalne
- rozpuszczalnik musi oddzialywać z
substancją

rozpuszczoną

sposób

różnicujący.
Zastosowanie:
- w chemii nieorganicznej.

16.05.08

CHROMATOGRAFIA

STANIE

NADKRYTYCZNYM (SFC)
Połączenie

chromatografii

gazowej

cieczowej.
Cechy SFC:
- technika uzupełniająca w stosunku do GC i
LC.
- stosowana do rozdzielania substancji
nielotnych lub niestabilnych termicznie
- rozdzielanie substancji pozbawionych grup
funkcyjnych (1/4 związków)

Porównanie

płynów

nadkrytycznych

gazami i cieczmi:

Gaz

Ciecz
nadkrytyczna

Ciecz

Gęstość
[g/cm

]

(0,6-2)*10

-3

0,2-0,5

0,6-2

Współczynnik
dyfuzji
[cm

/s]

(1-3)*10

-1

-3

-10

-4

(0,2-2)*10

-5

Lepkość
[gcm

-1

]

(1-3)*10

-3

(1-3)*10

-4

(0,2-3)*10

-2

Fazy ruchome w SFC:
- CO

= 31,3

C, p

= 72,9 atm)

- N

O (T

= 36,5

C, p

= 71,7 atm)

- NH

= 132,5

C, p

= 112,5 atm)

- n-butan (T

= 152

C, p

= 37,5 atm)

Zdolność

rozpuszczania

substancji

nielotnych o dużej masie cząsteczkowej.
- CO

rozpuszcza n-alkany (do 30 at. węgla),

di-n-alkiloftalany

(4-16

at.

węgla),

poliaromatyczne węglowodory.

Aparatura:

Wpływ  różnych  parametrów  na  rozdzielanie
w SFC:
- ciśnienie ma duzy wpływ na współczynnik
retencji  (k’).  Im  wyższe  jest  ciśnienie,  tym
większa  jest  gęstość  fazy  ruchomej,  co
powoduje

zwiększenie

rozpuszczalności

analitów,  a  to  oznacza,  że  czas  elucji  ulega
skroceniu  (czyli,  że  k’  się  zmniejsza).  Np.
jeśli  ciśnienie  CO

rosnie od 70 do 90 atm,

to  czas  wymywania  spada  z  25  d0  5  minut.
Ciśnienie  jest  najważniejszym  parametrem
optymalizującym pomiar.

Fazy stacjonarne w FSC:
Kolumny:
-  otwarte  (ściany-  usieciowant  silikon,  dł  –
10-20m, śr. wew. – 50-100µm)
- upakowane (śr. – 0,5-4,6mm, śr. ziarna – 3-
10µm)

Fazy ruchome:
- CO

Zalety CO

-  dobry  rozpuszczalnik  wielu  substancji
organicznych
-  nie  absorbuje  UV  (można  stosować
detektor UV-vis)
- bezwonny, nietosyczny
- łatwo dostępny, tani
- niskie parametry krytyczne
Wady:
- absorbuje w podczerwieni
- koszty (droga aparatura ciśnieniowa)

Modyfikatory fazy ruchomej:
Do  CO

dodaje się polarny metanol. Za

pomocą dodatków zmieniamy współczynnik
selektywności (α).

Detektory:

-  płomieniowo-jonizacyjny  (czuły  na  każdy
analit  opuszczający  kolumnę,  pracuje  w
sposób ciągły bez zaburzeń)
- detektor ze spektrometrii mas
- UV-vis
- spektrometrii w podczerwieni
- emisji fluorescencyjnej
- termojonowy
- płomieniowo-fotometryczny

Porównanie  SFC  z  innymi  odmianami
chromatografii kolumnowej:
- SFC jest szybsza niż LC (bo faza ruchoma
ma mniejszą lepkość)
-  SFC-  poszerzanie  pików  jest  większe  niż
w LC ale mniejsze niż w GC
- rozdzielanie W SFC jest szybsze niż w LC
- mniejsze rozmycie pasma niż w GC
-

liniowa

prędkość

przepływu

przy

optymalnych  warunkach  jest  4  razy  większa
dla  SFC  niż  dla  HPLC  (co  oznacza  4  razy
krótszy czas retencji dla SFC)
-  w  SFC  faza  ruchoma  nie  tylko  przenosi
anality,  ale  także  odziaływuje  z  nimi  przez
co  wpływa  na  współczynnik  selektywności
(α).
- zdolność rozpuszczania fazy nadkrytycznej
zależy  od  składu  chemicznego  i  gęstości
cieczy w stanie nadkrytycznym
-

można

wpływać

współczynnik

selektywności

zmieniając

skład

fazy

ruchomej.

Stosowalność GC, LC, SFC w zależności od
masy cząsteczkowej:
GC – do około 10

[d]

LC – do około 10

[d]

SFC – do około 10

[d]

Zastosowania SFC:
Produkty

naturalne,

leki,

produkty

żywnościowe,

pestycydy

herbicydy,

surfaktanty,

polimery

dodatki

polimerów,

paliwa

kopalne,

materiały

wybuchowe, paliwa napędowe.

WYSOKOSPRAWNA
ELEKTROFOREZA KAPILARNA.
3 wady klasycznej elektroforezy:
- powolna

- wymaga ogromnych przygotowań
- bardzo słaba odtwarzalność

Zasada działania elektroforezy kapilarnej:
Rozdzielanie

naładowanych

substancji

rozpuszczonych w roztworze polarnego
rozpuszczalnika.

Wykorzystywana

jest

różnica szybkości migracji analitu w polu
elektrycznym.

Aparatura:

Zastrzykiwanie próbki
- hydrodynamiczne:

- elektrolityczne:

Zalety kapilar w porównaniu do bloku
żelowego:

-  kapilara:  średnica  wewnętrzna  –  25-30µm,
długość  –  1m,  objętość  zastrzykiwanej
próbki – 1-10µl (zaleta!)
- dobrze odprowadzają ciepło Joula (bo duży
stosunek powierzchni do objętości)
-  wysoki  opór  omowy  (można  stosować
bardzo silne pola elektryczne: 100-500V/cm)
- krótki czas analizy
-  dużo  większa  rozdzielczość  (sprawność
nawet do 10

półki teoretycznej)

Odmiany elektroforezy kapilarnej:
1) Kapilarna elektroforeza strefowa (CZE)
Kapilara wypełniona jest buforem, przepływ
elektroosmotyczny,

rozdzielenie

spowodowane

różnicą

ruchliwości

rozdzielają się na strefy.

Źle rozdziela substancje obojętne, bo
wszystkie są w jednej strefie.

Zastosowanie:
Równoczesne

rozdzielanie

kationów

anionow, ale musza się one różnić gęstością
ładunku.

Rozdzielanie

aminokwasów,

peptydów,

jonów

organicznych

nieorganicznych, enancjomerów. Badanie
czystości białek, konformerów.
Selektywność:
Zależy

mechanizmu

rozdzielania.

Najłatwiej  zmienia  się  ją  zmieniając  pH
buforu  lub  dodając  do  buforu  różne
substancje  modyfikujące.  Oba  sposoby
wpływają  na  zmianę  EOF  (ale  przepływ
elektroosmotyczny  nie  jest  odpowiedzialny
za selektywność)

Czas migracji:
Zależy  od  gęstości  ładunku  jonów.  Im
większy stosunek ładunku do promienia jonu
tym krótszy czas migracji.
µ

EOF

(anion) > µ

(anion) to aniony

poruszają sie w tą sama stronę co kationy,
tyle że wolniej. Jeśli wyeliminujemy EOF, to

kationy zaczną płynąc do katody, aniony do
anody, a substancje obojętne w ogóle się nie
ruszą.

2)

Micelarna

chromatografia

elektrokinetyczna (MEKC)
Jedyna  odmiana  elektroforezy  kapilarnej  za
pomocą  której  można  rozdzielić  substancje
naładowane i obojętne. Do buforu dodawany
jest  detergent,  substancje  rozdzielają  się  w
skutek oddziaływan hydrofobowych.

Substancje do tworzenia miceli:
Anionowe: SDS
Kationowe: sole alkiloaminowe
Niejonowe: TRIS

k’ = n

– współczynnik retencji

k’ = (t

-t

)/[t

(1-t

)] = K*V

K- wsółczynnik podziału, V

– objętość fazy

miceli, V

M –

objętość fazy ruchomej.

Rozdzielczość:

MERC

−

Kiedy R

MECK

dąży do R

Gdy t

dąży do α, wtedy ostatni człon w

MECK

znika.

Gdy t

dąży do 0 to R

MECK

dąży do

S,max

Jak poprawić rozdzielczość?
- zwiększając ilość półek teoretycznych
- zwiększając selektywność
-

optymalizując

współczynnik

retencji

(zmieniamy go poprzez zmianę stężenia
substancji powierzchniowo czynnej. k’
wzrasta

wraz

wzrostem

stężenia

surfaktantu.  Im  większe  jest  stężenie
surfaktantu,  tym  większe  prądy  płyną  co
powoduje  grzanie  się  układu  –  górne
ograniczenie  stężenia  surfaktantu,  dolne  –
stężenie krytyczne tworzenia się miceli)

Zastosowanie:
- rozdzielanie substancji obojętnych zarówno
hydrofobowych jak i hydrofilowych oraz
jonowych:

aminokwasy,

nukleotydy,

witaminy, węglowodory aromatyczne.

Aniony są rozdzielane z uwagi na ich
różnicę

ruchliwości

elektroforetycznej

(mniej naładowane poruszają się szybciej niż
te bardziej naładowane).

Rozdzielanie jonów:
-  różnica  ruchliwości  elektroforetycznej
oznaczanych jonów
-  oddziaływania  Kulombowskie  jonów  i
jonów tworzących micele
- oddziaływania hydrofobowe w micelach

Substancje modyfikujące bufory:
Bufory  modyfikujemy  ponieważ  chcemy
zmienić

ładunek

miceli

lub

ładunek

cząsteczki oznaczanej.
Np.  -  dodatek  soli  tetrabutyloamoniowej  do
SDS  podwyższa  rozpuszczalność  kwasów
karboksylowych  przez  co  podwyższa  się
stężenie miceli.
- dodatek kationów Zn

lub Cu

do buforu

w którym mamy ujemnie naładowane micele
powoduje

tworzenie

kompleksów

powierzchni miceli
- tworzenie drugiej pseudofazy: dodatek
cyklodekstryn pozwala rozdzielać substancje
bardzo

hydrofobowe.

Cyklodekstryny

poruszają się z prędkością EOF (bo są
obojętne, kation znajduje się w środku)
- dodatek rozpuszczalnika organicznego –
zmienia przepływ EOF bo zmienia potencjał
elektrokinetyczny,

zmienia

także

selektywnośc, można wtedy zastosować
gradienty elucji.

3) Kapilarna elektroforeza żelowa (CGE)
Kapilarę

wypełnia

polimer.

Podstawą

rozdzielania

jest

wielkość

cząsteczki

substancji rozdzielanej (rozdzielanie oparte
na mechanizmie przesiewania jonowego).

Jest to elektroforeza strefowa. Najszybciej
poruszają się najmniejsze kationy. Przepływ
elektroosmotyczny jest wyeliminowany.
Zastosowanie:

rozdzielanie

protein,

sekwencjonowanie

DNA,

oznaczanie

fragmentów DNA.
Rozdzielczość: Zależy od procentowej
zawartości monomerów w polimerze:
2-6% - dobrze usieciowany
0,1-15% - liniowy
0,05-1,2% - agarowa
Sprawność kapilary: N≈10

-10

4)  Kapilarne  ogniskowanie  izoelektryczne
(CIEF)
Bardzo  wysoka  rozdzielczość  (∆pI  =
0,005pH). Ścianki kapilary zabezpieczone są
tak,  że  przepływ  elektroosmotyczny  jest
wyeliminowany.

Wykorzystuje

się

właściwości analitów związane z różną
wartością

punktów

izoelektrycznych.

Kapilara

wypełniona

jest

buforem.

Stosowany jest gradient pH tworzony przy
pomocy amfolitów.

3<pH<9
pH

anolitu

<pI

min

katolitu

>pI

max

Anolit (pH=3, np. 0,02M H

) i katolit

(pH=9,  np.  0,02M  NaOH)  są  zawsze
różnymi elektrolitami.
Aby  wytworzyć  gradient  pH  stosujemy
amfolity (substancje o cechach kwasowych i
zasadowych,  mogą  to  być  albo  kationy  albo
aniony).  Są  one  dobierane  tak  aby  pokryć
cały zakres pH. Brak klasycznego zastrzyku,
tu  od  razu  całą  kapilarę  wypełnia  się
mieszaniną

wszystkiego.

Następnie

przykłada się napięcie co powoduje gradient
pH.  Jony  oznaczane  płyną  w  to  miejsce  w
kapilarze  gdzie  mogą  zostać  zobojętnione.
Sygnałem końca  analizy jest to, że przestaje
płynąć  prąd.  Możemy  modyfikować  ściany
kapilary  poprzez  dodatek  detergentu,  ale
wtedy  ciężko  jest  uzyskać  powtarzalność
wyników.

Kolejnym

etapem

jest

wymywanie roztworu z kapilary np. za
pomocą

różnicy

ciśnień

przepychamy

otrzymane strefy przez detektor. Jeżeli

kapilara jest z żelem to zastępujemy H

NaOH i włączamy ponownie prąd.

Zastosowanie:
- rozdzielania białek
-  nie  dzielą  się  substancje  obojętne  i  nie  da
się  oddzielić  anionów  od  kationów,  można
oddzielic  tylko  kationy  od  kationów,  a
aniony od anionów.

Rozdzielczość:
Jest  tym  większa  im  większe  jest  pole
elektryczne,  im  mniejsze  są  zmiany  pH  w
kapilarze.
Przepływ  elektroosmotyczny  musi  być
wyeliminowany.

Zalety:
- próbka może być duża
-  można  oznaczać  bardzo  rozcieńczone
roztwory
-  jeśli  kapilara  wypełniona  jest  żelem  to
proteiny  nie  agregują  po  osiągnięciu  punktu
izoelektrycznego.

5)

Elektroforeza

kapilarna

stref

poruszających  się  z  taką  samą  prędkością
(CITP)
Służy  do  rozdzielania  jonów  tego  samego
znaku  oraz  do  zagęszczania  anionów  lub
kationów.

Nie

można

jednoczeeśnie

rozdzielać kationów i anionów. Ruchliwość
jonów oznaczanych ma się zawierac miedzy
ruchliwością

buforu

czołowego

końcowego. W obrębie kazdej ze stref różne
jest  natężenie  pola  elektrycznego.  Granica
pomiędzy pasmami jest  bardzo ostra. Pasma
poruszają się z tą samą prędkością. W każdej
ze stref stężenie jest stałe (stężenie analitu w
każdej  ze  stref  =  stężenie  analitu  buforu
czołowego).  Przepływ  elektroosmotyczny
jest  wyeliminowany.  Detekcja  –  UV-vis,
detektor  termiczny.  Zaleta:  Nie  trzeba
zmieniać kolumny tylko skład buforu.