1

1

Pracownia Immunologii

Transplantacyjnej

Metody oznaczania antygenów

zgodno

ś

ci tkankowej

mgr Marcin Wawrzyniak

Zakład Laboratoryjnej Immunologii Medycznej

Uniwersytet Medyczny w Łodzi

2

Pierwsze wzmianki o przeszczepianiu:



Indie (odtwarzanie odci

ę

tych nosów)



Chiny („zamiana” serc dwóch

ż

ołnierzy)



IV w.n.e -

Ś

wi

ę

ci Kosma i Damian -> przeszczep nogi



II wojna – próby przeszczepiania skóry u poparzonych

ż

ołnierzy



…

Pierwszy udany przeszczep - nerki – 1954r



Przeszczep miedzy bli

ź

niakami monozygotycznym

Historia transplantologii

p.n.e

3

Transplantologia – jedna z najszybciej rozwijaj

ą

cych si

ę

gał

ę

zi medycyny

Szansa całkowitego wyleczenia wielu chorych, dla których nie było
wcze

ś

niej ratunku

Immunologia transplantacyjna

Przeszczepianie narz

ą

dów, transplantacja

(z

łac.

transplantare - szczepi

ć

i plantare - sadzi

ć

)

-„przeniesienie” narz

ą

du w cało

ś

ci lub cz

ęś

ci, tkanki lub komórek z jednego

ciała na inne (lub w obr

ę

bie jednego ciała)

Przeszczep (transplantat) - komórki,

tkanki

(

skóra

,

rogówka

,) lub

narz

ą

d

(

serce

,

nerka

) pobrane od dawcy, podlegaj

ą

ce

chirurgicznemu

przeszczepieniu do organizmu biorcy.

Cel: zast

ą

pienie tkanek lub organów, które nie funkcjonuj

ą

prawid

ł

owo

4

Narz

ą

dy i tkanki przeszczepiane w klinice człowieka

8

Rodzaje przeszczepów:

(ze wzgl

ę

du na ró

ż

nice genetyczne miedzy dawc

ą

a biorc

ą

)

Allogeniczny – mi

ę

dzy ró

ż

nymi

genetycznie osobnikami tego samego
gatunku

Ksenogeniczny – mi

ę

dzy

osobnikami odmiennych gatunków

Isogeniczny – mi

ę

dzy identycznymi

osobnikami tego samego gatunku

Autogeniczny – dawca i biorca to ten
sam osobnik

9

- przeszczep (tkanki lub organy) jest traktowany przez układ odporno

ś

ciowy

biorcy jako obcy (rozpoznawany, niszczony)



odrzucenie przeszczepu

- w przypadku iso- i autogenicznych przeszczepów



brak odpowiedzi biorcy

na przeszczep.

Jaka jest główna cecha przeszczepu, która jest rozpoznawana przez biorc

ę

???

-ró

ż

nice w allotypach cz

ą

steczek MHC (I i II)

Główn

ą

barier

ą

w transplantologii s

ą

genetyczne ró

ż

nice mi

ę

dzy dawc

ą

a biorc

ą

2

10

CZ

Ą

STECZKI MHC

11

MECHANIZMY SWOISTE I NIESWOISTE

ODPOWIEDZI IMMUNOLOGICZNEJ

13

MHC – major histocompatibility complex

- antygeny zgodno

ś

ci tkankowej

- zespół genów je koduj

ą

cych = główny układ zgodno

ś

ci tkankowej

(MHC)

(HLA – człowiek; H-2 – mysz)

- odgrywa kluczow

ą

rol

ę

w komunikacji mi

ę

dzy komórkami układu

odporno

ś

ciowego

-zasadnicza rola MHC – prezentacja obcych cz

ą

steczek własnym

limfocytom T

MHC - major histocompatibility complex

HLA - human leukocyte antigen

15

Budowa cz

ą

steczek MHC

•

Istniej

ą

cz

ą

steczki MHC klasy I i klasy II

•

ró

ż

ni

ą

si

ę

pod wzgl

ę

dem budowy i funkcji

MHC I

Wszystkie komórki

j

ą

drzaste

MHC II

Komórki prezentuj

ą

ce

antygen:

-Limfocyty B

-Komórki dendrytyczne

-Monocyty

16

Prezentacja Ag limfocytom T

Limfocyty T nie s

ą

w stanie rozpoznawa

ć

Ag wolnych a jedynie takie

które s

ą

prezentowane przez cz

ą

steczki MHC

MHC - umo

ż

liwia rozpoznawanie przez limf. T ró

ż

nych patogenów

• Wewn

ą

trzkomórkowych – MHC I

• Zewn

ą

trzkomórkowych – MHC II

patogen

peptyd

HLA I

HLA II

17

Z udzia

ł

em cząstek MHC klasy I

(dotyczy g

ł

ównie Ag

syntetyzowanych w komórce

prezentującej – Ag endogenne)

Limfocyt T CD8+

Cz

ą

steczki MHC

3

18

Z udzia

ł

em MHC II

(dotyczy przede wszystkim Ag
poch

ł

oniętych przez komórki

prezentujące)

Limfocyt T CD4+

Cz

ą

steczki MHC

20

MHC - genetyka



Kompleks genów układu MHC znajduje si

ę

na 6-tym

chromosomie



Obejmuje ponad 4 mln pz, zawiera ponad 100 genów !!!



MHC – wiele genów odznaczaj

ą

cych si

ę

najwi

ę

kszym

polimorfizmem

21

Locus

Allel

Polimorfizm

MHC - genetyka

Cz

ą

steczki HLA I



HLA-A, HLA-B, HLA-C (ła

ń

cuch

α

)

HLA II



HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR (ła

ń

cuchy

α

i

β

)

22

Genetyka - przypomnienie

Polimorfizm – zró

ż

nicowanie genów w danym locus

(dany wariant z cz

ę

sto

ś

ci

ą

wi

ę

ksza ni

ż

1%)

Allele – odmiany genów, które znajduj

ą

si

ę

w danym locus

Locus – miejsce, które gen zajmuje fizycznie na chromosomie

23

MHC – polimorfizm

Geny uk

ł

adu MHC cechuje wysoki polimorfizm

24

HLA –

polimorfizm

4

25

Metody oznaczania

antygenów zgodno

ś

ci

tkankowej

26

- Niezb

ę

dna jest ocena stopnia zgodno

ś

ci mi

ę

dzy dawc

ą

a biorc

ą



w celu zminimalizowania / wykluczenia rozpoznania przeszczepu

jako „intruza” przez biorc

ę

Poprzez oznaczanie antygenów zgodno

ś

ci tkankowej d

ąż

ymy do

rozpoznania i zminimalizowania ró

ż

nic genetycznych mi

ę

dzy dawca a

biorc

ą

.

Metody oznaczania antygenów

zgodno

ś

ci tkankowej

27

Metody oznaczania antygenów

zgodno

ś

ci tkankowej

1) Metody serologiczne

2) Metody genetyczne

28

Metody serologiczne

Reakcje oparte na reakcji cytotoksyczno

ś

ci mediowanej przez przeciwciała i

zale

ż

nej od komplementu



zwi

ą

zanie swoistych przeciwciał z antygenami (MHC) na powierzchni

komórek (limfocytówT)

(

+

)

Zalety

: szybko

ść

, niskie koszta

(

-

)

Wady

: brak mo

ż

liwo

ś

ci rozró

ż

niania znanych wariantów allelicznych HLA

konieczno

ść

wykorzystania

ż

ywych komórek do badania.

29

Metody serologiczne

30

Metody genetyczne

• Najbardziej powszechny sposób typowania HLA

• Analiza polimorfizmu na poziomie DNA (nie na poziomie białka)

( + ) Zalety

: mo

ż

liwo

ść

rozró

ż

nienia praktycznie wszystkich alleli

znikomy odsetek bł

ę

dów

łatwa standaryzacja

badanie martwych komórek

5

31

Metody genetyczne

-Technika szeroko stosowania w biologii molecularnej

- nazwa pochodzi od jednego ze sładników reakcji – Polimerazy DNA –
stosowanej do amplifikacji fragmentów DNA poprzez replikacje in vitro

PCR - Polymerase chain reaction

32

Zasada działania reakcji PCR

Krok 1 - Denaturacja (94

°

C)

w wyniku ogrzewania dochodzi do rozplecenia podwójnej
helisy DNA

33

Krok 2 – Przy

ł

ączanie starterów (60

°

C)

Dodanie jednoniciowych primerów które

ł

ączą się z DNA

którego poszukujemy. (primery

ł

ączą się z

jednoniciowym DNA ze względu na komplementarność)

Zasada działania reakcji PCR

34

Krok 3 – Wyd

ł

użanie DNA (72

°

C )

Dodajemy pojedyncze nukleotydy i enzym (polimerazę

Taq

polymerase

)

Stosujemy polimerazę bakteryjną ponieważ
Temperatura reakcji jest wysoka a optymalna temperatura
dla ludzkiej polimerazy to oko

ł

o 37

°C

Zasada działania reakcji PCR

37

Elektroforeza w

ż

elu agarozowym

38

Elektroforeza w

ż

elu agarozowym