1
1
Pracownia Immunologii
Transplantacyjnej
Metody oznaczania antygenów
zgodno
ś
ci tkankowej
mgr Marcin Wawrzyniak
Zakład Laboratoryjnej Immunologii Medycznej
Uniwersytet Medyczny w Łodzi
2
Pierwsze wzmianki o przeszczepianiu:
Indie (odtwarzanie odci
ę
tych nosów)
Chiny („zamiana” serc dwóch
ż
ołnierzy)
IV w.n.e -
Ś
wi
ę
ci Kosma i Damian -> przeszczep nogi
II wojna – próby przeszczepiania skóry u poparzonych
ż
ołnierzy
…
Pierwszy udany przeszczep - nerki – 1954r
Przeszczep miedzy bli
ź
niakami monozygotycznym
Historia transplantologii
p.n.e
3
Transplantologia – jedna z najszybciej rozwijaj
ą
cych si
ę
gał
ę
zi medycyny
Szansa całkowitego wyleczenia wielu chorych, dla których nie było
wcze
ś
niej ratunku
Immunologia transplantacyjna
Przeszczepianie narz
ą
dów, transplantacja
(z
łac.
transplantare - szczepi
ć
i plantare - sadzi
ć
)
-„przeniesienie” narz
ą
du w cało
ś
ci lub cz
ęś
ci, tkanki lub komórek z jednego
ciała na inne (lub w obr
ę
bie jednego ciała)
Przeszczep (transplantat) - komórki,
tkanki
(
skóra
,
rogówka
,) lub
narz
ą
d
(
serce
,
nerka
) pobrane od dawcy, podlegaj
ą
ce
chirurgicznemu
przeszczepieniu do organizmu biorcy.
Cel: zast
ą
pienie tkanek lub organów, które nie funkcjonuj
ą
prawid
ł
owo
4
Narz
ą
dy i tkanki przeszczepiane w klinice człowieka
8
Rodzaje przeszczepów:
(ze wzgl
ę
du na ró
ż
nice genetyczne miedzy dawc
ą
a biorc
ą
)
Allogeniczny – mi
ę
dzy ró
ż
nymi
genetycznie osobnikami tego samego
gatunku
Ksenogeniczny – mi
ę
dzy
osobnikami odmiennych gatunków
Isogeniczny – mi
ę
dzy identycznymi
osobnikami tego samego gatunku
Autogeniczny – dawca i biorca to ten
sam osobnik
9
- przeszczep (tkanki lub organy) jest traktowany przez układ odporno
ś
ciowy
biorcy jako obcy (rozpoznawany, niszczony)
odrzucenie przeszczepu
- w przypadku iso- i autogenicznych przeszczepów
brak odpowiedzi biorcy
na przeszczep.
Jaka jest główna cecha przeszczepu, która jest rozpoznawana przez biorc
ę
???
-ró
ż
nice w allotypach cz
ą
steczek MHC (I i II)
Główn
ą
barier
ą
w transplantologii s
ą
genetyczne ró
ż
nice mi
ę
dzy dawc
ą
a biorc
ą
2
10
CZ
Ą
STECZKI MHC
11
MECHANIZMY SWOISTE I NIESWOISTE
ODPOWIEDZI IMMUNOLOGICZNEJ
13
MHC – major histocompatibility complex
- antygeny zgodno
ś
ci tkankowej
- zespół genów je koduj
ą
cych = główny układ zgodno
ś
ci tkankowej
(MHC)
(HLA – człowiek; H-2 – mysz)
- odgrywa kluczow
ą
rol
ę
w komunikacji mi
ę
dzy komórkami układu
odporno
ś
ciowego
-zasadnicza rola MHC – prezentacja obcych cz
ą
steczek własnym
limfocytom T
MHC - major histocompatibility complex
HLA - human leukocyte antigen
15
Budowa cz
ą
steczek MHC
•
Istniej
ą
cz
ą
steczki MHC klasy I i klasy II
•
ró
ż
ni
ą
si
ę
pod wzgl
ę
dem budowy i funkcji
MHC I
Wszystkie komórki
j
ą
drzaste
MHC II
Komórki prezentuj
ą
ce
antygen:
-Limfocyty B
-Komórki dendrytyczne
-Monocyty
16
Prezentacja Ag limfocytom T
Limfocyty T nie s
ą
w stanie rozpoznawa
ć
Ag wolnych a jedynie takie
które s
ą
prezentowane przez cz
ą
steczki MHC
MHC - umo
ż
liwia rozpoznawanie przez limf. T ró
ż
nych patogenów
• Wewn
ą
trzkomórkowych – MHC I
• Zewn
ą
trzkomórkowych – MHC II
patogen
peptyd
HLA I
HLA II
17
Z udzia
ł
em cząstek MHC klasy I
(dotyczy g
ł
ównie Ag
syntetyzowanych w komórce
prezentującej – Ag endogenne)
Limfocyt T CD8+
Cz
ą
steczki MHC
3
18
Z udzia
ł
em MHC II
(dotyczy przede wszystkim Ag
poch
ł
oniętych przez komórki
prezentujące)
Limfocyt T CD4+
Cz
ą
steczki MHC
20
MHC - genetyka
Kompleks genów układu MHC znajduje si
ę
na 6-tym
chromosomie
Obejmuje ponad 4 mln pz, zawiera ponad 100 genów !!!
MHC – wiele genów odznaczaj
ą
cych si
ę
najwi
ę
kszym
polimorfizmem
21
Locus
Allel
Polimorfizm
MHC - genetyka
Cz
ą
steczki HLA I
HLA-A, HLA-B, HLA-C (ła
ń
cuch
α
)
HLA II
HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR (ła
ń
cuchy
α
i
β
)
22
Genetyka - przypomnienie
Polimorfizm – zró
ż
nicowanie genów w danym locus
(dany wariant z cz
ę
sto
ś
ci
ą
wi
ę
ksza ni
ż
1%)
Allele – odmiany genów, które znajduj
ą
si
ę
w danym locus
Locus – miejsce, które gen zajmuje fizycznie na chromosomie
23
MHC – polimorfizm
Geny uk
ł
adu MHC cechuje wysoki polimorfizm
24
HLA –
polimorfizm
4
25
Metody oznaczania
antygenów zgodno
ś
ci
tkankowej
26
- Niezb
ę
dna jest ocena stopnia zgodno
ś
ci mi
ę
dzy dawc
ą
a biorc
ą
w celu zminimalizowania / wykluczenia rozpoznania przeszczepu
jako „intruza” przez biorc
ę
Poprzez oznaczanie antygenów zgodno
ś
ci tkankowej d
ąż
ymy do
rozpoznania i zminimalizowania ró
ż
nic genetycznych mi
ę
dzy dawca a
biorc
ą
.
Metody oznaczania antygenów
zgodno
ś
ci tkankowej
27
Metody oznaczania antygenów
zgodno
ś
ci tkankowej
1) Metody serologiczne
2) Metody genetyczne
28
Metody serologiczne
Reakcje oparte na reakcji cytotoksyczno
ś
ci mediowanej przez przeciwciała i
zale
ż
nej od komplementu
zwi
ą
zanie swoistych przeciwciał z antygenami (MHC) na powierzchni
komórek (limfocytówT)
(
+
)
Zalety
: szybko
ść
, niskie koszta
(
-
)
Wady
: brak mo
ż
liwo
ś
ci rozró
ż
niania znanych wariantów allelicznych HLA
konieczno
ść
wykorzystania
ż
ywych komórek do badania.
29
Metody serologiczne
30
Metody genetyczne
• Najbardziej powszechny sposób typowania HLA
• Analiza polimorfizmu na poziomie DNA (nie na poziomie białka)
( + ) Zalety
: mo
ż
liwo
ść
rozró
ż
nienia praktycznie wszystkich alleli
znikomy odsetek bł
ę
dów
łatwa standaryzacja
badanie martwych komórek
5
31
Metody genetyczne
-Technika szeroko stosowania w biologii molecularnej
- nazwa pochodzi od jednego ze sładników reakcji – Polimerazy DNA –
stosowanej do amplifikacji fragmentów DNA poprzez replikacje in vitro
PCR - Polymerase chain reaction
32
Zasada działania reakcji PCR
Krok 1 - Denaturacja (94
°
C)
w wyniku ogrzewania dochodzi do rozplecenia podwójnej
helisy DNA
33
Krok 2 – Przy
ł
ączanie starterów (60
°
C)
Dodanie jednoniciowych primerów które
ł
ączą się z DNA
którego poszukujemy. (primery
ł
ączą się z
jednoniciowym DNA ze względu na komplementarność)
Zasada działania reakcji PCR
34
Krok 3 – Wyd
ł
użanie DNA (72
°
C )
Dodajemy pojedyncze nukleotydy i enzym (polimerazę
Taq
polymerase
)
Stosujemy polimerazę bakteryjną ponieważ
Temperatura reakcji jest wysoka a optymalna temperatura
dla ludzkiej polimerazy to oko
ł
o 37
°C
Zasada działania reakcji PCR
37
Elektroforeza w
ż
elu agarozowym
38
Elektroforeza w
ż
elu agarozowym